快速鑒定白念珠菌的臨床應(yīng)用研究

陽春麗， 任寶軍， 徐躍軒， 盧 贊， 錢 凈， 楊文迪， 馬永鑫， 趙曉麗

近年來，隨著抗菌藥物、免疫抑制劑、抗腫瘤藥物的廣泛使用，以及外科手術(shù)和其他輔助治療操作的大范圍開展，引起定植菌群紊亂以及機體屏障破壞，使得機會性致病菌有機可乘，導(dǎo)致侵襲性念珠菌病的發(fā)病率及病死率逐年升高[1]。白念珠菌是典型的條件致病菌，定植在健康宿主時不致病，當(dāng)機體防御力下降時，打破了與病原菌間的平衡而引發(fā)疾病[2]。其中以白念珠菌血流感染最常見，致死率極高，傳統(tǒng)的真菌培養(yǎng)鑒定耗時長，不利于早期診斷。分子生物學(xué)方法是目前微生物快速鑒定的重要方向，全基因組測序(whole genome sequencing，WGS)能夠系統(tǒng)地描述突變類型的全部序列，但操作繁瑣且成本較高，臨床可替代方法多。肽核酸-熒光原位雜交(peptide nucleic acid-fluorescence in situ hybridization，PNA-FISH)，在熒光原位雜交基礎(chǔ)上，將帶負(fù)電荷的DNA探針替換為不帶電荷的肽核酸(peptide nucleic acid,PNA)探針，整個雜交過程遵循堿基互補配對原則，最終在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，適用于常見病原菌檢測，易漏檢未知序列病原菌。基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption-ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)是通過氣化基質(zhì)與待測菌復(fù)合物，解析電離待測菌蛋白質(zhì)，根據(jù)分子質(zhì)荷比(m/z)確定菌種，具有檢測范圍廣、通量高的優(yōu)勢。但直接鑒定血培養(yǎng)陽性標(biāo)本，樣本前處理步驟更復(fù)雜，成本較高，準(zhǔn)確性有待進(jìn)一步確證，而真菌細(xì)胞壁較厚，直接鑒定難度大[3-4]。因此，MALDI-TOF MS大多用于鑒定分離培養(yǎng)后的單個新鮮菌落。本實驗以VITEK 2 Compact全自動細(xì)菌鑒定儀為參照，以實驗室留存的白念珠菌100株制備模擬血培養(yǎng)陽性標(biāo)本，再利用PNA-FISH技術(shù)、MALDI-TOF MS兩種方法對白念珠菌進(jìn)行鑒定。

1 材料與方法

1.1研究菌株來源 選取2021年昆明市第一人民醫(yī)院微生物室留存的、臨床分離的白念珠菌100株(按時間順序標(biāo)注1-100號)，其中來源于痰液標(biāo)本84株，糞便標(biāo)本8株，尿液標(biāo)本3株，血液標(biāo)本2株，陰道分泌物、傷口分泌物、引流液標(biāo)本各1株。金黃色葡萄球菌ATCC 25923、表皮葡萄球菌ATCC 12228、糞腸球菌ATCC 29212、大腸埃希菌ATCC 25922、銅綠假單胞菌ATCC 27853、肺炎克雷伯菌ATCC 700603、白念珠菌ATCC 14053、熱帶念珠菌ATCC 750、光滑念珠菌ATCC 15126、克柔念珠菌ATCC 14243等質(zhì)控菌株，來源于國家衛(wèi)生部臨床檢驗中心和云南省臨床檢驗中心。

1.2實驗試劑及耗材 白念珠菌PNA探針(探針序列由達(dá)安基因公司提供，探針合成由GenScript公司完成)、細(xì)菌檢測標(biāo)準(zhǔn)品、甲酸、乙腈(美國Sigma公司)、基質(zhì)液、質(zhì)譜靶板(德國Bruker Dalonik公司)、需氧血培養(yǎng)瓶[梅里埃診斷產(chǎn)品(上海)有限公司]、革蘭染液、1xPBS、氯化鉀、甲醇、冰醋酸、70%乙醇、85%乙醇、無水乙醇、20XSSC、0.3%NP-40、異硫氰酸熒光素染液(fluorescein isothiocyanate isomer，F(xiàn)ITC)、0.45%鹽水、多聚賴氨酸防脫玻片、蓋玻片。

1.3實驗儀器 OLYMPUS CX33熒光顯微鏡、雜交儀、Bruker質(zhì)譜儀、BACT/ALENT3D-240全自動血培養(yǎng)系統(tǒng)、麥?zhǔn)媳葷醿x、VITEK 2 Compact梅里埃全自動細(xì)菌鑒定儀、臺式高速離心機、旋渦混合器、二氧化碳培養(yǎng)箱、生物安全柜、37℃恒溫孵育箱、低速離心機。

1.4方法 根據(jù)《全國臨床檢驗操作規(guī)程》第4版[5]進(jìn)行病原菌分離培養(yǎng)、純化鑒定以及實驗室質(zhì)量控制。分離培養(yǎng)合格后，挑取單個菌落配制0.5麥?zhǔn)蠁挝痪鷳乙?，使用一次性無菌注射器抽取100 μl調(diào)好的菌液，注入需氧血培養(yǎng)瓶，做好標(biāo)記，放置于全自動血培養(yǎng)系統(tǒng)BACT/ALENT 3D-240中培養(yǎng)，待其報陽。PNA-FISH是直接取約5 ml陽性菌液進(jìn)行預(yù)處理，滴片觀察，雜交前處理，雜交及洗片，在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。MALDI-TOF MS需取少量菌液接種至沙保弱平板，培養(yǎng)出單個新鮮菌落，再利用甲酸乙腈提取法制備樣本，完成質(zhì)譜測定，記錄質(zhì)譜結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1100株白念珠菌PNA-FISH鑒定結(jié)果

2.1.1 PNA探針特異性驗證結(jié)果 共有10株標(biāo)準(zhǔn)菌株，僅白念珠菌ATCC 14053可見特異性綠色熒光，其他念珠菌及細(xì)菌均未觀察到熒光，特異度為100%，陽性質(zhì)控、陰性質(zhì)控均在控，熒光結(jié)果見圖1。

?白念珠菌ATCC 14053；?熱帶念珠菌ATCC 750；?克柔念珠菌ATCC 14243；?光滑念珠菌ATCC 15126；?金黃色葡萄球菌ATCC 25923；?表皮葡萄球菌ATCC 12228；?糞腸球菌ATCC 29212；?大腸埃希菌ATCC 25922；?銅綠假單胞菌ATCC 27853；?肺炎克雷伯菌ATCC 700603

2.1.2 PNA-FISH與VITEK 2 Compact全自動細(xì)菌鑒定方法的符合率 100株白念珠菌模擬血培養(yǎng)樣本，98株可觀察到特異性綠色熒光，2株未見熒光。因此，PNA-FISH技術(shù)與VITEK 2 Compact全自動細(xì)菌鑒定方法的符合率為98%，見表1。熒光結(jié)果見圖2。

表1 兩種方法檢出白念珠菌情況

?66號白念珠菌；?8號白念珠菌

2.1.3 PNA-FISH鑒定時間 采用PNA-FISH技術(shù)直接鑒定100株白念珠菌模擬血培養(yǎng)樣本，需要的平均鑒定時間為(2.5±0.5)h。見表2。

表2 PNA-FISH鑒定白念珠菌模擬血培養(yǎng)標(biāo)本的時間

2.2100株白念珠菌MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果

2.2.1 MALDI-TOF MS鑒定念珠菌結(jié)果 MALDI-TOF MS準(zhǔn)確鑒定出了白念珠菌ATCC 14053、熱帶念珠菌ATCC 750、光滑念珠菌ATCC 15126、克柔念珠菌ATCC 14243。

2.2.2 MALDI-TOF MS分析與VITEK 2 Compact全自動細(xì)菌鑒定方法的符合率 采用MALDI-TOF MS鑒定100株白念珠菌，最低分值為2.008，平均分值為2.191，均準(zhǔn)確鑒定到白念珠菌種水平(分值>1.999)，與VITEK 2 Compact全自動細(xì)菌鑒定方法的符合率為100%，質(zhì)譜結(jié)果見圖3。

?20號白念珠菌質(zhì)譜分值為2.453；?71號白念珠菌質(zhì)譜分值為2.283

2.2.3 MALDI-TOF MS鑒定時間 100株白念珠菌模擬血培養(yǎng)樣本報陽后，分離出單個新鮮菌落需18～24 h。采用MALDI-TOF MS鑒定單個菌落，需要的平均時間為3～5 min。因此，MALDI-TOF MS的平均鑒定時間為(22.0±0.6)h。

3 討論

3.1白念珠菌是真菌性血流感染的主要病原體，也是醫(yī)院感染控制的重要目標(biāo)。Kutlu等[6]研究發(fā)現(xiàn)，念珠菌血癥感染率為4.7%，30 d粗死亡率高達(dá)56.7%。我國一項針對67家重癥監(jiān)護(hù)室的研究數(shù)據(jù)顯示，侵襲性念珠菌病發(fā)生率為0.32%，死亡率為36.6%[7]。此外，移植患者念珠菌血癥的發(fā)病率達(dá)3.5%[8]，肝硬化患者達(dá)7.6%[9]。念珠菌血癥病原菌中，以白念珠菌為主，占30%～55%[6，10-11]。究其原因是念珠菌血癥起病隱匿，臨床特征不典型，而真菌的傳統(tǒng)培養(yǎng)與鑒定時間長，不利于臨床及時診斷，容易延誤病情，導(dǎo)致患者預(yù)后不佳。因此，白念珠菌的快速鑒定是微生物診斷亟待解決的問題。

3.2近年來，多位點序列分型、短串聯(lián)重復(fù)序列、微衛(wèi)星基因分型、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增等分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，有助于逐步實現(xiàn)微生物快速鑒定的目標(biāo)。PNA-FISH技術(shù)是利用PNA探針，在一定條件下與待測菌遺傳物質(zhì)進(jìn)行雜交，形成穩(wěn)定的雜合雙鏈核酸分子，針對念珠菌檢測具有良好的特異性和敏感性。MALDI-TOF MS整個鑒定過程，包括氣化樣本、解析樣本、電離樣本并測量分子質(zhì)荷比，繪制質(zhì)譜圖，在數(shù)據(jù)庫匹配已有菌株峰值圖得出質(zhì)譜分值，標(biāo)準(zhǔn)峰越多，分值越高；同理，錯誤峰或無峰越多，分值越低。

3.3瑞典Karolinska大學(xué)醫(yī)院研究表明，PNA-FISH技術(shù)可準(zhǔn)確鑒定98.7%的念珠菌[12]。課題組前期采用PNA-FISH技術(shù)鑒定血培養(yǎng)中白念珠菌的特異度為100.0%，與念珠菌顯色平板比對符合率為97.5%[13]，平均用時(4±0.2)h。本研究中，PNA探針鑒定白念珠菌的特異度為100%，與VITEK 2 Compact全自動細(xì)菌鑒定方法的符合率為98%，平均耗時(2.5±0.5)h。本研究的鑒定符合率與上述研究存在一定差異，考慮與實驗標(biāo)本量差異以及參照方法不同有關(guān)。后期實驗可進(jìn)一步優(yōu)化PNA探針設(shè)計合成，并增加罕見菌的特異性驗證，保證PNA探針與目標(biāo)念珠菌雜交效率。

3.4本研究中，Bruker質(zhì)譜儀鑒定100株白念珠菌，與VITEK 2 Compact全自動細(xì)菌鑒定方法的符合率為100%，高于國外Teke等[14]研究(98.7%)以及中國醫(yī)院侵襲性真菌監(jiān)測網(wǎng)(China Hospital Invasive Fungi Surveillance Network，CHIF-NET)報道數(shù)據(jù)(98.8%)[15]?？紤]主要原因為鑒定標(biāo)本是經(jīng)傳代培養(yǎng)后的單個菌落，避免了其他物質(zhì)干擾，且標(biāo)本量少。但MALDI-TOF MS鑒定白念珠菌的平均時間仍較長，后期實驗將進(jìn)行真菌血培養(yǎng)陽性標(biāo)本的直接鑒定，進(jìn)一步縮短MALDI-TOF MS鑒定真菌性血流感染病原菌的時間[3，16]，并在實際工作中不斷豐富質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫，為臨床提供準(zhǔn)確的病原菌鑒定報告。

3.5就鑒定的結(jié)果而言，傳統(tǒng)鑒定方法是鏡下結(jié)果加生化反應(yīng)，鏡下觀察可初步判斷真菌感染，但不能確定種屬以及混合感染，傳統(tǒng)生化鑒定操作復(fù)雜。PNA-FISH是核酸雜交和顯微鏡觀察，雜交操作簡單，對實驗人員及儀器設(shè)備要求低。質(zhì)譜可批量檢測病原菌的獨特蛋白圖譜，但質(zhì)譜儀器昂貴，不利于基層醫(yī)院應(yīng)用推廣。相較于傳統(tǒng)血培養(yǎng)真菌鑒定，PNA-FISH技術(shù)可提前2 d完成微生物鑒定，MALDI-TOF MS可縮短1 d的鑒定時間。此外，針對臨床常見混合感染，有學(xué)者研究報道多重PNA探針成功應(yīng)用的案例[17]，而MALDI-TOF MS分析及傳統(tǒng)鑒定均需分離出單個菌落，鑒定耗時長。PNA-FISH技術(shù)不僅具有明顯的時間優(yōu)勢，且鑒定結(jié)果具備形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)的雙重保證。但由于本實驗是手工操作，尚存在成本較高、通量低的缺點，后期可結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)[18]、微流控[19]等方法或采用細(xì)胞形態(tài)動力學(xué)的Accelerate Pheno自動檢測系統(tǒng)[20]，提高樣本檢測通量、降低成本以及進(jìn)一步縮短鑒定時間，具有較好的臨床應(yīng)用前景。盡管分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用廣泛，但傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)方法，如革蘭氏染色鏡下結(jié)果和平板菌落生長觀察仍然不容忽視。

綜上所述，PNA-FISH方法鑒定白念珠菌，設(shè)備簡單，鑒定結(jié)果可靠，相較于傳統(tǒng)鑒定方法和MALDI-TOF MS方法，鑒定時間顯著縮短，有較好的臨床應(yīng)用前景。