人膠質(zhì)瘤中HIF1A和MAGED4的表達(dá)及調(diào)控關(guān)系初探

王 平， 閉水清， 劉 暢， 農(nóng)蔚霞， 鄒小瓊， 薛春紅， 王燕靖， 李 楓， 張慶梅， 謝小薰

膠質(zhì)瘤是人類(lèi)原發(fā)性惡性腦腫瘤中最常見(jiàn)的類(lèi)型，根據(jù)其惡性程度的不同，可以分為低級(jí)別膠質(zhì)瘤(low-grade glioma,LGG)和高級(jí)別膠質(zhì)瘤(high grade glioma,HGG)。盡管有包括手術(shù)聯(lián)合放化療等一系列綜合治療方案，但患者的總體預(yù)后仍較差，尤其是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma,GBM)患者[1]。腫瘤的高度增殖狀態(tài)導(dǎo)致腫瘤組織處于缺氧的微環(huán)境狀態(tài)，目前研究認(rèn)為缺氧誘導(dǎo)因子1A(hypoxia-inducible factor 1A,HIF1A)是腫瘤細(xì)胞缺氧反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子[2]。黑色素瘤相關(guān)抗原(melanoma-associated antigen,MAGE)是一個(gè)多基因大家族，其許多成員在正常組織(除睪丸外)中限制性表達(dá)，而在多種腫瘤組織中呈高表達(dá)，被視為腫瘤生物治療的理想靶點(diǎn)[3]。其中，MAGED4作為MAGE家族中的新成員，被認(rèn)為是腫瘤相關(guān)抗原[4]。有研究顯示，MAGED4在乳腺癌[5]、非小細(xì)胞肺癌[6]、口腔鱗癌[7]、肝細(xì)胞癌[8]和結(jié)直腸癌[9]等多種腫瘤中呈高表達(dá)，并認(rèn)為其參與了腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲過(guò)程，與患者預(yù)后不良相關(guān)。HIF1A可以調(diào)控多種因子的表達(dá)，如促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin,EPO)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、葡萄糖載體蛋白1(glucose transporter 1,GLUT1)、乳酸脫氫酶A(lactate dehydrogenase A,LDHA)等[10-11]。但HIF1A與MAGED4之間的關(guān)系尚不明確，本研究旨在分析膠質(zhì)瘤中HIF1A、MAGED4的表達(dá)水平及其臨床意義，并探討二者之間的調(diào)控關(guān)系，為膠質(zhì)瘤的靶向治療提供參考思路?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1生物信息學(xué)資料 通過(guò)基因表達(dá)譜交互式分析(Gene Expression Profiling Interactive Analysis,GEPIA)數(shù)據(jù)庫(kù)[12]分析人膠質(zhì)瘤中MAGED4和HIF1A的mRNA表達(dá)情況?；蛩阉麝P(guān)鍵詞為“HIF1A”“MAGED4”，選擇數(shù)據(jù)來(lái)源為T(mén)CGA、GTEx項(xiàng)目的腫瘤和正常組織樣本數(shù)據(jù)，腫瘤類(lèi)型為L(zhǎng)GG和GBM。共獲取888例樣本數(shù)據(jù)，其中GBM組織163例，LGG組織518例，正常腦組織207例。另外，從中國(guó)膠質(zhì)瘤基因組圖譜(Chinese Glioma Genome Atlas,CGGA)數(shù)據(jù)庫(kù)[13-14]中下載mRNA-seq_693數(shù)據(jù)集及相應(yīng)的臨床信息[15]。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)臨床病理診斷明確為世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)Ⅱ～Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤；(2)患者臨床特征信息完善；(3)年齡不限，性別不限。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)臨床信息數(shù)據(jù)不全者；(2)合并其他惡性疾病者。共納入693例樣本數(shù)據(jù)，合并臨床數(shù)據(jù)與HIF1A mRNA、MAGED4 mRNA表達(dá)水平數(shù)據(jù)，并以中位數(shù)為界將其分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，分析二者與臨床特征之間的關(guān)聯(lián)性。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)和缺氧模型構(gòu)建 選擇人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251、U87-MG，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所并由本實(shí)驗(yàn)室保存。將U87-MG細(xì)胞和U251細(xì)胞置于恒溫培養(yǎng)箱(37 ℃，5% CO2)中，并使用含100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素和10%胎牛血清(加拿大Wisent公司)的DMEM高糖培養(yǎng)基(加拿大Wisent公司)進(jìn)行培養(yǎng)。使用氯化鈷(CAS 7791-13-1,Sigma)構(gòu)建細(xì)胞體外缺氧模型，將氯化鈷溶解于無(wú)菌無(wú)酶水中，配制成10 mmol/L濃度的母液，-20 ℃避光保存。用DMEM完全培養(yǎng)基配制成濃度分別為0 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L、300 μmol/L、400 μmol/L的缺氧培養(yǎng)基用于模擬缺氧環(huán)境。

1.3CCK-8實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期狀態(tài)良好的膠質(zhì)瘤細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，用完全培養(yǎng)基制備成5×103cells/ml的細(xì)胞懸液，接種于96孔板中(100 μl/孔)，24 h后分別更換為含不同氯化鈷濃度的缺氧培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后每孔加入10 μl CCK-8試劑，細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h后使用Sunrise酶標(biāo)儀(奧地利Tecan公司)測(cè)定450 nm處的OD值。

1.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將細(xì)胞種于6孔板中，按照LipofectamineTM3000(美國(guó)Invitrogen公司)轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)將陰性對(duì)照siRNA和HIF1A siRNA分別轉(zhuǎn)染入膠質(zhì)瘤細(xì)胞，并于缺氧培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。HIF1A siRNA和陰性對(duì)照siRNA由生工生物(上海)股份有限公司合成，序列見(jiàn)表1。

表1 siRNA序列

1.5總RNA提取和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcription-quantitative real-time polymerase chain reaction，RT-qPCR)實(shí)驗(yàn) 采用RNA提取試劑盒(南京諾唯贊公司，RC101-01)提取細(xì)胞總RNA。應(yīng)用分光光度計(jì)(北京天根公司)檢測(cè)RNA濃度和吸光度值。采用cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(南京諾唯贊公司，R323-01)將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。應(yīng)用StepOnePlus qPCR儀行RT-qPCR，試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊公司(Q711-02)，反應(yīng)體系：SYBR Green I Master 10 μl，ddH2O 7.2 μl，上、下游引物各0.4 μl，cDNA 2 μl。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性10 s，60 ℃退火和延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)反應(yīng)。以β-actin為內(nèi)參，根據(jù)2-△△Ct法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。引物由生工生物(上海)股份有限公司合成，序列見(jiàn)表2。

表2 RT-qPCR擴(kuò)增引物序列

1.6蛋白免疫印記(Western blot，WB)實(shí)驗(yàn) 依照蛋白提取試劑盒(北京索萊寶公司)說(shuō)明書(shū)步驟提取細(xì)胞總蛋白，測(cè)定蛋白濃度后加入上樣緩沖液，煮沸5 min使蛋白變性，自然冷卻后于-80 ℃保存?zhèn)錂z。將準(zhǔn)備好的蛋白依次通過(guò)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，以及一抗、二抗孵育步驟。應(yīng)用Fluor Chem FC3成像儀進(jìn)行顯影，并使用Image J軟件分析條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參計(jì)算相對(duì)灰度值。HIF1A抗體(36169，CST；1∶1 000稀釋)，MAGED4抗體(sc-393203，Santa Cruz；1∶200稀釋)，β-actin抗體(15G5A11/E2，ThermoFisher Scientific；1∶2 000稀釋)，兔抗小鼠二抗(ab6728，Abcam；1∶5 000稀釋)，山羊抗兔二抗(ab6721，Abcam；1∶5 000稀釋)。

2 結(jié)果

2.1膠質(zhì)瘤組織中HIF1A mRNA和MAGED4 mRNA表達(dá)情況 基于GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)的分析結(jié)果顯示，LGG和GBM組織的HIF1A mRNA和MAGED4 mRNA水平均高于正常腦組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1。基于CGGA數(shù)據(jù)庫(kù)的分析結(jié)果顯示，MAGED4 mRNA表達(dá)水平與HIF1A mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.322，P=0.000)。

注：經(jīng)成組t檢驗(yàn)，*P<0.05

2.2HIF1A mRNA和MAGED4 mRNA表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤患者臨床特征指標(biāo)的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果 MAGED4 mRNA高表達(dá)組年齡≤40歲、異檸檬酸脫氫酶(isocitrate dehydrogenase，IDH)突變型的人數(shù)比例大于MAGED4 mRNA低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，兩組性別、腫瘤類(lèi)型、WHO腫瘤分級(jí)，O6-甲基鳥(niǎo)瞟-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(O6-methylguanie-DNA methyltransferase,MGMT)啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)、1p/19q共缺失情況比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。HIF1A mRNA表達(dá)水平與以上臨床指標(biāo)均無(wú)顯著關(guān)聯(lián)性(P>0.05)。見(jiàn)表3，4。

表3 MAGED4 mRNA表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤患者臨床特征指標(biāo)的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果[n(%)]

表4 HIF1A mRNA表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤患者臨床特征指標(biāo)的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果[n(%)]

2.3膠質(zhì)瘤細(xì)胞體外缺氧模型構(gòu)建結(jié)果 經(jīng)含不同濃度氯化鈷的缺氧培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后，CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與氯化鈷濃度0 μmol/L相比，U87-MG細(xì)胞和U251細(xì)胞分別在氯化鈷濃度為100 μmol/L和300 μmol/L時(shí)細(xì)胞活性最高，且隨著氯化鈷濃度繼續(xù)上升，細(xì)胞活性下降。故選擇100 μmol/L作為U87-MG細(xì)胞的最佳造模濃度，選擇300 μmol/L作為U251細(xì)胞的最佳造模濃度。見(jiàn)圖2。

圖2 不同濃度氯化鈷的缺氧培養(yǎng)基對(duì)U87-MG和U251細(xì)胞活性的影響圖

2.4缺氧條件下沉默HIF1A對(duì)MAGED4表達(dá)的影響 將HIF1A siRNA轉(zhuǎn)染至U87-MG和U251細(xì)胞，并在缺氧條件下培養(yǎng)48 h，RT-qPCR結(jié)果顯示，HIF1A mRNA表達(dá)下調(diào)后，MAGED4 mRNA表達(dá)水平也顯著下降(P<0.05)。見(jiàn)圖3。WB結(jié)果也顯示，HIF1A蛋白表達(dá)下調(diào)后，MAGED4蛋白表達(dá)水平也顯著下降(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

圖3 下調(diào)膠質(zhì)瘤細(xì)胞HIF1A mRNA表達(dá)后MAGED4 mRNA表達(dá)變化圖

圖4 下調(diào)膠質(zhì)瘤細(xì)胞HIF1A蛋白后MAGED4蛋白表達(dá)變化圖

3 討論

3.1研究表明，膠質(zhì)瘤占惡性腦腫瘤的75%，其中一半以上是GBM，多數(shù)GBM患者生存期不到1年[16]。目前膠質(zhì)瘤的治療標(biāo)準(zhǔn)方案是最大限度地切除腫瘤和術(shù)后放化療，但膠質(zhì)瘤浸潤(rùn)性的特征使得手術(shù)有時(shí)不能完全切除所有腫瘤組織，殘留的腫瘤可能引起術(shù)后復(fù)發(fā)。隨著研究的進(jìn)展，越來(lái)越多的研究證明膠質(zhì)瘤基因型可提供更準(zhǔn)確的診斷、預(yù)后策略。腫瘤分子靶向治療作為發(fā)展中的新輔助治療方法受到越來(lái)越多的關(guān)注，基于膠質(zhì)瘤特異性分子的靶向治療可能使患者在手術(shù)和輔助放化療之外獲得更佳的預(yù)后，而發(fā)掘有效的膠質(zhì)瘤特異性分子是腫瘤靶向治療的前提。

3.2已有研究鑒定出了MAGED4相關(guān)的HLA-A*25限制性抗原肽[17]。此外，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)MAGED4特異性的T淋巴細(xì)胞能殺傷MAGED4陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞[18]。本課題組前期的研究也發(fā)現(xiàn)，MAGED4與膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲密切相關(guān)[19]，并與冠狀蛋白樣肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白1C(coronin 1C,CORO1C)、細(xì)胞分裂周期因子25A(cell division cycle 25A,CDC25A)等多種腫瘤相關(guān)分子之間存在調(diào)控關(guān)系[20]，其表達(dá)可受p53、特異性蛋白1(specificity protein 1,SP1)等轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)[21]。這些結(jié)果都提示MAGED4屬于膠質(zhì)瘤特異性的分子，具有成為膠質(zhì)瘤靶向免疫治療的潛能，而探究膠質(zhì)瘤中MAGED4的表達(dá)調(diào)控關(guān)系，尋找消除膠質(zhì)瘤中MAGED4異質(zhì)性表達(dá)方法尤為關(guān)鍵。

3.3HIF1最早于20世紀(jì)90年代由Semenza等[22]在缺氧處理的肝癌細(xì)胞株中發(fā)現(xiàn)。HIF1由HIF1A和HIF1B兩個(gè)亞基組成，其中HIF1A是功能性亞基，決定HIF1的活性[23]，在常氧狀態(tài)下，HIF1A可通過(guò)泛素-蛋白酶體降解途徑降解；在缺氧條件下HIF1A穩(wěn)定存在。HIF1B作為結(jié)構(gòu)性亞基，不受氧的調(diào)節(jié)[24]。氯化鈷中的Co2+能置換催化基團(tuán)上的Fe2+，從而阻斷泛素-蛋白酶體降解途徑，抑制HIF1A的降解[25]。本研究中使用氯化鈷模擬了細(xì)胞體外缺氧環(huán)境，并通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)篩選出最佳的氯化鈷濃度，發(fā)現(xiàn)低濃度的氯化鈷模擬缺氧可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的活性，而高濃度的氯化鈷可能因藥物毒性作用而抑制細(xì)胞的活性。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展涉及到多種調(diào)控機(jī)制的相互作用，其中HIF1A是腫瘤缺氧信號(hào)通路的中樞調(diào)節(jié)因子[25-27]，可作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)多種基因的轉(zhuǎn)錄，這些下游的靶基因參與了血管新生、糖酵解、紅細(xì)胞生成，以及細(xì)胞增殖、遷移、侵襲等多種細(xì)胞功能。雖然目前已發(fā)現(xiàn)了大量的HIF1A下游靶基因，但在膠質(zhì)瘤中HIF1A相關(guān)的診斷、預(yù)后標(biāo)志物以及潛在的靶向治療靶點(diǎn)仍有待進(jìn)一步發(fā)掘。

3.4本研究通過(guò)GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)HIF1A mRNA和MAGED4 mRNA在膠質(zhì)瘤中均呈高表達(dá)。分析CGGA數(shù)據(jù)庫(kù)的臨床數(shù)據(jù)資料發(fā)現(xiàn)，MAGED4 mRNA的表達(dá)與患者年齡、IDH突變相關(guān)，但與性別、腫瘤類(lèi)型、WHO腫瘤分級(jí)、MGMT啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)等無(wú)顯著關(guān)聯(lián)。根據(jù)2021年WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類(lèi)[28]，該結(jié)果可能提示MAGED4的表達(dá)與膠質(zhì)瘤的分型相關(guān)，但仍有待進(jìn)一步研究。HIF1A與患者年齡、性別、樣本類(lèi)型、WHO腫瘤分級(jí)、IDH突變等均無(wú)顯著關(guān)聯(lián)，這可能因?yàn)镠IF1A的表達(dá)主要與組織缺氧程度相關(guān)，但可能也與收集到的樣本量有限有關(guān)，有待進(jìn)一步探索。另外，基于公共數(shù)據(jù)的分析結(jié)果顯示，MAGED4 mRNA與HIF1A mRNA的表達(dá)呈正相關(guān)，而這也在本研究的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中得到驗(yàn)證。由此推測(cè)，膠質(zhì)瘤中MAGED4的表達(dá)與缺氧密切相關(guān)，可能是HIF1A的潛在下游靶基因，調(diào)控MAGED4的表達(dá)可能會(huì)影響膠質(zhì)瘤患者的疾病進(jìn)展，為膠質(zhì)瘤的的分子靶向治療提供了潛在的靶點(diǎn)。

本研究雖然發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中HIF1A可以調(diào)控MAGED4的表達(dá)，但是本研究?jī)H進(jìn)行了體外的初步驗(yàn)證，今后還需從體內(nèi)外進(jìn)一步研究二者的相關(guān)性及對(duì)具體的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行探索。