細(xì)菌耐藥性及耐藥基因檢測(cè)技術(shù)和方法的研究進(jìn)展

姜桂來(lái)， 郁舒陽(yáng)， 俞莞茜， 周宇軒， 周哲敏， 李 恒

抗生素的過(guò)度使用加速了細(xì)菌耐藥性的發(fā)展。2017年世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)發(fā)布對(duì)人類(lèi)健康最具威脅的12種“超級(jí)細(xì)菌”，表明細(xì)菌抗生素耐藥性已成為全球公共衛(wèi)生問(wèn)題[1]。2022年Lancet發(fā)布的最新研究指出，2019年全球有127萬(wàn)例患者死亡和抗生素耐藥直接相關(guān)；約495萬(wàn)例因耐藥菌感染病逝[2]。細(xì)菌耐藥性的出現(xiàn)和蔓延，是當(dāng)今人類(lèi)社會(huì)三大死亡原因之一[3]。因此，對(duì)于細(xì)菌耐藥性的監(jiān)測(cè)刻不容緩。最近研究表明，在中國(guó)爆發(fā)的多重耐藥細(xì)菌中，以沙門(mén)菌為代表的腸桿菌廣泛攜帶blaOXA-1、blaTEM-1和β-內(nèi)酰胺酶等細(xì)菌耐藥性基因[4]。此外，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、產(chǎn)生超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌以及鮑曼不動(dòng)桿菌的多重耐藥性也是社區(qū)和醫(yī)院獲得性感染的最重要原因之一[5-8]。根據(jù)我國(guó)2014至2019年及2022上半年的細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)報(bào)告(www.chinets.com)顯示，耐藥性大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和鮑曼不動(dòng)桿菌為我國(guó)臨床主要耐藥菌[9]。其中耐甲氧西林金黃色葡萄球菌檢出率雖有下降趨勢(shì)，但仍然在30%或以上；碳青霉烯類(lèi)耐藥革蘭陰性菌的檢出率仍保持高位，監(jiān)測(cè)顯示第三代頭孢菌素耐藥腸桿菌目細(xì)菌已流行傳播。多重耐藥細(xì)菌的出現(xiàn)和快速擴(kuò)散正在將人類(lèi)逐步推向“后抗生素時(shí)代”。鑒于此，細(xì)菌的耐藥性檢測(cè)、新型細(xì)菌耐藥性檢測(cè)技術(shù)的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用迫在眉睫。臨床上多重耐藥細(xì)菌的檢測(cè)中，抗生素敏感性試驗(yàn)(antimicrobial susceptibility testing，AST)是目前較常使用的方法，包括紙片擴(kuò)散法、瓊脂稀釋法、肉湯稀釋法、濃度梯度法等經(jīng)典方法。隨后出現(xiàn)了物理、化學(xué)和分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)，如應(yīng)用流式細(xì)胞儀、質(zhì)譜儀和拉曼光譜儀等方法推算細(xì)菌的耐藥性；以及免疫雜交技術(shù)、核酸雜交技術(shù)、核酸擴(kuò)增技術(shù)等檢測(cè)細(xì)菌的耐藥基因。如今，隨著測(cè)序技術(shù)的迭代更新和生物信息學(xué)的發(fā)展，高通量測(cè)序技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于細(xì)菌耐藥檢測(cè)領(lǐng)域，包括全基因組測(cè)序(whole genome sequencing,WGS)、宏基因組測(cè)序(metagenomics sequencing,mNGS)和微生物單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(microbial-single-cell RNA sequencing,MscRNA-seq)等技術(shù)。基于上述檢測(cè)技術(shù)和方法，本文闡述了各類(lèi)細(xì)菌耐藥性及耐藥基因檢測(cè)的原理、優(yōu)點(diǎn)和局限性，并對(duì)經(jīng)典技術(shù)和新技術(shù)的關(guān)聯(lián)性及應(yīng)用場(chǎng)景進(jìn)行分析，為我國(guó)細(xì)菌耐藥性的預(yù)防和監(jiān)測(cè)提供相關(guān)技術(shù)支持。

1 基于經(jīng)典方法的細(xì)菌耐藥性檢測(cè)

臨床對(duì)于細(xì)菌AST多采用表型檢測(cè)的方法，按照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)或者歐洲藥敏試驗(yàn)聯(lián)合委員會(huì)(European Committee on Antibiotic Susceptibility Testing,EUCAST)頒布的《抗菌藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)》執(zhí)行。國(guó)內(nèi)外臨床和實(shí)驗(yàn)室常使用的AST包括紙片擴(kuò)散法、瓊脂稀釋法、肉湯稀釋法、濃度梯度法等經(jīng)典方法。此類(lèi)經(jīng)典方法檢測(cè)時(shí)間在18～24 h，常用于臨床耐藥菌株的表型篩查。其優(yōu)點(diǎn)在于便捷、靈敏、可重復(fù)、成本低。但此類(lèi)方法僅限于細(xì)菌耐藥性的表型檢測(cè)，無(wú)法檢測(cè)耐藥基因。

1.1肉湯稀釋法 肉湯稀釋法是細(xì)菌耐藥性檢測(cè)的傳統(tǒng)方法。肉湯稀釋法一般包括肉湯微量稀釋法和肉湯宏量稀釋法，前者96孔微量板中抗菌藥物稀釋液體積通常是每孔0.1 ml，后者每個(gè)含不同濃度抗菌藥物的測(cè)試管中肉湯體積為≥1 ml(通常為2 ml)。微量肉湯稀釋法是目前已視為藥敏試驗(yàn)的國(guó)際參考方法(CLSI)，其主要優(yōu)點(diǎn)在于抗菌藥物敏感性試驗(yàn)的全球標(biāo)準(zhǔn)化，接種和判讀的過(guò)程簡(jiǎn)單，且可同時(shí)對(duì)單株菌株進(jìn)行多種抗菌藥物的測(cè)試。但其缺點(diǎn)在于最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration,MIC)值的誤差較大，存在一定的技術(shù)可變性，對(duì)操作者實(shí)驗(yàn)技能和無(wú)菌意識(shí)要求較高。而肉湯宏量稀釋法是一種易于標(biāo)準(zhǔn)化、可靠的標(biāo)準(zhǔn)參考方法，對(duì)以研究為目的或測(cè)試一種藥物對(duì)一株細(xì)菌的MIC值的判讀具有較大的價(jià)值和意義。

1.2瓊脂稀釋法 標(biāo)準(zhǔn)化的瓊脂稀釋法是將一種抗菌藥物與瓊脂培養(yǎng)基混合，每塊平板中含有不同濃度的藥物，再將接種物單獨(dú)或者同時(shí)點(diǎn)種在瓊脂表面，培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)菌落形成單位(colony forming unit，CFU)。此外還可以接種到顯色瓊脂培養(yǎng)基，針對(duì)敏感菌株在18～24 h內(nèi)出現(xiàn)的顏色反應(yīng)，更快地檢測(cè)和篩查相關(guān)耐藥細(xì)菌。此類(lèi)方法適用于多細(xì)菌的培養(yǎng)物，可用來(lái)區(qū)分菌株和物種[10]。瓊脂稀釋法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單、成本低，其測(cè)定的MIC值穩(wěn)定、可靠。

1.3紙片擴(kuò)散法 紙片擴(kuò)散法也稱(chēng)為Kirby-Bauer(K-B)抗生素試驗(yàn)。藥敏片中的抗生素在瓊脂中呈放射狀擴(kuò)散，藥物濃度隨離培養(yǎng)基距離的增加呈對(duì)數(shù)下降，并在培養(yǎng)基周?chē)纬蓤A形生長(zhǎng)抑制區(qū)，其直徑與MIC呈反比。區(qū)域的直徑顯示了分離物的敏感性和藥物通過(guò)瓊脂培養(yǎng)基的擴(kuò)散速率[11]。這種方法只能定性檢測(cè)細(xì)菌對(duì)抗生素的敏感性，無(wú)法得到MIC值。但是該方法簡(jiǎn)便、可重復(fù)，無(wú)需昂貴的設(shè)備支持。

1.4濃度梯度法 Epsilometer testing即E-test，是檢測(cè)細(xì)菌對(duì)于某種抗生素的耐藥性的濃度梯度方法。E-test法使用一面是固定有一系列預(yù)先制備的、濃度呈連續(xù)指數(shù)增長(zhǎng)稀釋的抗菌藥物；另一面是有濃度刻度的MIC值的塑料條。將條帶放置在預(yù)先接種的瓊脂平板上，過(guò)夜培養(yǎng)，即可出現(xiàn)橢圓形抑制區(qū)，其抑制區(qū)與條帶邊緣之間的交點(diǎn)就是MIC。由于E-test條帶上的抗生素濃度梯度穩(wěn)定，所以該方法簡(jiǎn)單、靈敏、準(zhǔn)確，可以讀取具體的MIC值，但此方法較上述傳統(tǒng)方法使用較少[12]。

2 基于理化性質(zhì)及分子生物學(xué)技術(shù)的細(xì)菌耐藥性及耐藥基因檢測(cè)

隨著物理、化學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，出現(xiàn)了各類(lèi)新型細(xì)菌耐藥性檢測(cè)技術(shù)，如流式細(xì)胞儀、質(zhì)譜儀和拉曼光譜儀等技術(shù)手段檢測(cè)細(xì)菌的耐藥性；或應(yīng)用免疫雜交技術(shù)、核酸雜交技術(shù)、核酸擴(kuò)增技術(shù)等檢測(cè)細(xì)菌的耐藥基因。此類(lèi)基于細(xì)菌理化性質(zhì)和分子生物學(xué)技術(shù)的檢測(cè)方法，檢測(cè)時(shí)間在2～10 h，其省時(shí)快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高的特點(diǎn)，適用于病原體臨床現(xiàn)場(chǎng)快速診斷。但相較于傳統(tǒng)方法，無(wú)法提供MIC值。部分技術(shù)如拉曼光譜尚未在臨床環(huán)境中得到充分探索，基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用存在一定差距。

2.1基于培養(yǎng)的微流控圖像檢測(cè)技術(shù) 微流控技術(shù)是一種以在微米尺度空間對(duì)流體進(jìn)行樣品處理、反應(yīng)、檢測(cè)等復(fù)雜操作為主要特征的科學(xué)技術(shù)。在微流控檢測(cè)方面，Choi等[13]研究人員用瓊脂糖構(gòu)建了一個(gè)微流體瓊脂糖通道，通過(guò)顯微鏡觀(guān)察和追蹤通道內(nèi)單細(xì)菌在抗生素作用下的生長(zhǎng)情況和表型，經(jīng)圖像對(duì)比確定細(xì)菌耐藥性和MIC值。微流控圖像檢測(cè)技術(shù)在單細(xì)胞水平上將細(xì)菌限制在很小的體積中，可以最大限度地減少交叉污染，潛在地加速生化反應(yīng)并使分離條件下標(biāo)志物的濃度迅速增加。該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于所需樣本量少、靈敏度高，并提供自動(dòng)化和高通量分析[14]。

2.2基于飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)的檢測(cè)方法 基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)是當(dāng)下物種鑒定較流行的方法。而MALDI Biotyper(MBT)是一種基于MALDI-TOF MS的微生物快速鑒定系統(tǒng)，可在幾分鐘內(nèi)對(duì)微生物進(jìn)行無(wú)偏鑒定。MBT耐藥性檢測(cè)包括抗菌藥物耐藥性的選擇性檢測(cè)(MBT-STAR)、β-內(nèi)酰胺酶試驗(yàn)(MBT-STAR-BL)、抗菌藥物敏感性快速檢測(cè)(MBT-ASTRA)和耐藥性檢測(cè)(MBT-RESIST)等方法。其中，MBT-STAR-BL原理是通過(guò)檢測(cè)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素被產(chǎn)酶菌株水解而引起的分子量變化從而確定菌株耐藥情況。配備MBT-STAR-BL模塊的MBT系統(tǒng)能夠同時(shí)快速鑒定細(xì)菌種類(lèi)以及血液培養(yǎng)菌株的β-內(nèi)酰胺酶介導(dǎo)的耐藥性[15]；而MBT-ASTRA通過(guò)計(jì)算和生長(zhǎng)在含有抗生素或不含抗生素的細(xì)菌光譜曲線(xiàn)下面積(area under the curve，AUC)并比較AUC大小以評(píng)估細(xì)菌生長(zhǎng)，可在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)檢測(cè)到敏感菌株和耐藥菌株之間的差異。最近一項(xiàng)研究?jī)?yōu)化了MBT-ASTRA，已成功應(yīng)用于白念珠菌和光滑念珠菌等酵母菌的敏感性檢測(cè)[16]。MBT-RESIST基于非放射性同位素標(biāo)記介質(zhì)，使細(xì)菌在含有12C或者13C碳組分的培養(yǎng)基中平行生長(zhǎng)，并將含抗生素同位素標(biāo)記的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的細(xì)菌與在無(wú)抗生素標(biāo)記的培養(yǎng)液中生長(zhǎng)的細(xì)菌質(zhì)譜結(jié)果進(jìn)行比較。耐藥細(xì)菌可以在含有13C的抗生素中生長(zhǎng)，導(dǎo)致質(zhì)譜中峰向更高的m/z移動(dòng)，進(jìn)而通過(guò)峰位的移動(dòng)來(lái)判定耐藥性。Sparbier等[17-18]通過(guò)13C標(biāo)記的賴(lài)氨酸培養(yǎng)基來(lái)測(cè)試金黃色葡萄球菌對(duì)苯唑西林和頭孢西丁的耐藥性。MBT-RESIST和MBT-ASTRA理論上應(yīng)用于所有種類(lèi)的抗生素和微生物，但仍存在微生物培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)、需要摸索抗生素使用條件等缺點(diǎn)，需要進(jìn)一步優(yōu)化。

2.3其他光譜學(xué)圖像檢測(cè)法 其他光譜學(xué)檢測(cè)方法包括了表面等離子體共振(surface plasmon resonance，SPR)、拉曼光譜等物理化學(xué)技術(shù)方法。其中拉曼光譜通過(guò)特定的光譜模式識(shí)別，可以快速、高效地識(shí)別細(xì)菌細(xì)胞和抗生素耐藥性。但通常臨床樣品中細(xì)菌濃度低，所以對(duì)臨床細(xì)菌病原體進(jìn)行拉曼光譜的研究需要在瓊脂平板中培養(yǎng)[19]。相反的，表面增強(qiáng)拉曼光譜(surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS)可以促進(jìn)細(xì)菌病原體的無(wú)培養(yǎng)鑒定。最近一項(xiàng)研究中將SERS作為一種無(wú)創(chuàng)且無(wú)標(biāo)記的方法，通過(guò)計(jì)算分析將碳青霉烯類(lèi)敏感肺炎克雷伯菌(carbapenem-susceptibleKlebsiellapneumoniae,CSKP)菌株與碳青霉烯類(lèi)耐藥性肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniae，CRKP)菌株區(qū)分開(kāi)來(lái)，并成功地預(yù)測(cè)肺炎克雷伯菌的碳青霉烯類(lèi)敏感性和耐藥性[20]。雖然拉曼光譜具有低成本、無(wú)標(biāo)記和無(wú)損的特性，且具有區(qū)分細(xì)菌潛在感染的潛力，但是該技術(shù)尚未在臨床環(huán)境中得到充分探索，基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用之間仍然存在差距。

2.4其他物理、化學(xué)檢測(cè)法 主要包括流式細(xì)胞儀、耐藥菌微動(dòng)量(micromotion)和微量熱法(microcalorimetry)等檢測(cè)方法。其中流式細(xì)胞儀是一種革命性的工具，可以從單個(gè)細(xì)菌細(xì)胞角度提供相關(guān)抗生素的耐藥性的檢測(cè)。最近一項(xiàng)研究將定量流式細(xì)胞儀和熒光插層儀相結(jié)合，在1 h內(nèi)可以檢測(cè)到臨床上重要的肺炎鏈球菌耐藥性，為進(jìn)行快速AST提供了一種新途徑[21]。但是此類(lèi)方法的局限性在于：基于流式細(xì)胞儀的AST研究集中于光散射特性、膜電位和膜滲透性的變化，這些參數(shù)是細(xì)菌活力的關(guān)鍵指標(biāo)，但此類(lèi)參數(shù)數(shù)據(jù)復(fù)雜、暫無(wú)臨床標(biāo)準(zhǔn)參考值，也缺乏系統(tǒng)的臨床研究來(lái)論證準(zhǔn)確性[22]。

2.5基于熒光探針技術(shù)的檢測(cè)方法 此類(lèi)方法基于DNA和RNA探針雜交技術(shù)，通過(guò)探針攜帶的熒光標(biāo)簽檢測(cè)耐藥基因，包括經(jīng)典的熒光原位雜交技術(shù)(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)。FISH是一種以定量方式可視化目標(biāo)DNA的高度特異性方法，它根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，通過(guò)特殊手段使帶有熒光物質(zhì)的探針與目標(biāo)DNA接合，通過(guò)熒光顯微鏡直接觀(guān)察目標(biāo)DNA所在位置。目前基于FISH技術(shù)已經(jīng)開(kāi)發(fā)的檢測(cè)包括XpressFish、QuickFish、RASER-FISH、DVC-FISH等[23-25]。此外，研究人員針對(duì)活細(xì)菌細(xì)胞開(kāi)發(fā)了rRNA探針檢測(cè)，rRNA探針技術(shù)可以更好地檢測(cè)活躍細(xì)胞的代謝、生長(zhǎng)和耐藥性轉(zhuǎn)錄表達(dá)。美國(guó)Broad研究所開(kāi)發(fā)的GoPhAST-R技術(shù)，通過(guò)RNA檢測(cè)以94%～99%的準(zhǔn)確率對(duì)基因型和表型耐藥的細(xì)菌菌株進(jìn)行分類(lèi)，并且在數(shù)小時(shí)內(nèi)確定關(guān)鍵抗生素耐藥標(biāo)記[26]。上述基于熒光探針技術(shù)檢測(cè)耐藥基因具有可視化、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，但是此類(lèi)探針無(wú)法檢出新的耐藥基因，對(duì)于具有突變位點(diǎn)的耐藥基因的檢測(cè)準(zhǔn)確率也顯著降低。

2.6基于核酸擴(kuò)增技術(shù)的檢測(cè)方法 基于核酸擴(kuò)增技術(shù)的檢測(cè)方法包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcription-quantitative real-time polymerase chain reaction,RT-qPCR)和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)等方法。其中以L(fǎng)AMP最為簡(jiǎn)潔且應(yīng)用廣泛[27]。與常規(guī)PCR相比，LAMP無(wú)需模板的熱變性、溫度循環(huán)、電泳及紫外觀(guān)察等過(guò)程。在等溫(60～65 ℃)條件下，進(jìn)行核酸擴(kuò)增1 h，即能達(dá)到檢測(cè)耐藥基因的目的。最近研究表明，LAMP已成功用于黏菌素耐藥基因mcr-3、β-內(nèi)酰胺酶基因blaAFM-1等檢測(cè)[28-29]。此外，研究人員基于LAMP還開(kāi)發(fā)出smaRT-LAMP、RT-LAMP等技術(shù)和產(chǎn)品[30-31]。綜上所述，基于核酸擴(kuò)增的檢測(cè)技術(shù)步驟簡(jiǎn)單、省時(shí)且經(jīng)濟(jì)，適用于臨床細(xì)菌耐藥基因的快速診斷和篩查。

2.7基因芯片技術(shù)檢測(cè) 基因芯片又稱(chēng)為DNA微陣列，是一種同時(shí)將大量探針固定于固相表面，核酸樣本經(jīng)熒光標(biāo)記或擴(kuò)增后，利用核酸雜交的特異性對(duì)大批量未知樣品進(jìn)行檢測(cè)、分析的方法。2000年P(guān)erreten團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)出一種可以在1 h內(nèi)同時(shí)檢測(cè)革蘭陽(yáng)性菌中90多種耐藥基因的基因芯片[32]。目前，基因芯片技術(shù)發(fā)展較為成熟，基于此類(lèi)技術(shù)方法可以快速篩查臨床環(huán)境中病原菌及耐藥菌，從而為抗生素的選擇和使用提供參考?；蛐酒夹g(shù)具有高通量篩選耐藥基因的潛力，具有同時(shí)檢測(cè)數(shù)千個(gè)基因的特征優(yōu)勢(shì)，但其局限性在于表型和基因型標(biāo)記之間的相關(guān)性差、無(wú)MIC值、無(wú)法檢測(cè)新的或非特征性的耐藥基因等。

3 基于高通量測(cè)序技術(shù)的細(xì)菌耐藥基因檢測(cè)

隨著測(cè)序技術(shù)的迭代更新和生物信息學(xué)的發(fā)展，高通量測(cè)序技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于細(xì)菌耐藥檢測(cè)領(lǐng)域，包括WGS、mNGS和MscRNA-seq等技術(shù)。此類(lèi)技術(shù)檢測(cè)時(shí)間通常在14～20 h，能夠提供細(xì)菌的耐藥基因型，發(fā)現(xiàn)新的耐藥基因，以及獲得單個(gè)細(xì)菌細(xì)胞的耐藥基因轉(zhuǎn)錄情況。但此類(lèi)技術(shù)實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，成本高，步驟復(fù)雜，缺乏標(biāo)準(zhǔn)化和自動(dòng)化的分析流程，目前僅局限于臨床復(fù)雜疾病的病原體診斷篩查。

3.1WGS WGS是指獲得一個(gè)物種全基因序列的過(guò)程。在細(xì)菌耐藥性檢測(cè)領(lǐng)域，WGS可以提供細(xì)菌全面的耐藥基因譜，并通過(guò)耐藥基因預(yù)測(cè)其耐藥表型，揭示相關(guān)耐藥機(jī)制[33]。多項(xiàng)研究對(duì)WGS和表型AST檢測(cè)細(xì)菌耐藥性進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果呈高度一致性[34-35]，證明了通過(guò)WGS預(yù)測(cè)細(xì)菌耐藥性的準(zhǔn)確性。此外，通過(guò)WGS鑒定耐藥細(xì)菌基因組中染色體和質(zhì)粒編碼的抗生素耐藥基因，有助于了解耐藥基因的移動(dòng)和傳播背后的機(jī)制[30]，還可以對(duì)耐藥菌株的爆發(fā)流行進(jìn)行監(jiān)控[36]。但是此類(lèi)技術(shù)檢測(cè)周期較長(zhǎng)，價(jià)格較貴，且樣本需要純細(xì)菌培養(yǎng)物，對(duì)臨床細(xì)菌的鑒定分離要求較高。

3.2mNGS mNGS是通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)特定環(huán)境樣品中微生物群體的基因組信息。通過(guò)生物信息學(xué)分析方法進(jìn)行病原體鑒定、微生物組分析、宿主相互作用分析和細(xì)菌耐藥性預(yù)測(cè)。在臨床細(xì)菌耐藥基因檢測(cè)中，mNGS能診斷未知病原體的感染，并挖掘其耐藥基因，為臨床合理使用抗生素提供參考?；趍NGS技術(shù)，Wang等[37]在1例免疫功能低下的重癥肺炎患者的培養(yǎng)陰性肺組織樣本中鑒定出肺炎克雷伯菌，并進(jìn)一步鑒定出blaSHV-12、blaKPC-2、blaTEM-1、blaCTX-M-65等抗性基因。此外，mNGS還可用于新型耐藥基因的檢測(cè)。Torres-Cortés等[38]通過(guò)mNGS技術(shù)，從土壤樣本中確定了11種新的抗生素耐藥基因，包括新型氨芐西林耐藥基因、慶大霉素耐藥基因、氯霉素耐藥基因和甲氧芐啶耐藥基因等。mNGS的優(yōu)點(diǎn)在于直接從原始樣本進(jìn)行無(wú)偏檢測(cè)，在對(duì)現(xiàn)有耐藥基因篩查的基礎(chǔ)上挖掘新型耐藥基因。但是該技術(shù)成本高，步驟復(fù)雜，缺乏標(biāo)準(zhǔn)化和自動(dòng)化的分析流程，對(duì)細(xì)菌耐藥基因的大規(guī)模篩查較為困難。

3.3MscRNA-seq 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(single-cell RNA sequencing，scRNA-seq)是指對(duì)單個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序，從而獲得轉(zhuǎn)錄組學(xué)信息，揭示細(xì)胞群差異和細(xì)胞進(jìn)化關(guān)系[39]。MscRNA-seq是近年最新的檢測(cè)技術(shù)，其原理是將scRNA-seq應(yīng)用于單個(gè)微生物，如細(xì)菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中。但是MscRNA-seq的發(fā)展受限于微生物mRNA含量低、部分細(xì)菌獨(dú)特的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜以及mRNA無(wú)多聚腺苷酸化等原因，技術(shù)壁壘高，發(fā)展較為困難。美國(guó)華盛頓大學(xué)Georg Seelig研究團(tuán)隊(duì)利用基于分割池連接的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(split-pool ligation-based transcriptome sequencing,SPLiT-seq)技術(shù)對(duì)細(xì)菌進(jìn)行了微生物單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組microSPLiT測(cè)序(microbial split-pool ligation transcriptomics)，首次通過(guò)低成本、高通量的方法成功進(jìn)行細(xì)菌單細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析工作[40]。microSPLiT通過(guò)組合條形碼標(biāo)記RNA的細(xì)菌細(xì)胞來(lái)源，一次實(shí)驗(yàn)可分析數(shù)以萬(wàn)計(jì)的細(xì)菌細(xì)胞。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，MscRNA-seq技術(shù)克服了mRNA含量低、細(xì)胞多樣性和細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)復(fù)雜等困難，通過(guò)此類(lèi)技術(shù)挖掘臨床超級(jí)細(xì)菌中耐藥基因的轉(zhuǎn)錄組，理解耐藥基因的表達(dá)、轉(zhuǎn)移等問(wèn)題，對(duì)進(jìn)一步檢測(cè)和篩查臨床多重耐藥性具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

4 小結(jié)

本文總結(jié)了基于傳統(tǒng)經(jīng)典方法、分子生物學(xué)技術(shù)和高通量測(cè)序技術(shù)的細(xì)菌耐藥性檢測(cè)方法，三種檢測(cè)方法的比較見(jiàn)表1。傳統(tǒng)細(xì)菌耐藥性檢測(cè)方法能提供細(xì)菌耐藥的表型信息，但需要長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)和鑒定，且無(wú)法檢測(cè)耐藥基因。以物理、化學(xué)和分子生物學(xué)方法為基礎(chǔ)的新技術(shù)，其細(xì)菌耐藥性檢測(cè)周期短、靈敏度高，但是無(wú)法檢測(cè)未知耐藥基因及突變基因。而基于高通量測(cè)序的檢測(cè)技術(shù)對(duì)經(jīng)典方法的表型檢測(cè)進(jìn)行補(bǔ)充，可以準(zhǔn)確鑒定細(xì)菌的耐藥基因，發(fā)現(xiàn)新的耐藥基因及突變位點(diǎn)。筆者認(rèn)為在未來(lái)細(xì)菌耐藥性的表型和基因型的綜合檢測(cè)，對(duì)于控制耐藥細(xì)菌感染及流行至關(guān)重要，也為相關(guān)感染性疾病的預(yù)防和監(jiān)測(cè)提供新的技術(shù)支持。

表1 細(xì)菌耐藥性及耐藥基因檢測(cè)技術(shù)的比較