基于上轉換適配體熒光納米材料特異性檢測磺胺二甲氧嘧啶的方法研究

范丹陽, 張學成, 高 俊, 王家斌, 呂海霞*

1. 福州大學材料科學與工程學院，福建 福州 350108 2. 福州大學生物科學與工程學院，福建 福州 350108

引 言

磺胺二甲氧嘧啶(SDM)是一種常見的抗菌感染藥物，在世界各地廣泛用于預防或治療家禽疾病。由于過度使用，其在環(huán)境中的殘留可能會對人體造成危害。較為常用的檢測磺胺二甲氧嘧啶的方法有高效液相色譜(HPLC)[1]、 高效毛細管電泳(CE)[2]和液相色譜-電噴霧電離-串聯(lián)質譜(LC-ESI-MS)[3]等，雖然現(xiàn)有方法具有一定的可靠性與準確性，但大多具有儀器較昂貴、 難操作、 耗時久或樣品預處理繁瑣等缺點，限制了在SDM檢測上的應用，因此有必要開發(fā)新的檢測方法克服現(xiàn)有檢測技術上的不足。

近年來，熒光探針由于其低檢測限、 檢測速度快、 不依賴復雜儀器而在檢測領域受到廣泛應用。Chen[4]等采用一種基于適配體與量子點用于檢測SDM的熒光傳感器，通過靜電作用，使適配體(Aptamer)和聚二烯丙基二甲基氯化銨(PDDA)形成雙鏈，阻礙了PDDA對量子點熒光的猝滅，但適配體與SDM的特異性結合可能導致游離的PDDA釋放，導致熒光被淬滅，從而實現(xiàn)對水樣和魚類樣品中殘留SDM的快速檢測。然而現(xiàn)有用于檢測SDM的方法大部分使用有機染料或量子點，通常具有光化學穩(wěn)定性差和光漂白等缺點，且在紫外可見光激發(fā)下還會受到生物樣品基質的背景干擾，限制了其在復雜樣品基質中的使用。與傳統(tǒng)的熒光團相比，上轉換納米粒子(UCNPs)具有獨特的優(yōu)勢，例如高的生物穿透性、 窄的發(fā)射峰、 大的斯托克位移[5]等優(yōu)點，因此具有用作熒光探針的巨大潛力，進而被廣泛用于各種物質的檢測，例如毒素[6]、 細菌[7]、 農(nóng)藥[8]及抗生素[9]等，但目前有關于UCNPs用于SDM檢測的研究僅見Liu等[10]利用沉積在適配體功能化后的磁性納米粒子的表面上的UCNPs與SDM間的親和性及磁性納米粒子易于分離的優(yōu)點，構建了一種對SDM的特異性且高靈敏度復合熒光探針，但該復合探針的制備及檢測過程較為繁瑣，因此開發(fā)出簡便易于操作用于檢測SDM的上轉換納米材料探針仍是一項挑戰(zhàn)。

針對現(xiàn)有檢測 SDM 的技術問題，合成了氯化鐿、 氯化釔、 氯化鉺作為稀土原料，油酸(OA)作為配體的上轉換納米粒子(OA-UCNPs)，對其進行表面羧基功能化后得到親水性上轉換納米粒子 PAA-UCNPs，再將其進行適配體功能化得到偶聯(lián)適配體的上轉換納米粒子(Apt-UCNPs)，構建了基于Apt-UCNPs的檢測體系，并針對共振能量轉移效應(FRET)與堿基互補配對原則對檢測機理進行了探討，驗證了檢測方法的可行性；該檢測體系克服了傳統(tǒng)方法的不足，具有操作簡便、 耗時少且不依賴昂貴儀器的優(yōu)點，并對于磺胺二甲氧嘧啶的檢測具有特異性，實現(xiàn)了對SDM的特異性檢測，為磺胺二甲氧嘧啶的檢測提供了簡便且有效的方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

FluoroMax-4型熒光光譜儀(法國HORIBA Jobin Yvon公司)；2450型紫外-分光光度計(日本島津公司)；Nicolet 5700型傅里葉紅外光譜儀(美國熱電公司)；SUPRA 55型場發(fā)射掃描電子顯微鏡(德國卡爾蔡司有限公司)。

氫氧化鈉(NaOH)、 無水乙醇(C2H5OH)、 環(huán)己烷(C6H12)、 六水氯化釔(YCl3·6H2O)、 六水氯化鐿(YbCl3·6H2O)、 六水氯化鉺(ErCl3·6H2O)、 油酸(OA)、 1-十八烯(ODE)、 甲醇(CH3OH)、 氟化銨(NH4F)、 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、 N-羥基硫代琥珀酰亞胺鈉鹽(sulfo-NHS)、 二甲基亞砜(DMSO)均購于阿拉丁化學試劑有限公司；氬氣(Ar2)購于福州華鑫達氣體有限公司；聚丙烯酸(PAA)、 一縮二乙二醇(DEG)、 甲苯(C7H8)、 氯化鈉(NaCl)、 氯化鉀(KCl)、 氯化鎂(MgCl2)均購于國藥集團化學試劑有限公司；SDM適配體(序列：NH2-GAG GGC AAC GAG TGT TTA TAG A-3)、 黑洞猝滅劑cDNA-BHQ1(序列：5′-CGT TGC CCT C-BHQ1)均購于上海生工生物工程股份有限公司，無特殊說明，試劑純度為分析純。

實驗所用水為超純水，所用緩沖液配制：20 mmol·L-1Tris-HCl，50 mmol·L-1NaCl，5 mmol·L-1KCl，5 mmol·L-1MgCl2，pH 8.0。

1.2 聚丙烯酸改性的上轉換納米粒子(PAA-UCNPs)的合成

根據(jù)文獻[11]合成了PAA-UCNPs，并做了少量修改：將0.78 mmol的YCl3·6H2O、 0.2 mmol的YbCl3·6H2O和0.02 mmol的ErCl3·6H2O加入至100 mL三口燒瓶中，再加入21 mL的OA/ODE為6∶15的溶液，通入氬氣后在磁力攪拌下緩慢升溫至110 ℃除水10 min，然后加熱至160 ℃保溫30 min，直到稀土氯化鹽完全溶解。冷卻后加入10 mL溶有4 mmol NH4F和2.5 mmol NaOH的甲醇，于50 ℃保溫30 min，再升溫至80 ℃除去甲醇溶液，然后將混合溶液快速加熱到300 ℃下保溫1.5 h。加入乙醇沉降后，離心收集得到OA-UCNPs納米粒子。

在100 mL三口瓶中加入200 mg的PAA，再倒入30 mL的DEG，將混合物加熱至110 ℃，形成澄清溶液。緩慢加入分散有50 mg 的OA-UCNPs納米晶體的2 mL甲苯溶液，并在氬氣保護下將溫度升高至130 ℃保持10 min除去甲苯，然后將溶液升高至一定溫度回流保溫一段時間。反應完后將所得溶液冷卻至室溫，并加入0.2 mol·L-1的NaCl溶液以使粒子沉淀。最后將粒子離心出來，得到PAA-UCNPs。

1.3 Apt-UCNPs的合成

將200 μL EDC(0.2 mol·L-1)和400 μL sulfo-NHS(0.2 mol·L-1)添加到2.5 mL含有4 mg PAA-UCNPs的DMSO中。將10 μL 100 μmol·L-1的適配體加到該分散液中，并在室溫下攪拌18 h。將分散液離心并用DMSO洗滌兩次以去除未結合的適配體，然后分散在4 mL的Tris緩沖液中。

1.4 cDNA-BHQ1對Apt-UCNPs的熒光猝滅

分別向濃度為0.5 mg·mL-1的Apt-UCNPs溶液中加入不同濃度的cDNA-BHQ1(2.5，5，7.5，10，15 μmol·L-1)，于30 ℃下孵育過夜，然后在980 nm激發(fā)光下測試其熒光強度。

1.5 UCNPs-BHQ1檢測體系用于檢測SDM

分別向分散在Tris緩沖液中的Apt-UCNPs加入不同濃度的SDM(150，300，600，1000 ng·mL-1)，于30 ℃孵育3 h，然后分別加入cDNA-BHQ1，繼續(xù)孵育3 h，并在980 nm激發(fā)光下測試其熒光強度。為了考察Apt-UCNPs對SDM的特異性識別作用，在不改變其他實驗條件的情況下，將SDM替換成磺胺醋酰和磺胺吡啶，并在980 nm激發(fā)光下測試其熒光強度。

2 結果與討論

2.1 UCNPs的表征

2.1.1 UCNPs與PAA-UCNPs的表征

圖1 PAA，OA-UCNPs和PAA-UCNPs的紅外光譜圖a: PAA; b: OA-UCNPs；c: PAA-UCNPsFig.1 FTIR spectra of PAA，OA-UCNPs and PAA-UCNPsa: PAA; b: OA-UCNPs；c: PAA-UCNPs

對OA-UCNPs[圖2(a)]和PAA-UCNPs[圖2(b)]進行了掃描電鏡測試。從圖中可以看出，PAA修飾前分散在環(huán)己烷中的OA-UCNPs尺寸約為31 nm，而PAA修飾后分散在水溶液中的UCNPs直徑約為49 nm。這可能是由于長鏈的PAA分子體積比油酸分子大，因此包覆在UCNPs表面會使其尺寸增加，PAA的修飾使得UCNPs具有較好的水分散性，良好的水分散性及經(jīng)過PAA改性后UCNPs表面帶有的基團為后續(xù)的應用提供了條件。

圖2 OA-UCNPs (a)和PAA-UCNPs (b)的掃描電鏡圖Fig.2 SEM images of OA-UCNPs (a) and PAA-UCNPs (b)

2.1.2 Apt-UCNPs的表征

為了驗證適配體已經(jīng)結合至PAA-UCNPs表面，分別測試了PAA-UCNPs、 Apt-UCNPs和Aptamer在220～400 nm范圍內的紫外吸收光譜，結果如圖3所示。從圖3可以看出，Aptamer在260 nm附近有一個吸收峰，為適配體的特征吸收。而PAA-UCNPs的曲線在該范圍內無明顯吸收峰，與適配體反應后所得的Apt-UCNPs于260 nm處也出現(xiàn)了較明顯的吸收峰，這個峰可以歸屬于適配體的特征吸收，證明了SDM適配體已偶聯(lián)到UCNPs上。

2.2 檢測機理研究及猝滅條件的優(yōu)化

Apt-UCNPs用于檢測SDM的機理如圖4所示。上轉換納米粒子用作產(chǎn)生信號的能量供體，BHQ1用作接收信號的能量受體，適配體用作識別劑。在沒有SDM的情況下，Apt-UCNPs表面的適配體鏈和帶有猝滅熒光基團的互補DNA(cDNA)由于堿基互補配對原則互相結合，使BHQ1與Apt-UCNPs的距離很近[13]，從而進行熒光猝滅，而當環(huán)境中存在SDM時，適配體優(yōu)先與其結合，導致cDNA-BHQ1遠離Apt-UCNPs，使得Apt-UCNPs的熒光恢復。根據(jù)Apt-UCNPs熒光的恢復程度可以用于定量檢測SDM的濃度。

圖3 Aptamer，PAA-UCNPs和Apt-UCNPs的紫外吸收光譜圖Fig.3 UV-Vis absorption spectra of Aptamer, PAA-UCNPs and Apt-UCNPs

圖4 Apt-UCNPs用于檢測SDM的機理圖Fig.4 Schematic diagram of Apt-UCNPs used to detect SDM

為了證實檢測方案的可行性，考察了SDM的檢測機理，由圖5可知Apt-UCNPs在540 nm處有明顯發(fā)射峰，使其在980 nm激發(fā)光下肉眼可見明顯綠光，并且發(fā)射峰與BHQ1的吸收峰重疊，這表示Apt-UCNPs上的能量通過共振能量轉移效應轉移到BHQ1上是具有可行性的[14]，而Apt-UCNPs位于660 nm處的發(fā)射峰與BHQ1的吸收峰幾乎沒有重疊，所以BHQ1對660 nm處的熒光發(fā)射影響很小。

為使檢測條件達到最優(yōu)，優(yōu)化了檢測體系中猝滅劑的濃度。在相同濃度的Apt-UCNPs中加入不同濃度cDNA-BHQ1，孵育一段時間后，使用980 nm的激發(fā)光分別檢測其熒光強度，并考察cDNA-BHQ1濃度對Apt-UCNPs熒光猝滅的影響。如圖6(a)可知，隨著cDNA-BHQ1濃度的增大，Apt-UCNPs位于540 nm處的發(fā)射峰強度不斷減小，而660 nm處的峰變化不大；反之，Apt-UCNPs的熒光猝滅效率隨著cDNA-BHQ1濃度的增加而增加[圖6(b)]。當cDNA-BHQ1濃度達到15 μmol·L-1時，熒光強度猝滅達55%，此時猝滅效率的趨勢已經(jīng)逐漸平緩，這可能是由于UCNPs表面的適配體已基本與cDNA-BHQ1結合，因此繼續(xù)增加cDNA-BHQ1的量對其熒光強度的猝滅效果減小。綜合上述原因，選用濃度為15 μmol·L-1的cDNA-BHQ1進行后續(xù)的實驗。

圖5 Apt-UCNPs的熒光光譜和cDNA-BHQ1的吸收光譜Fig.5 Fluorescence spectra of Apt-UCNPs andabsorption spectra of cDNA-BHQ1

圖6 不同cDNA-BHQ1濃度下的Apt-UCNPs的 (a)熒光光譜和(b)猝滅效率

2.3 對SDM檢測的應用

2.3.1 檢測體系用于SDM的識別

考察了傳感器檢測SDM的靈敏度，其結果如圖7(a)所示，在一定的濃度范圍內(150～1 000 ng·mL-1)，SDM的濃度與Apt-UCNPs位于540 nm處發(fā)射峰的強度為正相關。根據(jù)540 nm處Apt-UCNPs熒光強度的恢復程度，得到相對熒光強度(F-F0)/F0與SDM濃度的線性關系，其結果如圖7(b)所示，其中F0和F分別代表不存在和存在SDM情況下Apt-UCNPs的熒光強度。從圖中可以看出，SDM的濃度與相對熒光強度在150～1 000 ng·mL-1范圍內具有較好的線性關系，線性相關系數(shù)擬合結果為R2=0.917 28。

圖7 不同濃度SDM下Apt-UCNPs的(a)熒光光譜 和(b)標準曲線

2.3.2 特異性分析

選取了與SDM結構相似的磺胺吡啶和磺胺醋酰作為對照實驗測試Apt-UCNPs的特異性識別功能，結果如圖8所示，盡管磺胺吡啶和磺胺醋酰的濃度達到了500 ng·mL-1，體系中的熒光強度恢復仍然較少，分析認為SDM適配體對SDM的高度親和力，能阻止Apt-UCNPs與cDNA-BHQ1之間FRET的發(fā)生，而對其他結構類似物，適配體的親和力相對較低，因此熒光強度變化較小，證明了Apt-UCNPs傳感器對SDM具有較高的特異性識別作用。

圖8 存在不同物質時Apt-UCNPs的熒光光譜Fig.8 Fluorescence spectra of Apt-UCNPs in thepresence of different substances

3 結 論

以適配體功能化上轉換納米粒子(Apt-UCNPs)作為能量供體，以黑洞猝滅劑(BHQ1)作為能量受體，構建了一種基于熒光共振能量轉移的特異性檢測磺胺二甲氧嘧啶(SDM)的方法。通過FTIR，和SEM對PAA-UCNPs和Apt-UCNPs的結構和性能進行了表征；使用紫外分光光度計對PAA-UCNPs，Apt-UCNPs和Aptamer進行了表征。對猝滅劑BHQ1的濃度進行了優(yōu)化，結果表明當BHQ1濃度為15 μmol·L-1時，熒光猝滅效率為55%且基本達到平衡，且當SDM 濃度為150～1 000 ng·mL-1時，Apt-UCNPs于540 nm處發(fā)射峰的相對熒光強度與SDM濃度線性相關(R2=0.917 28)。為了考察Apt-UCNPs對SDM特異性識別作用，選取與SDM結構相似的磺胺吡啶和磺胺醋酰作為研究對象做對照實驗。結果發(fā)現(xiàn)，當磺胺吡啶和磺胺醋酰的濃度為500 ng·mL-1時，體系中的熒光強度仍恢復較少，而當濃度為300 ng·mL-1SDM加入到體系中時，Apt-UCNPs的熒光信號增強更多，說明Apt-UCNPs檢測體系對SDM具有較好的特異性識別作用。