微滴式數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)在病原體檢測中的研究進(jìn)展

周玉麟， 劉 妍， 夏 勇， 郭旭光

感染性疾病是臨床上常見疾病，其快速、明確地診斷病原體有助于提高診療效果。近幾年，在多種感染性疾病中，病原體定量檢測被證明對疾病的預(yù)后和監(jiān)測治療有重要作用。實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction,rt-qPCR)作為二代核酸檢測方法，已在實驗室及臨床被廣泛使用。但由于很多因素都會影響rt-qPCR的效率，因此rt-qPCR的準(zhǔn)確度和精密度可能會有很大的差異。rt-qPCR作為臨床常規(guī)檢測技術(shù)存在不足之處，尤其是在復(fù)雜背景下檢測低含量的靶基因時，需要更加敏感和穩(wěn)定的方法檢測[1]。雖然rt-qPCR已被廣泛應(yīng)用于血清、腦脊液和組織樣本的檢測，但其靈敏度、準(zhǔn)確性和可復(fù)制性仍不令人滿意。第三代聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)，微滴式數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)(droplet digital PCR,ddPCR)，是對傳統(tǒng)PCR方法的生物技術(shù)改進(jìn)，用于直接量化和克隆擴(kuò)增DNA。目前廣泛應(yīng)用于低豐度核酸檢測，可用于感染性疾病的診斷[2]。ddPCR相較于定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative polymerase chain reaction,qPCR)，其優(yōu)勢是絕對定量的，不需要標(biāo)準(zhǔn)曲線，而且高度可復(fù)制的，也不需要對極低濃度下的模板進(jìn)行預(yù)富集。ddPCR通過直接計數(shù)陽性孔來計數(shù)絕對DNA數(shù)量，這在不同的檢測中提供了更好的可比性結(jié)果[3]。總的來說，ddPCR通常具有更高的靈敏度、更好的準(zhǔn)確性和更穩(wěn)定的性能。近幾年的報告確實顯示了ddPCR在臨床診斷中的應(yīng)用潛力[3-4]。因此，將ddPCR用于臨床研究，對正確診斷和有效治療具有巨大的優(yōu)勢。其在病原體檢測中應(yīng)用廣泛，可用于細(xì)菌、真菌、原蟲和病毒的快速檢測?，F(xiàn)將ddPCR技術(shù)的發(fā)展、原理、優(yōu)勢及在病原微生物檢測中的具體應(yīng)用綜述如下。

1 ddPCR的發(fā)展及原理

1992年，Sykes最先提出了ddPCR的概念，它是通過將泊松分布和稀釋模板結(jié)合到單分子水平來定量DNA分子。ddPCR的原理是將與Taqman實驗相似的傳統(tǒng)PCR混合物，通過加入微孔板、毛細(xì)血管或油乳稀釋成更小的反應(yīng)體系[5]。然后這些小的反應(yīng)體系會單獨運行，運行結(jié)束后，對所有反應(yīng)中的陽性反應(yīng)進(jìn)行檢查和統(tǒng)計。利用小數(shù)的泊松定律，模板的數(shù)量與陽性反應(yīng)系呈正相關(guān)，從而可以計算出模板的確切拷貝數(shù)。近幾年報道ddPCR適用于檢測低濃度DNA且應(yīng)用范圍廣泛，如檢測病原體、基因突變、基因拷貝數(shù)表達(dá)變異、mRNA表達(dá)水平和DNA修飾等[2]。如今，越來越多研究證明ddPCR將在臨床上廣泛應(yīng)用，其不僅在病原體檢測上有特殊優(yōu)勢，還在腫瘤早期相關(guān)基因篩查及腫瘤復(fù)發(fā)風(fēng)險預(yù)測、產(chǎn)前診斷等領(lǐng)域具有潛在優(yōu)勢。

2 ddPCR的優(yōu)勢

2.1更高的精密度和靈敏度 在精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的要求下，對病原體核酸的精確測量越來越重要。目前臨床上應(yīng)用廣泛的qPCR通過測量PCR擴(kuò)增物來評估DNA的數(shù)量在一定時間點(周期閾值、CT)的熒光信號，將模板分為單個的反應(yīng)系統(tǒng)，然后在單個孔和DNA中進(jìn)行過渡PCR，可通過直接計數(shù)PCR陽性率進(jìn)行DNA定量。傳統(tǒng)的qPCR通過將樣本的CT值與定義明確的樣本生成的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較來定量樣本。因此，qPCR通過一種“模擬”方法來確定樣品的濃度。利用信號的存在和缺失來指示目標(biāo)DNA，使樣本的“數(shù)字”直接測量。相較于qPCR，ddPCR的優(yōu)勢是其測量是絕對定量的，不需要標(biāo)準(zhǔn)曲線，不是通過“模擬”方式得到最終結(jié)果，因此結(jié)果是高度可復(fù)制的[3-4]。由于樣品制備和PCR條件的多樣性，即使有一個標(biāo)準(zhǔn)曲線顯示，qPCR的數(shù)據(jù)多樣性仍高于ddPCR，這導(dǎo)致結(jié)果的精密度下降。ddPCR通過直接計數(shù)陽性孔來計數(shù)絕對DNA數(shù)量，這在不同的檢測中提供了更好的可比性結(jié)果。qPCR的靈敏度因使用的樣本類型而差異很大[6]，ddPCR具有較高的靈敏度，不需要對極低濃度下的模板進(jìn)行預(yù)富集[3]，因為ddPCR將樣本分成若干個小PCR分區(qū)，可實現(xiàn)單分子級檢測，避免了模板間的競爭效應(yīng)，理論上可以提高低豐度目的序列的檢測靈敏度，也有實驗用于對低濃度的樣本進(jìn)行檢測，獲得了理想的檢測效果[7]。

2.2更高的重復(fù)性及通用性 ddPCR不依賴標(biāo)準(zhǔn)品，不需要標(biāo)準(zhǔn)曲線，也不依賴熒光信號到達(dá)設(shè)定閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，直接計算樣品中目的核酸分子的個數(shù)，可實現(xiàn)絕對定量，重復(fù)性高[8]。因此ddPCR可用于常規(guī)qPCR所需的標(biāo)準(zhǔn)品定量，具有計量學(xué)意義。ddPCR通用性強，適用樣本廣泛，ddPCR技術(shù)正在各種生物液體中進(jìn)行研究，例如腦脊液、尿液、糞便、眼液、痰液、唾液、支氣管肺泡灌洗液、胸腔積液、血清黏蛋白液、腹膜液、細(xì)針吸液、膽汁或胰液等。高重復(fù)性及高通用性也為其將來運用于臨床上提供了更大的可能性。

3 ddPCR應(yīng)用于病原體檢測的范圍

3.1病毒學(xué)檢測 近年來，ddPCR技術(shù)的使用率在病毒性疾病診斷中逐漸上升。ddPCR技術(shù)對于檢測低病毒載量樣本具有優(yōu)勢，對于病毒的診斷性能及分析性能也較強，有望成為臨床實驗室中一種強大的診斷方法。例如識別和檢測病毒、病毒載量測定、單拷貝病毒基因組分析、單核苷酸多態(tài)性和病毒-宿主相互作用[13-14]。雖然ddPCR仍處于早期階段，與其他常規(guī)方法相比，具有更高的靈敏度和特異度，檢測的窗口期更短，意味著能早期明確診斷疾病，為臨床治療帶來福音，為疾病防控爭取時間。此外，在檢測病毒感染疾病中，ddPCR在判斷疾病嚴(yán)重程度、監(jiān)測病程、預(yù)測治療效果及預(yù)后方面也發(fā)揮著重要作用。在這里，我們列舉了一些例子來說明ddPCR在快速準(zhǔn)確地檢測病毒病原體方面的優(yōu)勢。

3.1.1 嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)

世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)于2020年宣布新型冠狀病毒肺炎(coronavirus disease 2019,COVID-19)為全球大流行病。及時準(zhǔn)確地檢測SARS-CoV-2是有效控制這一流行病的第一步。此外，有證據(jù)表明SARS-CoV-2病毒載量在患者住院期間會波動[15]，而更高的SARS-CoV-2水平與疾病嚴(yán)重程度和死亡率增加有關(guān)[16]。同時，SARS-CoV-2病毒載量水平與其在接種疫苗和未接種疫苗個體中的傳播率密切相關(guān)[17]。值得注意的是，病毒載量水平可用于預(yù)測患者對治療的反應(yīng)。因此準(zhǔn)確檢測病原體SARS-CoV-2對于防控COVID-19流行和疾病治療至關(guān)重要。目前定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(quantitative reverse transcription PCR,RT-qPCR)被WHO和疾病預(yù)防控制中心視為診斷SARS-CoV-2的參考標(biāo)準(zhǔn)測試。然而，它的局限性促使人們采用更準(zhǔn)確的檢測方法來檢測SARS-CoV-2，量化其水平和評估預(yù)后。大多數(shù)研究報告稱，在檢測和量化SARS-CoV-2水平方面，ddPCR比RT-qPCR診斷更準(zhǔn)確，尤其是在病毒載量低的患者中。ddPCR還被發(fā)現(xiàn)在量化住院患者的SARS-CoV-2 RNAemia水平、監(jiān)測病程和預(yù)測其對治療的反應(yīng)方面非常有效[18]。這些發(fā)現(xiàn)表明，ddPCR可以作為SARS-CoV-2檢測工具的補充或替代工具，具有良好的診斷、預(yù)后和治療價值，尤其是在醫(yī)院環(huán)境中。但仍需要進(jìn)一步的研究來對其實驗室方案進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，并準(zhǔn)確評估其在監(jiān)測COVID-19治療反應(yīng)和識別SARS-CoV-2新興變體中的作用。越來越多的證據(jù)表明，ddPCR對SARS-CoV-2 RNA血漿水平的動態(tài)監(jiān)測與疾病狀態(tài)(進(jìn)展或緩解)和對治療的反應(yīng)相關(guān)。值得注意的是，有研究表明，患者血漿中較高水平的SARS-CoV-2 RNA與疾病進(jìn)展具有較高的相關(guān)性[19]。Szwebel等[20]的研究揭示了ddPCR能夠通過檢測升高的SARS-CoV-2 RNA血漿水平來預(yù)測患者的病情惡化，表明ddPCR可用于監(jiān)測COVID-19疾病的病程且從血漿中清除病毒有助于患者的臨床康復(fù)。其研究表明ddPCR能夠在74%的住院COVID-19患者中檢測到SARS-CoV-2 RNA血癥，而就診時RNA血癥的存在與疾病嚴(yán)重程度、住院時間延長、疾病進(jìn)展和肺外并發(fā)癥有關(guān)[20]。由此表明，ddPCR是一種高性能模式，對COVID-19患者具有潛在的診斷、預(yù)后和治療價值。但其也有不足之處，ddPCR的靈敏度在不同樣本來源之間存在差異，鼻咽拭子中的陽性檢出率最高，因此需要進(jìn)一步關(guān)注ddPCR在不同樣本中的診斷性能。

3.1.2 人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV) 導(dǎo)致獲得性免疫缺陷綜合征(acquired immunodeficiency syndrome,AIDS)的HIV在初次感染期間會引起CD4+T細(xì)胞的大量損失，這與一般流感沒有明顯差異[2]。CD8+T細(xì)胞隨后被激活，同時產(chǎn)生抗HIV抗體，如p24抗體，用作HIV感染的臨床標(biāo)志物。由于HIV原發(fā)感染期和無癥狀潛伏期有流感樣癥狀，直到晚期HIV感染發(fā)生機(jī)會性感染，患者就醫(yī)后才被診斷出HIV感染。血清學(xué)方法在初級或潛伏期有用，但是其難以成為高危人群的日常測試[21]?；趒PCR的方法廣泛用于HIV檢測，包括線性拷貝DNA(complementary DNA,cDNA)、2-LTR環(huán)和整合HIV DNA[22]。自2012年以來，有研究證明ddPCR可用于檢測總HIV DNA、2-LTR環(huán)和病毒RNA[23]。使用ddPCR檢測血漿HIV RNA可以更好地早期診斷HIV感染。與qPCR相比，ddPCR在通過總HIV DNA和2-LTR環(huán)確定疾病進(jìn)展和抗病毒治療效果中的應(yīng)用顯示出更高的靈敏度和準(zhǔn)確性[24-26]。ddPCR還可通過測量CCL4L的拷貝數(shù)來預(yù)測HIV感染和疾病進(jìn)程的結(jié)果，CCL4L編碼CCR5的配體并作為HIV感染的抑制劑[27]。但在檢測HIV病毒載量時，仍有一些無法解釋的假陽性事件被報告[28]。顯然，通過個性化檢測，ddPCR將成為診斷HIV的強大而有效的平臺。WHO報告稱，截至2018年底，全球有3 790萬人被診斷出感染HIV，其中62%(2 330萬人)正在接受抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療。根據(jù)WHO指南，抗病毒治療旨在減少病毒的拷貝數(shù)低于1 000 copies/ml[29]。病毒載量監(jiān)測是驗證抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療效果的推薦篩查方法[30]。雖然ddPCR在HIV檢測及治療監(jiān)測上都有重要意義，但其在HIV病毒載量中的應(yīng)用仍存在爭議，需要更多的實驗研究去證明其具有靈敏性和穩(wěn)定性等優(yōu)勢，才能普遍應(yīng)用于診斷實驗室。

3.1.3 乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV) 病毒性肝炎乙型肝炎是由HBV引起的傳染病，通過接觸受感染的血液或體液傳播。大多數(shù)慢性病患者沒有癥狀，然而有些患者最終會發(fā)展成肝硬化和肝細(xì)胞癌。對早期感染HBV的患者進(jìn)行可靠診斷可以有效防止患者病情惡化。乙型肝炎抗原或抗體是現(xiàn)代醫(yī)院診斷HBV感染最常見的生物標(biāo)志物。乙型肝炎表面抗原是HBV感染期間第一個可檢測到的病毒抗原，但它可能既不存在于感染早期，也不存在于感染后期，因為宿主免疫系統(tǒng)一直在持續(xù)清除它[2]。因此，需要一種可用于改善HBV檢測的新穎、靈敏且特異的檢測手段。ddPCR為肝炎病毒核酸的鑒定和定量提供了新的視野。ddPCR的使用為監(jiān)測接受聯(lián)合治療的肝炎感染者提供了一種有前景的方法。ddPCR是一種強大的檢測工具，甚至可以測量低至一個拷貝的HBV DNA[31-32]，其低檢測限和定量限分別為0.8拷貝/105個細(xì)胞和3.8拷貝/105個細(xì)胞；而對于qPCR相應(yīng)的檢測指標(biāo)分別為19.1拷貝/105個細(xì)胞和71.1拷貝/105個細(xì)胞。根據(jù)歐洲肝臟研究協(xié)會(European Association for the Study of the Liver,EASL)2017臨床實踐指南，治療期間的病毒學(xué)應(yīng)答被定義為無法檢測到的HBV DNA，其檢測限為10 IU/ml[33]，這是傳統(tǒng)檢測方法可檢測到的最低實際值。HBV的共價閉合環(huán)狀DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)，已成為隱匿性乙型肝炎病毒感染(occult hepatitis B virus infection,OBI)和肝細(xì)胞癌的新型預(yù)后生物標(biāo)志物。所有HBV RNA分子均來源于cccDNA，其存在于慢性HBV感染患者的肝細(xì)胞中。ddPCR可以提高HBV DNA的DNA檢測限，且線性度較高[31，34]。和其他病毒相似，通過RT-ddPCR和RT-qPCR檢測HBV RNA拷貝數(shù)證明了高度的線性和定量相似性。越來越多的證據(jù)表明，ddPCR是一種高度準(zhǔn)確的技術(shù)，其精準(zhǔn)度和重現(xiàn)性較傳統(tǒng)的qPCR方法更高。對此進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化仍然需要確定該方法對低病毒載量臨床樣品的性能，特別是在OBI和細(xì)胞治療方法中的性能，這也將為HBV感染的診斷與治療帶來巨大前景。

3.1.4 其他病毒 ddPCR超靈敏技術(shù)是一種通用的方法，除了上述病毒以外，還可以用于檢測其他病毒，如巨細(xì)胞病毒、流感病毒等。ddPCR對于低病毒載量的巨細(xì)胞病毒樣本具有很好的檢測效果，因其靈敏度與特異度高，且對于錯配引物的抵抗力強，也具有較高的重復(fù)性[35]。流感病毒是臨床上常見的病毒，使用ddPCR去檢測流感病毒技術(shù)也很成熟，尤其是最近開發(fā)了一種具有成本效益的六重ddPCR來檢測甲型流感病毒(H1、H3和M)和乙型流感病毒(Yamagata HA、Victoria HA和M)單一反應(yīng)混合物中的片段，推動了快速檢測領(lǐng)域的發(fā)展[35]。ddPCR開辟了病毒檢測的新領(lǐng)域，隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，之后也會用于更多類型的病毒檢測。

3.2細(xì)菌學(xué)檢測 細(xì)菌是許多疾病的病原體，可以通過多種方式在正常人體間傳播，具有較強的傳染性，對社會危害很大，所以從可疑樣本中快速準(zhǔn)確地檢測致病細(xì)菌至關(guān)重要。然而，傳統(tǒng)的基于培養(yǎng)的細(xì)菌檢測方法時間周期較長，需要更快速的方法來進(jìn)行檢測。目前已經(jīng)開發(fā)了多種診斷技術(shù)，特別是基于PCR的方法可快速檢測病原體。目前應(yīng)用于檢測的常用PCR的方法主要有普通PCR、rt-qPCR及多重PCR，普通PCR及rt-qPCR早已被廣泛接受。而相比于普通PCR及rt-qPCR，多重PCR能夠同時檢測多個基因的特點，曾引起廣泛關(guān)注，但其受到引物及靶標(biāo)設(shè)計等諸多因素影響，限制了其發(fā)展[36]。因常用的PCR方法檢測細(xì)菌的局限性，近幾年開發(fā)了ddPCR以尋求更靈敏、準(zhǔn)確及可重復(fù)的檢測方法。早在2017年，就已經(jīng)有研究組開發(fā)了多重單完整細(xì)胞ddPCR檢測技術(shù)來檢測腸出血性大腸桿菌，這是在單個完整細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)檢測兩個遺傳靶標(biāo)的新方法，包括腸出血性大腸桿菌的志賀毒素stx和緊密素eae。將此技術(shù)應(yīng)用于富集培養(yǎng)篩選可以減少假陽性的出現(xiàn)，提高了食品中腸出血性大腸桿菌檢測方法的速度和準(zhǔn)確性，降低了檢測成本。然而，此研究方法只有雙遺傳靶標(biāo)，而且擴(kuò)增效率較低。之后，Lei等[37]開發(fā)了一種基于tlh、tdh和ureR基因引物和探針序列的三重ddPCR方法，用于對副溶血性弧菌細(xì)胞進(jìn)行檢測和基因分型。而后，在此基礎(chǔ)上更是建立了一種四重ddPCR方法，可以同時檢測食品樣品中的tlh、tdh、ureR和orf8基因，用于檢測具有單個完整細(xì)胞的副溶血性弧菌。將這些基因的4個探針用2種熒光染料標(biāo)記，探針濃度按比例分布形成16(24)簇，從而明確顯示和量化含有1個/2個/3個/4個特定基因的液滴，對應(yīng)于單個完整細(xì)菌細(xì)胞的基因類型。該四重ddPCR測定的靈敏度為39 CFU/ml，靈敏度與傳統(tǒng)的平板計數(shù)一致，并且比qPCR的靈敏度高10倍。因此，此四重ddPCR方法可以快速準(zhǔn)確地檢測副溶血性弧菌(包括大流行組菌株)，且特異性強、靈敏度高，可用于多種樣品中副溶血性弧菌的分化，并為檢測其他細(xì)菌提供一種新的方法[38]。之后，更有研究建立了一種多重ddPCR方法，可以同時檢測5種高風(fēng)險細(xì)菌，包括鼠疫耶爾森菌、炭疽芽胞桿菌、布魯氏菌、類鼻疽伯克霍爾德菌以及土拉弗朗西斯菌。多重檢測結(jié)果表明，該方法對于5種細(xì)菌的檢測限較低(0.1～1.0 pg/μl)，且特異度高。同時，由于某些菌株中可能不存在質(zhì)粒，這項研究建立的多重ddPCR測定主要集中在染色體上的基因(單拷貝基因)而不是5種細(xì)菌的質(zhì)?；蛏蟍39]。除此之外，ddPCR檢測技術(shù)可以對呼吸道標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行鑒定及定量，大大改善了涂片檢測結(jié)核分枝桿菌的診斷[40]；還可以對感染樣品中的“亞洲念珠菌”和檸檬螺旋體進(jìn)行絕對定量和檢測[41]；也可以雙重檢測黃桿菌屬及魯氏耶爾森菌，用于監(jiān)測水樣中的病原體水平[42]。之后，更有研究人員在此基礎(chǔ)上建立了一種四重復(fù)合物測定法，包括新西蘭立克次氏體類生物體1(New Zealand rickettsia-like organism 1,NZ-RLO1)、新西蘭立克次氏體類生物體2(New Zealand rickettsia-like organism 2,NZ-RLO2)、海洋屈撓桿菌和魯氏耶爾森菌，為水產(chǎn)養(yǎng)殖提供了一種快速高效的病原體篩選工具[43]。

3.3真菌學(xué)檢測 真菌培養(yǎng)是目前鑒定真菌的普通方法，而隨著分子生物學(xué)的出現(xiàn)，真菌的檢測技術(shù)有了很大的發(fā)展。PCR檢測技術(shù)極大地提高了常見致病真菌的檢測速度，且特異性較好，敏感度較高。近年來，快速發(fā)展的ddPCR檢測技術(shù)也在真菌的鑒定中發(fā)揮了巨大的作用。(1)念珠菌是常見的一種真菌，在發(fā)病率增高的同時死亡率也逐年增加，對此侵襲性真菌感染的快速準(zhǔn)確診斷有助于感染患者的早期治療和改善預(yù)后。傳統(tǒng)的血培養(yǎng)方法周期過長，而在感染后臨床通常經(jīng)驗性使用廣譜抗生素，這會增加一些不必要的成本以及不良預(yù)后。Chen等[44]通過分析感染小鼠和疑似念珠菌血癥患者的血液樣本，來評估ddPCR方法在體外和體內(nèi)檢測念珠菌DNA的敏感度和特異度。結(jié)果表明，ddPCR對念珠菌DNA檢測的敏感度和特異度均高于傳統(tǒng)培養(yǎng)和qPCR方法，且重現(xiàn)性好。因此，ddPCR測定有可能是及時診斷念珠菌血癥的有效方法，可以用于監(jiān)測念珠菌血癥的治療。(2)耶氏肺孢子菌是一種人類特異性機(jī)會性真菌，可引起肺孢子蟲肺炎，是HIV患者常見的機(jī)會性感染病原體。但由于耶氏肺孢子菌無法培養(yǎng)，因此確診需要通過染色法來檢測鑒定病原體或者通過呼吸道標(biāo)本的PCR檢測，但這些方法都很可能受到病原體載量的影響。有研究開發(fā)了一種ddPCR方法來檢測呼吸道標(biāo)本中的耶氏肺孢子菌并評估其敏感性。ddPCR與qPCR這兩種方法都可以檢測耶氏肺孢子菌DNA，但相較于后者來說，前者對病原體載量較低的標(biāo)本顯示出更好的敏感性[45]。盡管ddPCR具有很多優(yōu)點，但這兩項研究都僅使用一個靶標(biāo)來評估qPCR與ddPCR測定的性能。(3)煙曲霉菌和土曲霉菌在支氣管擴(kuò)張癥等慢性呼吸道疾病狀態(tài)中具有重要的作用，目前大多數(shù)可用的曲霉菌相關(guān)診斷試劑盒不能專門檢測生物樣品中的煙曲霉菌和土曲霉菌，通常采用全曲霉菌方法的引物和探針，但會在幾種曲霉菌物種之間發(fā)生交叉反應(yīng)。該研究開發(fā)了雙重TaqMan引物和探針來評估ddPCR技術(shù)檢測正常及患病人群的呼吸道標(biāo)本。雖然qPCR和ddPCR這兩種方法都能檢測煙曲霉菌和土曲霉菌，但結(jié)果表明，相較于qPCR，ddPCR對檢測這兩種曲霉菌具有更高的敏感性，并且對PCR抑制更具有抵抗力，尤其在土曲霉菌豐度很低的情況下更加明顯[46]。除上述真菌外，ddPCR檢測技術(shù)能聯(lián)合檢測大麗輪枝菌及甘藍(lán)輪枝菌，其準(zhǔn)確性及靈敏度都高于qPCR[47]；還可以分析黃曲霉毒素和非黃曲霉毒素菌株的競爭和相互作用機(jī)制[48]；還能檢測面包上的異常威克漢姆酵母菌和扣囊復(fù)膜酵母菌，靈敏度高，可以用來監(jiān)測面包質(zhì)量[49]。

4 前景與展望

ddPCR是常規(guī)PCR方法的生物技術(shù)改進(jìn)，作為一種新技術(shù)，近幾年發(fā)展越來越成熟，應(yīng)用越來越廣泛。其有著高效的診斷性能，有其獨特的優(yōu)勢，可用于直接定量和克隆擴(kuò)增DNA，對感染性疾病的診斷、病情監(jiān)測及預(yù)后評估有重要作用。盡管如此，ddPCR在感染性病診斷中還沒有實際應(yīng)用于臨床，需要更多的臨床樣本來測試ddPCR的性能。最重要的是，與qPCR相比，ddPCR機(jī)器和試劑的成本相對較高，這使得它難以在醫(yī)院的一般實驗室中普及。未來，當(dāng)ddPCR檢測成本下降時，其在醫(yī)院和實驗室中的應(yīng)用將會越來越多。