吳紅艷，楊寶茹，李秀鑫，仲偉健，代明朗

(齊齊哈爾大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

葉黃素是存在于蔬菜、水果、植物和花卉中的一種類(lèi)胡蘿卜素，在萬(wàn)壽菊花瓣中含量極為豐富[1]。葉黃素作為一種色彩艷麗且著色能力很強(qiáng)的天然黃色素，還具有保護(hù)視網(wǎng)膜、防止紫外線損傷皮膚、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力、預(yù)防癌癥等多種生理功能。同時(shí)，葉黃素?zé)o毒害、安全系數(shù)高，并且有良好的抗氧化活性，因此其具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[2-3]。我國(guó)早在食品安全標(biāo)準(zhǔn)GB 26405-2011中規(guī)定，允許葉黃素作為食品添加劑[4]。葉黃素在食品的色澤、風(fēng)味、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值等方面作出很大貢獻(xiàn)，可作為一種功能性的調(diào)味品。高純度的葉黃素在醫(yī)藥保健、食品、調(diào)味品、飼料添加劑、化妝品等領(lǐng)域具有較高的開(kāi)發(fā)價(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景[5-7]。

隨著現(xiàn)階段對(duì)葉黃素功能特性的不斷研究，葉黃素類(lèi)高端產(chǎn)品引起越來(lái)越多消費(fèi)者的關(guān)注，具有良好的市場(chǎng)前景，因此制備高純度的葉黃素成為研究的必然趨勢(shì)[8-12]。游離態(tài)葉黃素和葉黃素酯是葉黃素存在于萬(wàn)壽菊中的兩種形式[13]，在萬(wàn)壽菊中大多以葉黃素酯的形式存在，游離葉黃素含量很少，若要制備高純度的葉黃素可以對(duì)葉黃素酯進(jìn)行皂化[14]。本研究選用萬(wàn)壽菊顆粒為原料，采用微乳液提取法，得到葉黃素酯，對(duì)葉黃素酯進(jìn)行皂化，得到游離態(tài)的葉黃素粗產(chǎn)品，后續(xù)可采用柱層析結(jié)晶等方法進(jìn)一步純化[15]。本研究對(duì)皂化工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，為制備出高純度的食品級(jí)葉黃素奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

萬(wàn)壽菊顆粒：廣州立達(dá)爾生物科技股份有限公司；葉黃素標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥90%)：上海源葉生物科技有限公司。

1.2 試劑

氫氧化鉀(國(guó)產(chǎn)分析純)：沈陽(yáng)金泰爾化工有限公司；氫氧化鈉(國(guó)產(chǎn)分析純)：伊維特(遼寧)化工有限公司；無(wú)水乙醇(國(guó)產(chǎn)分析純)：天津市光復(fù)精細(xì)化工有限公司；甲醇、乙酸乙酯(均為色譜純)：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.3 主要儀器與設(shè)備

Sartorius普及型pH計(jì) 德國(guó)賽多利斯公司；722N型可見(jiàn)分光光度計(jì) 冠森生物科技(上海)有限公司；BSA124S-CW型分析天平 北京海天友誠(chéng)科技有限公司；SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水式多用真空泵 上海力辰儀器科技有限公司；DL-360E型智能超聲波清洗器 上海之信儀器有限公司；Z233 MK-2型離心機(jī) 德國(guó)HERMLE公司；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；SHA-C型恒溫水浴振蕩器 濟(jì)南歐萊博科學(xué)儀器有限公司；HPLC-1260型高效液相色譜儀 北京京科瑞達(dá)科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 葉黃素酯的制備

將萬(wàn)壽菊顆粒粉碎并過(guò)80目篩，將萬(wàn)壽菊粉與葵花籽油微乳液按1∶50的比例進(jìn)行均勻混合，加入1%的纖維素酶，混合均勻。將其置于45 ℃的恒溫水浴振蕩器中振蕩2.0 h，隨后用0.45 μm的濾膜抽濾處理，收集濾液，將濾液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，得到葉黃素酯。

1.4.2 皂化劑的選取

準(zhǔn)確稱(chēng)取10.0 g葉黃素酯，溶解于40 mL無(wú)水乙醇中，分別加入10 mL 0.1 g/mL不同的皂化劑。在50 ℃下進(jìn)行超聲處理，皂化50 min，然后進(jìn)行抽濾，取上清液，測(cè)量在447 nm處的吸光度值。

1.4.3 葉黃素皂化工藝的單因素試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱(chēng)取10.0 g葉黃素酯，溶解于40 mL無(wú)水乙醇中，量取10 mL于50 mL離心管中，以堿液濃度、皂化時(shí)間、皂化溫度為考察因素，按照表1方案設(shè)計(jì)進(jìn)行單因素試驗(yàn)，然后進(jìn)行抽濾，取上清液，在447 nm處測(cè)量吸光度值。

表1 單因素試驗(yàn)

1.4.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

采用3個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)，分別為A時(shí)間(min)、B溫度(℃)和C堿液濃度(g/mL)，建立響應(yīng)模型進(jìn)行優(yōu)化。響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平表

1.4.5 葉黃素含量的測(cè)定

準(zhǔn)確稱(chēng)取1 mg葉黃素，將其完全溶解在10 mL甲醇中并稀釋?zhuān)瞥?.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。C18反相色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為1 μL，流速為0.5 mL/min，流動(dòng)相為乙酸乙酯。

1.4.6 數(shù)據(jù)分析

每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)用Origin 8.0繪圖，用IBM SPSS Statistics 19.0軟件進(jìn)行顯著性分析，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 皂化劑的選擇

將葉黃素酯分別與不同皂化劑進(jìn)行皂化反應(yīng)，固定溫度為50 ℃，超聲皂化50 min，然后抽濾，測(cè)量所得濾液在波長(zhǎng)447 nm處的吸光度值，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 不同皂化劑對(duì)葉黃素酯皂化的影響

由圖1可知，以氫氧化鉀-乙醇溶液為皂化劑進(jìn)行反應(yīng)后得到的葉黃素的吸光度值最高，由于KOH比NaOH的堿性強(qiáng)，所以能夠更順利地進(jìn)行皂化工藝，故皂化后的葉黃素溶液的吸光度值較高，另外，堿的乙醇溶液均比其水溶液的吸光度值高，是因?yàn)橐掖寄軌蚴谷~黃素酯更好地溶解，使其得到了充分的分離，其與反應(yīng)物之間的接觸面積增加，從而導(dǎo)致反應(yīng)速率加快，皂化效果更明顯。因此，該試驗(yàn)使用氫氧化鉀-乙醇溶液作為皂化劑。

2.2 堿液濃度對(duì)葉黃素酯皂化的影響

將葉黃素酯在溫度為50 ℃、時(shí)間為50 min的條件下，以氫氧化鉀-乙醇溶液為皂化劑，分別用不同濃度的堿液進(jìn)行超聲皂化反應(yīng)，然后抽濾，測(cè)量所得濾液在波長(zhǎng)447 nm處的吸光度值，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 堿液濃度對(duì)葉黃素酯皂化的影響

由圖2可知，開(kāi)始階段吸光度值隨著堿液濃度的增加而增大，堿液濃度為0.15 g/mL時(shí)吸光度值最大，為6.087，說(shuō)明此時(shí)的皂化比較充分；堿液濃度高于0.15 g/mL時(shí)，葉黃素的穩(wěn)定性可能會(huì)受到高堿濃度和高pH值的影響，吸光度值下降[16]。另外，過(guò)量的氫氧化鉀不僅對(duì)葉黃素有不利影響，也會(huì)使溶液中的雜質(zhì)增加，對(duì)吸光度和試驗(yàn)效果都有一定的影響。因此，本試驗(yàn)選取0.15 g/mL為最佳皂化堿液濃度。

2.3 皂化時(shí)間對(duì)葉黃素酯皂化的影響

在氫氧化鉀-乙醇溶液濃度為0.15 g/mL、溫度為50 ℃的條件下，將葉黃素酯分別按不同時(shí)間進(jìn)行超聲皂化處理，然后抽濾，測(cè)量所得濾液在波長(zhǎng)447 nm處的吸光度值，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 時(shí)間對(duì)葉黃素酯皂化的影響

由圖3可知，開(kāi)始階段溶液的吸光度值隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，皂化時(shí)間為50 min時(shí)吸光度值最大，為6.437，此時(shí)的皂化效果較好。但是皂化時(shí)間超過(guò)50 min后，可能由于葉黃素的穩(wěn)定性差，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)而被氧化，因而吸光度值開(kāi)始逐漸下降[17]。因此，本試驗(yàn)選取最佳皂化時(shí)間為50 min。

2.4 皂化溫度對(duì)葉黃素酯皂化的影響

在氫氧化鉀-乙醇溶液濃度為0.15 g/mL、時(shí)間為50 min的條件下，在不同溫度條件下將葉黃素酯進(jìn)行超聲皂化，然后抽濾，在447 nm處測(cè)量濾液的吸光度值，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 溫度對(duì)葉黃素酯皂化的影響

由圖4可知，開(kāi)始階段溶液的吸光度值隨著皂化溫度的升高而增大，皂化溫度為50 ℃時(shí)吸光度值最大，為5.887，此時(shí)的皂化效果較好。皂化溫度高于50 ℃時(shí)，溫度過(guò)高可能會(huì)對(duì)葉黃素的穩(wěn)定性造成一定影響，導(dǎo)致吸光度值下降[18]，溫度過(guò)高影響皂化反應(yīng)的順利進(jìn)行，從而對(duì)吸光度值也造成一定的影響。因此，本試驗(yàn)選取最佳皂化溫度為50 ℃。

2.5 響應(yīng)面分析

2.5.1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果分析

基于單因素試驗(yàn)3個(gè)變量因素：A時(shí)間(min)、B溫度(℃)、C堿液濃度(g/mL)，利用響應(yīng)面分析優(yōu)化皂化條件，得出最佳的皂化條件。設(shè)計(jì)了17組試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面分析(見(jiàn)表3)，回歸模型系數(shù)的檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表4 回歸模型系數(shù)的檢驗(yàn)結(jié)果

2.5.2 模型建立及分析評(píng)價(jià)

對(duì)表4中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二項(xiàng)式回歸擬合，吸光度值(Y)對(duì)時(shí)間(A)、溫度(B)和堿液濃度(C)的二次多項(xiàng)式回歸方程為：

Y=6.01+0.032A+3.625E-003B+0.027C+1.000E-0003AB+0.033AC-2.500E-0.004BC-0.030A2-0.0854B2-0.058C2。

F檢驗(yàn)表示回歸方程中每個(gè)變量對(duì)響應(yīng)值的影響顯著性。概率“Pr>F”的值越小，相應(yīng)變量越顯著。由表4可知，模型的“Pr>F”概率為0.0031<0.01，說(shuō)明模型對(duì)響應(yīng)值Y的影響極顯著；該模型的單因素中，A(時(shí)間)、C(堿液濃度)對(duì)響應(yīng)值Y的影響顯著，B(溫度)對(duì)響應(yīng)值Y的影響不顯著；在交互作用中，對(duì)響應(yīng)值Y的影響均不顯著；在模型的二次項(xiàng)中，B2、C2對(duì)響應(yīng)值Y的影響極顯著，A2對(duì)響應(yīng)值Y的影響不顯著。各因素對(duì)葉黃素提取率的影響大小依次為時(shí)間>堿液濃度>溫度。模型失擬項(xiàng)的“Pr> F”為0.2177，影響不顯著，可以應(yīng)用于模型分析和預(yù)測(cè)葉黃素酯皂化工藝研究。

由表4可知，預(yù)測(cè)系數(shù)為0.8266，且校正系數(shù)為0.8351，預(yù)測(cè)系數(shù)的擬合度高。決定系數(shù)為0.9279，可以用于模型分析。該測(cè)試模型的信噪比為8.244>4，因此該模型可用于實(shí)際試驗(yàn)分析。

2.5.3 各因素的響應(yīng)面圖譜

在回歸模型方差分析的基礎(chǔ)上，使用響應(yīng)曲面圖對(duì)回歸模型進(jìn)行分析，以進(jìn)一步檢驗(yàn)相關(guān)因素之間的相互作用及其最大優(yōu)勢(shì)，見(jiàn)圖5～圖7。

圖5 因素A和因素B相互作用的等高線圖和響應(yīng)面圖

圖6 因素A和因素C相互作用的等高線圖和響應(yīng)面圖

圖7 因素B和因素C相互作用的等高線圖和響應(yīng)面圖

由圖5～圖7可知，響應(yīng)值Y與每個(gè)因素都具有拋物線關(guān)系，并且隨著各因素值的變化，響應(yīng)值Y也發(fā)生變化，先增大到最大值然后減小。因此，葉黃素酯皂化時(shí)，只有在一定的條件下，吸光度值才會(huì)達(dá)到最高。

根據(jù)Design Expert軟件的優(yōu)化得到最佳條件為時(shí)間57 min、溫度50 ℃、堿液濃度0.17 g/mL。在此條件下吸光度理論值為6.029，將數(shù)據(jù)代入SAS軟件進(jìn)行分析來(lái)驗(yàn)證優(yōu)化的結(jié)果。經(jīng)過(guò)分析后，與獲得的最佳條件結(jié)果一致。

2.6 葉黃素標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線

配制等梯度濃度的葉黃素乙醇標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行高效液相分析試驗(yàn)，求出峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，以葉黃素濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖8。

圖8 葉黃素標(biāo)準(zhǔn)品-乙醇HPLC圖的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.7 驗(yàn)證試驗(yàn)

采用Design Expert軟件優(yōu)化的最佳提取條件皂化葉黃素酯，即在50 ℃和堿液濃度為0.17 g/mL的條件下皂化57 min，平行3次取其平均值。結(jié)果表明，在最佳萃取條件下的實(shí)際吸光度為6.027，純度可達(dá)到48.21%，與預(yù)測(cè)的理論值相似，表明該模型可以實(shí)際反映并篩選出最佳條件。

3 結(jié)論

本研究主要對(duì)萬(wàn)壽菊顆粒中的葉黃素酯進(jìn)行皂化。研究結(jié)論：采用4種不同皂化劑對(duì)葉黃素酯進(jìn)行皂化試驗(yàn)，結(jié)果表明氫氧化鉀-乙醇溶液對(duì)葉黃素酯皂化的效果比較好，得出其最佳的皂化條件為時(shí)間50 min、溫度50 ℃、堿液濃度0.15 g/mL。響應(yīng)面數(shù)據(jù)分析表明，時(shí)間和堿液濃度對(duì)吸光度值的影響極顯著，而溫度不顯著。優(yōu)化后的最佳皂化條件：時(shí)間為57 min，溫度為50 ℃，堿液濃度為0.17 g/mL。在此條件下測(cè)得吸光度理論值為6.029，葉黃素純度可達(dá)48.21%。葉黃素可以改善食品的風(fēng)味和色澤，并且具有良好的生理功效，被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)療、飼料添加劑及保健品行業(yè)中，具有較高的商業(yè)價(jià)值。因此，本研究對(duì)萬(wàn)壽菊中葉黃素的皂化工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化，為葉黃素的純化試驗(yàn)提供了可靠的科學(xué)基礎(chǔ)，提高了葉黃素純化的前期制備效率，為獲取高純度的食品級(jí)葉黃素提供了簡(jiǎn)單高效的技術(shù)工藝。