孫 娥，閆文萍，余宏強，趙 丹，朵 虎，左存武*

(1 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，蘭州 730070；2 臨澤縣林業(yè)和草原局，甘肅張掖 734200)

腐爛病俗稱“爛皮病”、“臭皮病”，由腐生真菌黑腐皮殼菌(Valsamali)引起，是蘋果和梨生產(chǎn)中的重大真菌性病害[1]。腐爛病病原菌是蘋果和梨樹上的習(xí)居菌，主要以菌絲、子座及孢子角在田間病株(病斑)及病殘體上越冬；從分生孢子器滲出的分生孢子可持續(xù)一年，甚至在冬季樹皮潮濕時也會發(fā)生，分生孢子感染果樹后可在一年中的不同時間誘發(fā)樹體腐爛病變，特別是在冬季。故初冬修剪可能會促進果樹被黑腐皮殼菌感染，加速該病害在田間的傳播[2]。生產(chǎn)中常采用刮除發(fā)病組織并涂抹化學(xué)藥劑來防治該病，但在大面積推廣應(yīng)用時該方法仍存在勞動力投入成本高等限制因素故無法有效防治。此外，因病斑皮層外緣木質(zhì)部帶菌深度可達1.5 cm致防治過程中刮除不干凈導(dǎo)致復(fù)發(fā)[3]，增大防控難度。目前抗性育種已成為蘋果和梨育種中最為有效且環(huán)保的方法，但育種進程仍受限于育種周期長、抗性育種材料稀缺和抗病機理研究不深入等因素。

長期進化的過程中，植物為抵御病原微生物入侵在體內(nèi)形成了復(fù)雜的免疫系統(tǒng)。首先，當(dāng)植物遭遇病原侵襲后，病原體相關(guān)的分子模式(pathogen associated molecular patterns，PAMPs)可被植物細(xì)胞膜上的模式識別受體(pattern recognition receptor，PRRs)所識別，激發(fā)第一層免疫反應(yīng)，即PAMP激發(fā)的免疫反應(yīng)(PAMPs triggered immunity，PTI)[4]。為有效侵染植物，病原物可分泌寄主特異效應(yīng)子(effectors)抑制植物PTI反應(yīng)，其信號可被位于寄主胞質(zhì)的抗性基因識別，引發(fā)效應(yīng)子激發(fā)的免疫反應(yīng)(effector triggered immunity，ETI)[5-6]。此后，誘發(fā)植物整體的抗性反應(yīng)，稱為系統(tǒng)獲得抗性(systemic acquired resistance，SAR)反應(yīng)[7]。正常條件下，植物需要依靠PTI和ETI共同作用來檢測入侵病原菌并激活植物體內(nèi)防御機制，且PTI和ETI反應(yīng)的進行都需要PTI和ETI中的重要成分來實現(xiàn)更強的植物防御[8]。除此之外，植物激素、活性氧(reactive oxygen species，ROS)、鈣離子等多種信號分子也參與調(diào)控植物的免疫反應(yīng)。其中，水楊酸(salicylic acid，SA)和ROS分別是啟動植物SAR和局部細(xì)胞超敏反應(yīng)(hypersensitivity reaction，HR)的重要信號物質(zhì)，貢獻于植物對寄生菌的抗性[9]。腐生致病菌侵染植物過程中，茉莉酸(jasmonic acid，JA)和乙烯(Ethylene，ET)信號及WRKY轉(zhuǎn)錄因子也被激活，調(diào)控植物對腐生菌的免疫反應(yīng)[10-11]。近年來還發(fā)現(xiàn)植保素、胼胝質(zhì)等多種具有物種特異性的次生代謝產(chǎn)物都具有廣譜抑菌活性并積極參與植物的生物防御響應(yīng)[12]。

模式植物中，已陸續(xù)鑒定出多種免疫信號通路的Marker基因，為研究寄主對特定病原菌的抗性機制提供了極大的方便。NPR1(nonexpressor of pathogenesis related genes 1)蛋白和PR(Pathogenesis-Related)蛋白作為SAR信號傳導(dǎo)途徑上的關(guān)鍵調(diào)控因子，是調(diào)節(jié)植物抗病性的重要基因，故在判斷植物體內(nèi)SAR反應(yīng)是否被激活時可通過檢測NPR1、PR1、PR2、PR4和PR5等Marker基因的表達量來判斷[13-15]。此外，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)免疫反應(yīng)中多種信號分子的Marker基因，如PR1(或PR5)、ACS1或ACS6(arabidopsis cysteine synthase 1 or 6)、LOX1、EDS1(enhanced disease susceptibility 1)和RboHD(respiratory burst oxidase homologue D)分別可作為SA、ET、JA、抗性基因和ROS的Marker基因[16-18]。但Marker基因在非模式植物中的應(yīng)用仍不夠廣泛。本研究結(jié)合同源序列檢索、保守區(qū)域篩選和表達驗證篩選了免疫反應(yīng)中重要信號通路的Marker基因，并對上述基因在抗性資源杜梨和東北山荊子響應(yīng)腐爛病過程中的表進行達分析。

1 材料和方法

1.1 材 料

杜梨和東北山荊子懸浮細(xì)胞為本實驗室經(jīng)愈傷組織誘導(dǎo)后懸浮培養(yǎng)獲得。蘋果和梨腐爛病病原菌菌株Vm-A-003、Vp-P-002均由本實驗室分離獲得，經(jīng)分子鑒定確定為典型的蘋果和梨腐爛病菌[19]。將菌株分別接種至PDA(potato dextrose agar)培養(yǎng)基，活化培養(yǎng)4 d后，各菌株分別取10個菌餅接種至100 mL PDB(potato dextrose broth)液體培養(yǎng)基，黑暗、靜置培養(yǎng)3 d，經(jīng)離心和過濾除菌，獲得菌株代謝物。

收集杜梨和東北山荊子懸浮細(xì)胞，利用40目細(xì)胞過濾去除大細(xì)胞團，收集并取500 μL小細(xì)胞團(細(xì)胞密實體積)轉(zhuǎn)入至16 mL MS液體培養(yǎng)基，黑暗、25 ℃、120 r/min懸浮培養(yǎng)48 h備用。激素處理：懸浮細(xì)胞中分別加入JA和SA溶液，終濃度為50 μmol/L。腐爛病菌代謝物處理：取Vm和Vp代謝物原液各4 mL，分別加入至東北山荊子和杜梨懸浮細(xì)胞，終濃度為20%(V/V)。對照組細(xì)胞中，用MS液體培養(yǎng)基代替腐爛病菌代謝物原液或激素溶液。于處理1、3和6 h后，收集對照和處理組細(xì)胞用于基因表達分析。以上試驗設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2 方 法

1.2.1 序列檢索及多序列比對通過查閱文獻，確定擬南芥、煙草等模式植物中抗性反應(yīng)關(guān)鍵通路的Marker基因。根據(jù)基因登錄號在擬南芥在線信息資源(Arabidopsis information resource，TAIR，http:// www. arabidopsis. org)或美國國立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)下載目標(biāo)基因的CDS序列。將序列依次輸入至薔薇科基因組在線數(shù)據(jù)資源(Genome database of rosaceae species，GDR，https://www.rosaceae.org/)進行序列比對，獲得各候選基因在蘋果(Malusdomestica)、山荊子(Malusbaccata)、西洋梨(Pyruscommunis)和杜梨(Pyrusbetulifolia)基因組中的同源基因。將各目標(biāo)基因在以上4個物種中的同源基因進行多序列比對，獲得保守區(qū)域。將各目標(biāo)基因同源序列的保守區(qū)域輸入至在線軟件Primer 3(http://primer3.ut.ee/)進行實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)引物設(shè)計。

1.2.2 表達分析樣品RNA提取采用RNAout試劑盒(160906-50，Tiandz，北京)，凝膠電泳和超微量分光光度計進行RNA質(zhì)量檢測。取1 μg RNA，采用試劑盒Prime S-cript TM RT reagent Kit with gDNA Eraser(RR047，TaKaRa，大連)進行cDNA合成。利用SYBR Green Pro Taq HS預(yù)混型qPCR試劑盒在實時熒光定量PCR(RT-qPCR)儀(Mx3005p，Stratagene，美國)上進行基因表達的定量分析。內(nèi)參基因Actin引物參考Zuo等[20]的報道，反應(yīng)結(jié)束后分析熒光值變化曲線及熔解曲線，并采用2-ΔΔCT計算基因的相對表達量。

1.2.3 ROS測定取對照和不同處理細(xì)胞，分別用10 μmol/L的ROS特異熒光染料H2DCFDA溶液在37 ℃黑暗中孵育10 min，然后對標(biāo)記后的細(xì)胞利用多功能酶標(biāo)儀(TECAN，Spark，瑞士)對ROS進行定量分析。測定激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為488和525 nm。

1.3 統(tǒng)計分析

原始數(shù)據(jù)用Excel整理，差異顯著性分析用T-test(P<0.05)法，圖形可視化采用軟件OriginPro 8.0進行，所有數(shù)值均表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列篩選及保守區(qū)域確定

經(jīng)檢索文獻[16-18,21-22]初步確定來自擬南芥、煙草等模式植物共15個基因，涉及SA、ET、JA、PTI、SAR、ROS、R基因、防御相關(guān)和植保素等9個免疫反應(yīng)相關(guān)的信號通路(表1)。通過多序列比對和保守結(jié)構(gòu)域分析從蘋果、山荊子、西洋梨和杜梨基因組中均獲得以上基因的同源基因，序列相似性均在71.53%～96.00%之間，且含有相同的保守結(jié)構(gòu)域。

表1 目標(biāo)基因的同源基因

2.2 序列比對和引物設(shè)計

為獲得在蘋果和梨中通用的引物，將來自4個物種的同源基因進行多序列比對，在保守區(qū)域設(shè)計備用引物2對。對來自各處理樣品不同濃度的cDNA進行了熒光定量發(fā)現(xiàn)，各基因在5倍稀釋液(100 ng·μL-1)時Cq值均介于18～25(圖1)，以cDNA 5倍稀釋液(100 ng·μL-1)為模板，對所有引物進行了擴增，確定擴增效率較高的引物15對(圖2，表2)。

表2 目標(biāo)基因所用引物

圖1 不同cDNA濃度下Marker基因的表達

圖2 Marker基因PCR擴增膠圖

2.3 SA和JA通路Marker基因表達

圖3顯示，JA和SA誘導(dǎo)后，各處理均可誘導(dǎo)各自通路Marker基因上調(diào)表達。SA處理后，該通路Marker基因CHN50和ChiV在杜梨和東北山荊子懸浮細(xì)胞均為上調(diào)表達(圖3，A、B)，且隨著處理時間的增加，CHN50和ChiV在2個物種中的相對表達模式都為上調(diào)表達趨勢。杜梨細(xì)胞中，SA處理可致CHN50和ChiV的表達量上調(diào)至對照的8和5倍(圖3，B)。JA處理后該通路Marker基因都為上調(diào)表達。其中，PR1b在東北山荊子中上調(diào)最為明顯，最高可至對照的181倍(圖3，C)。LOX1和PDF1.2(Plant Defensin 1.2)在杜梨中上調(diào)最為明顯，最高可上調(diào)至對照的585和5 699倍(圖3，D)，且在杜梨中上述基因的表達遠(yuǎn)高于在東北山荊子中的表達。以上結(jié)果表明，如上2個信號通路候選Marker基因的表達均可被外源信號激活，可作為各自信號通路的Marker基因，同時為其余通路Marker基因的表達提供了可靠性。

* P < 0.05，** P < 0.01表示同時期處理相對于對照的差異顯著水平，下同

2.4 SA處理后SAR通路和R基因的表達模式

由圖4可知，外源SA處理下SAR通路關(guān)鍵基因PR4和R基因EDS1、PAD4(Phytoalexin Deficient 4)在杜梨(圖4，A)和東北山荊子(圖4，B)中相對表達量都呈顯著上升，且表達趨勢幾乎趨于一致。其中，PR4在東北山荊子中的表達量在6 h達到了對照的1 538倍，在杜梨中僅上調(diào)了7.6倍。杜梨中PAD4的表達量在處理6 h時其表達量達到對照的387倍，而在東北山荊子中其表達量最高僅上調(diào)至對照的2.7倍。EDS1在杜梨和東北山荊子中的表達幾乎一致，最大上調(diào)倍數(shù)分別是對照的3.4倍和3.5倍。綜上，所選的SA信號及相關(guān)通路基因的表達可被SA激活，進一步說明所選的Marker基因引物可反映該信號通路是否被激活。

圖4 外源SA處理下SAR和R基因在東北山荊子(A)和杜梨(B)中的表達

2.5 ROS含量測定及通路基因表達驗證

與對照相比，Vp代謝物處理后杜梨懸浮細(xì)胞中ROS的積累呈逐漸上升的趨勢。處理1 h、3 h和6 h時，其信號值分別由對照時的1 689上升至2 313、4 524.8和5 443.8(圖5，A)。此外，Vp代謝物處理還增加了在杜梨細(xì)胞ROS響應(yīng)基因的表達水平。其中，OXI1(oxidative signal-inducible1)的最高表達量達到了對照的25.2倍，APX1(ascorbate peroxidase 1)和TANOX(triticum aestivum NADPH Oxidase)的表達最高僅上調(diào)了對照的5.6和6.3倍(圖5，B)。表明杜梨在受到Vp代謝物脅迫時，會激活體內(nèi)PTI反應(yīng)，進而導(dǎo)致植物體內(nèi)ROS的爆發(fā)。

圖5 腐爛病菌(Vp)代謝物處理下ROS 含量測定(A)及通路相關(guān)基因在杜梨中的表達(B)

2.6 杜梨響應(yīng)腐爛病信號的免疫反應(yīng)相關(guān)基因表達模式

為了解高抗資源杜梨響應(yīng)腐爛病信號的抗性機制，進一步測定了各通路Marker基因在杜梨懸浮細(xì)胞響應(yīng)Vp代謝物過程中的表達模式，發(fā)現(xiàn)各通路Marker基因都呈不同程度上調(diào)表達(圖6)。其中，JA通路中Marker基因PDF1.2和LOX1上調(diào)最為顯著，最高上調(diào)倍數(shù)分別達到對照的369和6 916倍(圖6，A)。防御相關(guān)基因PAL1在處理1 h后表達水平達到了對照的1 072倍，隨后又緩慢降低。SAR通路基因PR4在處理6 h后達到了對照的6 369倍，其表達量相比其他信號通路Marker基因更為顯著(圖6，B)。SA通路中Marker基因ChiV上調(diào)最為明顯，最高表達量在處理3 h后達到了對照的1 718倍(圖6，C)。此外，在Vp代謝物處理下PTI通路Marker基因、R基因和植保素相關(guān)Marker基因也呈上調(diào)表達，但表達量相比其他通路Marker基因相差甚大(圖6，D、E)。以上結(jié)果表明在受到病原微生物侵襲后，主要激活了植物體內(nèi)的SA、JA、SAR和防御相關(guān)信號，繼而抵御病原的進一步入侵。

圖6 腐爛病菌(Vp)代謝物處理下病程相關(guān)基因在杜梨中的表達

3 討 論

本研究結(jié)合同源比對和基因表達分析，篩選出蘋果和梨抗性反應(yīng)相關(guān)信號中的Marker基因及檢測其表達模式的引物。同時，利用如上Marker基因，研究了高抗砧木杜梨對腐爛病菌的防衛(wèi)機制，發(fā)現(xiàn)多個抗性反應(yīng)信號參與其抗病性，且在響應(yīng)腐爛病的過程中呈上調(diào)表達，其中表達量較高的基因有：ChiV、LOX1、PR4和PAL1。

植物在應(yīng)對病原真菌的過程中，許多防御相關(guān)信號通路的Marker基因都參與了植物的抗性反應(yīng)。JA通路防御標(biāo)記基因PDF1.2可增強擬南芥對病原體的抗性[23]，腐生型病原真菌或共生真菌可通過抑制茉莉素途徑、降低茉莉素介導(dǎo)的植物抗性，進而促進腐生型病原真菌的侵染或共生真菌與植物共生[21]；與此同時，茉莉素可通過調(diào)控次生代謝產(chǎn)物的合成和誘導(dǎo)防御基因的表達來調(diào)控植物對腐生真菌的抗性反應(yīng)[24]。煙草在疫霉菌侵染后可誘發(fā)ROS的迸發(fā)和PTI反應(yīng)相關(guān)基因WRKY33和FRK1(Flg22-induced Receptor-like Kinase 1)的表達[25]，ROS在植物與腐生型真菌相互作用過程中也起著關(guān)鍵作用[26]。SAR信號通路基因PR4能夠編碼具有抗真菌活性的蛋白，特別是對鐮刀菌活性的蛋白[27]。EDS1在植物的2層免疫防線中均發(fā)揮著非常重要的作用，尤其在第2層免疫防線中，植物大多數(shù)TIR-NB-LRR(Toll-Interleukin1 Receptor-nucleotide binding-leucine-rich repeat)類抗病基因功能的正常發(fā)揮都需要EDS1的參與[28]。EDS1不僅可以與病原菌效應(yīng)蛋白發(fā)生相互作用，還可以與植物體內(nèi)TIR-NB-LRR類蛋白形成復(fù)合體，從而實現(xiàn)抗病信號通路的正常傳遞[29]。此外，EDS1和PAD4可通過SA依賴性和非依賴性機制對白粉病的抗性做出重大貢獻[30]。本研究對同源性較低的基因(CHN50、PR4和FRK1等)進行了表達驗證，發(fā)現(xiàn)了其與模式植物中相似的表達模式。同時，發(fā)現(xiàn)隨著ROS含量上升，相關(guān)Marker基因的表達量也隨著上升。因此，本實驗所得的基因及相關(guān)引物可準(zhǔn)確反應(yīng)抗性反應(yīng)是否被激活，可作為各自通路的Marker基因。

SA和JA作為植物防御反應(yīng)中的重要信號分子，在植物防御中有著很大的貢獻，且因入侵病原體的不同防御機制不同。研究發(fā)現(xiàn)外源施用防御激素SA或其合成類似物可誘導(dǎo)植物SAR反應(yīng)[31]。本研究結(jié)果顯示當(dāng)外源施加SA后東北山荊子和杜梨中PR4的表達量都呈顯著上調(diào)。另有研究表明，SA信號途徑和JA信號途徑既存在協(xié)同作用，也存在拮抗作用[32]，JA能夠抑制依賴SA途徑標(biāo)志基因PR1的表達[33]。然而，在田間實驗中觀察到，由細(xì)菌性枯萎病菌誘導(dǎo)黃瓜產(chǎn)生JA介導(dǎo)的ISR并不影響SAR標(biāo)志基因PR1的表達[34]。此外，JA作為MeSA上游的信號分子與其協(xié)同激發(fā)SAR反應(yīng)[35]。本實驗結(jié)果顯示，腐爛病菌脅迫時SA通路基因和JA基因表達都呈顯著上調(diào)，并未受到相互抑制。由此可推測，JA和SA在抗病過程中由于它們含量變化的異時性可能產(chǎn)生相互依賴，未發(fā)生JA對SA的抑制作用。

綜上所述，本研究所獲得的15個抗性反應(yīng)Marker基因的引物可用于抗性反應(yīng)的快速分析。此外，響應(yīng)腐爛病信號過程中，抗性砧木杜梨中SA、JA、PTI、SAR、R基因、防御相關(guān)和植保素等多個免疫反應(yīng)被激活，推斷這些信號通路可相互作用共同調(diào)節(jié)杜梨對腐爛病的抗性響應(yīng)，但仍需要對這些信號通路基因的生物學(xué)功能及相互間的調(diào)控關(guān)系進行進一步的詳細(xì)研究。