指數(shù)施肥對云曼紅豆杉幼苗活性成分10-DAB及養(yǎng)分累積的影響

孫志鵬，王 剛，武華衛(wèi)，賈 晨，蒲尚饒，羅建勛*

(1 四川省林業(yè)科學(xué)研究院，森林和濕地生態(tài)恢復(fù)與保育四川省重點實驗室，成都 610081；2 國家林業(yè)草原紅豆杉西南工程技術(shù)研究中心，成都 611800)

云曼紅豆杉(Taxusmadia×Taxusyunnanensis‘Yunman’)是人工選育出的紅豆杉優(yōu)良品種(川R-SV-TMTY-008-2018)，枝葉中10-DAB含量(人工半合成紫杉醇的重要原料)可達0.3%以上。因具有較高的藥用價值，近年來對云曼紅豆杉苗木的需求也不斷加大，大力育苗營建云曼紅豆杉藥用原料林就成為緩解10-DAB原料短缺和滿足市場需求的有效途徑。營造高質(zhì)量云曼紅豆杉藥用原料林的基礎(chǔ)是培育優(yōu)良的云曼紅豆杉苗木。研究表明，礦質(zhì)營養(yǎng)的供給是提高苗木質(zhì)量，培育優(yōu)質(zhì)壯苗的重要手段[1-3]。目前，云曼紅豆杉苗木營養(yǎng)供給常采用施入基肥或追肥的方式，這不僅不能滿足苗木在各生長時期的養(yǎng)分需求，還會因不符合養(yǎng)分需求規(guī)律而造成大量浪費。因此，選取合理的施肥方式提高肥料利用效率和提升苗木規(guī)格十分必要[4-5]。

Ingestad等[6]根據(jù)“指數(shù)養(yǎng)分承載理論”提出了指數(shù)施肥的技術(shù)，它與傳統(tǒng)施肥方法相比不僅能滿足各生長階段(特別是速生期)養(yǎng)分需求，促進苗木生長，還能有效增加苗木體內(nèi)養(yǎng)分儲備，增強抗逆性，提升苗木質(zhì)量[7-9]。目前，指數(shù)施肥方法已在杉木[10]、降香黃檀[11]、美國山核桃[12]、納塔櫟[13]、紫椴[14]等樹種中得到研究和應(yīng)用，這些研究大多關(guān)注于苗木生長和養(yǎng)分含量方面，但藥用活性成分及養(yǎng)分累積量對指數(shù)施肥的響應(yīng)特征尚不清楚。目前，紅豆杉中藥用活性成分10-DAB及養(yǎng)分累積對施肥的響應(yīng)特征鮮有研究，指數(shù)施肥對云曼紅豆杉苗期各指標的影響未見報道。因此，本研究以1 年生云曼紅豆杉實生容器苗為試驗對象，考察不同施肥處理對活性成分10-DAB含量及養(yǎng)分累積的影響，以期為云曼紅豆杉苗期養(yǎng)分精準調(diào)控與苗木高效培育提供理論和實踐依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗地概況

試驗地位于四川省都江堰市紅豆杉基地，地處都江堰市南部，距市區(qū)19 km左右。該地海拔700 m左右，屬亞熱帶濕潤季風(fēng)氣候，年均降水量1 243 mm，年均溫17.1 ℃，年均日照時數(shù)1 045 h，無霜期269 d。

1.2 供試材料

試驗所用苗木為“國家林業(yè)草原紅豆杉西南工程技術(shù)研究中心”培育的1年生云曼紅豆杉實生容器苗，育苗容器為無紡布袋(直徑5.5 cm×高9.5 cm)，基質(zhì)為當(dāng)?shù)氐娜劳?。基質(zhì)理化性質(zhì)如下：pH 5.24，有機質(zhì) 28.6 g·kg-1，全氮36.3 g·kg-1，有效磷20.18 mg·kg-1，速效鉀 25.82 mg·kg-1。每個容器種植一株幼苗，為了防止水肥流失，裝填基質(zhì)前在容器內(nèi)套雙層透明塑料袋。2021年4月中旬，選取生長狀況良好、無病蟲害、長勢一致的苗木開展試驗。

1.3 試驗設(shè)計

本試驗采用完全隨機區(qū)組設(shè)計，共設(shè)對照(CK，不施肥)，平均施肥處理AF1、AF2，以及指數(shù)施肥處理EF1、EF2、EF3、EF4，共計7個處理，每個處理設(shè)3次重復(fù)，每個重復(fù)70株云曼紅豆杉容器苗?？紤]云曼紅豆杉生長周期及施肥操作的方便性，于2021年4月15日開始進行施肥，施肥間隔15 d，7月30日結(jié)束。選取通用型肥料普羅丹水溶性復(fù)合肥 (N 20%，P2O520%，K2O 20%)，為方便表達，將施N量作為養(yǎng)分施入量進行表達。

1) 平均施肥(CF)：在相同時間內(nèi)施以等量的肥料。每次施肥量Nt=NT/t(Nt為施肥量，NT為N素總量，t為施肥次數(shù))

2) 指數(shù)施肥(EF)：施肥總量根據(jù)上一年苗木初始養(yǎng)分NS和生長結(jié)束時的養(yǎng)分測定得出。

NT=NS(ert-1)

(1)

式中，NT為N素總量；NS為初始N含量；t為施肥次數(shù)；r為施肥速率。

本試驗參照R.K Dumroese等[15]指數(shù)施肥模型來確定云曼紅豆杉幼苗不同時期 N 素施用量。

Nt=NS(ert-1)-Nt-1

(2)

式中，NS、r 參照式(1)，Nt為在r下的第t次的施氮量，Nt-1為前t-1次施入的氮肥總量。7種處理各時期氮素施用量如表1所示。

表1 不同施肥方式及施肥量云曼紅豆杉 1 年生實生容器苗不同時期 N 素施用量

1.4 測定指標及方法

1.4.1 生長量及枝葉生物量云曼紅豆杉幼苗各生長指標及枝葉生物量自施肥開始至苗木生長結(jié)束，每隔4周測定一次。各施肥處理每個重復(fù)選取5株。苗高、地徑分別采用鋼尺和游標卡尺測量(0.01 cm)；枝葉生物量測定剪取紅豆杉全部枝葉，105 ℃殺青30 min，然后在70 ℃下烘干至恒重，用電子天平(±0.01 g)測其干重。

1.4.2 枝葉中10-DAB含量及其累積量分別于5、7、9、11月中旬測定各施肥處理幼苗枝葉中10-DAB含量，各處理每個重復(fù)選5株，測定方法參照文獻[16]。10-DAB累積量(產(chǎn)量)為枝葉10-DAB含量與枝葉生物量的乘積。

1.4.3 養(yǎng)分質(zhì)量分數(shù)生長季結(jié)束后，各處理每個重復(fù)選取5株生長一致的完整云曼紅豆杉幼苗，帶回實驗室沖洗干凈，分別對根、莖、葉進行105 ℃殺青30 min，并烘干至恒重。全氮、全磷、全鉀測定前樣品采用H2SO4-H2O2消煮，全氮測量采用凱式定氮法[17]，全磷測量采用鉬銻抗比色法[18]，全鉀測量采用火焰分光光度計法[19]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計及顯著性差異分析(Duncan 法進行多重比較)，Origin 2018 進行圖表制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同施肥處理對云曼紅豆杉生長及枝葉生物量的影響

圖1顯示，各施肥處理云曼紅豆杉幼苗苗高、地徑和枝葉生物量均顯著高于對照(CK)，增幅分別為13.39%～32.67%、13.95%～63.59%和23.75%～77.82%。在相同施肥量條件下，指數(shù)施肥EF2處理苗高、地徑和枝葉生物量較AF2分別顯著增加了6.05%、28.62%和13.66%，EF1處理苗高比AF1顯著降低，枝葉生物量則顯著提高，而地徑增加未達顯著水平。EF2處理苗高地基和枝葉生物量均顯著大于AF2(P<0.05)。在指數(shù)施肥處理中，云曼紅豆杉幼苗苗高、地徑和枝葉生物量隨著施肥量的增加呈現(xiàn)先升后降的趨勢，并均在EF2處理達到最高值，其苗高、枝葉生物量顯著大于其他處理(P<0.05)，其地徑僅顯著高于EF4處理。總體而言，各施肥處理均能顯著促進云曼紅豆杉幼苗生長和生物量積累，適量指數(shù)施肥處理(EF2)的生長促進效應(yīng)顯著優(yōu)于相應(yīng)平均施肥處理，但指數(shù)施肥量過高反而會顯著抑制這種促進效應(yīng)。

不同小寫字母表示不同處理間在0.05水平差異顯著(P<0.05)，下同

同時，進一步分析發(fā)現(xiàn)，不同施肥處理云曼紅豆杉幼苗各時期苗高、地徑和枝葉生物量月增長百分比變化基本一致，均表現(xiàn)為緩慢增加→迅猛增加→緩慢增加→停滯的趨勢(圖2)。其中，5月15日至7月15日期間，各處理云曼紅豆杉苗木生長和枝葉生物量累積緩慢增加，苗高增長量以AF1和EF4處理、地徑增長量以EF1和EF2處理、枝葉生物量累積以AF1和EF3處理較大；從7月15日開始，云曼紅豆杉苗木生長進入高峰期，苗高、地徑以及枝葉生物量在7月15日 至 9月15日階段增量均最大，各處理苗高、地徑和枝葉生物量在此期間增長量占比分別為33%～59%、56%～68%和34%～55%；9月15日后各指標的增量逐漸下降，至11月幾乎停止增長。

圖2 不同施肥處理云曼紅豆杉不同時期苗高、地徑和枝葉生物量增長量百分比變化

2.2 不同施肥處理對云曼紅豆杉枝葉中10-DAB含量和積累量的影響

圖3顯示，各施肥處理云曼紅豆杉幼苗枝葉中10-DAB含量均顯著高于同期不施肥對照(CK)。在相同施肥量條件下，各時期幼苗枝葉中10-DAB含量均表現(xiàn)為指數(shù)施肥處理EF1始終高于同期AF1處理，但無顯著差異(P>0.05)，指數(shù)施肥處理EF2除9月份外均顯著高于同期AF2，EF2處理幼苗枝葉中10-DAB含量比AF2增加最大達3.59%。指數(shù)施肥處理中，枝葉中10-DAB含量隨施肥量增加表現(xiàn)為先增加后減少的趨勢，均在EF3處理達到最高，并與FF2以外的其他處理差異顯著，最低的EF4處理均較EF3處理顯著下降，降幅最高達4.72%。同時，各處理枝葉中10-DAB含量隨生長月份表現(xiàn)出相同的變化規(guī)律，即5-9月呈上升趨勢，于9月時達到最高，在11月份又較9月份明顯下降；9月各處理的10-DAB含量分別較5月依次增加了7.99%、8.91%、8.50%、8.20%、5.05%、9.12%和9.57%。

圖3還顯示，各施肥處理云曼紅豆杉幼苗枝葉10-DAB累積量也均顯著大于同期不施肥對照(CK)，各時期均以指數(shù)施肥處理EF2最高，并顯著大于同期其他處理(P<0.05)。在相同施肥量條件下，指數(shù)施肥處理EF1的10-DAB累積量僅在9、11月份比相應(yīng)AF1顯著增加，而指數(shù)施肥處理EF2始終比相應(yīng)AF2顯著增加，增幅為18.14%～25.00%。在指數(shù)施肥處理中，枝葉10-DAB累積量隨施肥量增加而先升后降，并在EF2處理達到最高，且與同期其余處理差異顯著，在5、7、9、11月份分別是最低的EF4處理的1.22、1.20、1.42和1.40倍。另外，各處理枝葉10-DAB累積量隨生長月份的變化均表現(xiàn)為先增加再下降相似變化趨勢，即在5～9月逐漸上升，于9月達到最大值后下降，各處理最大月份10-DAB累積量(9月)分別較最小月份(5月)增加了59.41%、63.28%、81.15%、75.53%、71.21%、72.85%和61.88%。

圖3 不同施肥處理云曼紅豆杉枝葉中10-DAB含量和積累量

以上結(jié)果說明，各施肥處理均能顯著促進云曼紅豆杉幼苗枝葉10-DAB累積，并以指數(shù)施肥處理EF2效果最佳；適宜指數(shù)施肥處理的促進效應(yīng)顯著優(yōu)于相應(yīng)平均施肥處理，但指數(shù)施肥量過高反而會顯著抑制這種促進效應(yīng)；云曼紅豆杉幼苗枝葉10-DAB含量和累積量均在9月份達到最高。

2.3 施肥處理對云曼紅豆杉幼苗器官 N、P、K 含量及分配策略的影響

2.3.1 N、P和K 含量由圖4可知，各施肥處理云曼紅豆杉幼苗根、莖和葉中 N、P、K含量均不同程度地高于不施肥對照(CK)，但各處理N含量增幅較小，僅EF3處理的根、莖和葉和EF4處理根N含量達到顯著水平，而P含量增幅在除AF1處1理外的根、莖以及EF2、EF3、EF4處理的葉中均達到顯著水平，K含量增幅在除AF1處理外的根、莖、葉中均達到顯著水平。在相同施肥量條件下，指數(shù)施肥處理EF1、EF2根、莖和葉中N、P、K含量均不同程度高于相應(yīng)平均施肥處理，但僅部分器官的P、K含量存在顯著差異。在指數(shù)施肥處理中，各處理根系中的N含量以及根、莖和葉的K含量均隨著施肥用量的增加而上升，且EF4處理顯著高于其他處理(P<0.05)；各部位P以及莖和葉中N含量均隨施肥量增加表現(xiàn)出先上升后下降的變化趨勢，且EF3處理顯著大于EF1和EF2處理(P<0.05)。在平均施肥方式中，AF2處理中根、莖和葉中N、P和K含量大于AF1處理，但N含量差異未達到顯著水平。以上結(jié)果表明云曼紅豆杉幼苗各部位對N、P和K養(yǎng)分吸收能力存在差異，指數(shù)施肥下養(yǎng)分吸收效率更高。

圖4 不同施肥處理下云曼紅豆杉幼苗根莖葉的 N、P、K 含量的變化

2.3.2 養(yǎng)分分配策略從圖5可知，各施肥處理云曼紅豆杉幼苗N、P和K在各器官中分配比例均表現(xiàn)為葉>根>莖，N素在根、莖和葉中所占比重分別為13%～20%、4%～13%和72%～81%，P分別為18%～25%、5%～13%和68%～74%，K素分別為11%～19%、3%～9% 和 76%～82%。N、P和K各器官間的分配比例在施肥處理間存在明顯差異，指數(shù)施肥相較平均施肥減少了N和P向根和莖的分配比例，增加了向葉的分配比例。指數(shù)施肥處理中，N、P、K素分配在根和葉中所占比例均隨施肥量增加表現(xiàn)出先增加再減少的變化趨勢，在莖中則表現(xiàn)為下降趨勢；N、P和K在葉占比重最大為EF2處理，在莖中占比重最大為EF1處理，根中占比重最大為EF3處理。

圖5 各施肥處理云曼紅豆杉幼苗N、P、K 含量在各部位的分配

2.3.3 氮、磷、鉀含量的相關(guān)性云曼紅豆杉幼苗各部位N、P和K含量之間存在極強的相關(guān)關(guān)系(圖6)。其中，幼苗根中N含量與其P、K 含量分別呈顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)正相關(guān)，其P含量與K含量呈極顯著正相關(guān)；莖中N含量與P含量、P含量與K含量均呈顯著在相關(guān)；葉中N含量與P、K含量，以及P含量與K含量均呈極顯著正相關(guān)。說明各部位中N與P、P與K以及根、葉中的N與K表現(xiàn)出協(xié)同變化關(guān)系。

圖6 云曼紅豆杉幼苗根、莖和葉中氮、磷、鉀含量間的相關(guān)性分析

3 討 論

藥用植物在施加礦質(zhì)元素時需同時兼顧有效成分的含量與經(jīng)濟產(chǎn)量，科學(xué)合理的施肥可以有效提升藥用植物有效成分的累積[20-21]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，施肥對云曼紅豆杉幼苗枝葉中10-DAB含量有促進作用，與對照相比最高增加了10%以上。礦質(zhì)營養(yǎng)元素不僅是合成次生代謝產(chǎn)物的基礎(chǔ)成分，還是作為關(guān)鍵酶的組分或活化劑參與各種代謝反應(yīng)，影響次生代謝產(chǎn)物的藥效成分組成和含量[22]；同時，施加適宜的礦質(zhì)營養(yǎng)可提高藥用植物品質(zhì)，但養(yǎng)分過度或欠缺施用則不利于紅豆杉幼苗藥效成分的組成和積累，從而降低藥材品質(zhì)[23-24]。本研究結(jié)果也顯示，施氮量小于2 400 mg·株-1或大于3 200 mg·株-1會抑制云曼紅豆杉幼苗枝葉中藥用成分10-DAB合成。在指數(shù)施肥方式下，云曼紅豆杉幼苗枝葉中10-DAB含量隨施肥量增加表現(xiàn)為先上升再降低的趨勢，可能是由于隨施肥量增加，云曼紅豆杉幼苗對礦質(zhì)元素的吸收受抑制，導(dǎo)致次生代謝產(chǎn)物的合成途徑相關(guān)酶基因活性降低，抑制了有效成分10-DAB的合成，該結(jié)果與盧麗蘭等[25]關(guān)于高氮不利于廣蕾香有效成分積累的研究結(jié)果一致。

另外，枝葉生物量可有效反映出苗木積累干物質(zhì)的能力，也是衡量有效成分累積量的重要標準之一[26]。本研究結(jié)果表明，在施肥量適中的情況下，云曼紅豆杉幼苗枝葉生物量表現(xiàn)為指數(shù)施肥 >平均施肥 >CK，這與前人對池杉(Taxodiumascendens)[27]、赤皮青岡(Cyclobalanopsisgilva)[28]、白樺(Betulaplatyphylla)[29]等的研究結(jié)果相一致，表明指數(shù)施肥較平均施肥更能促進云曼紅豆杉幼苗枝葉生物量累積。其原因可能是由于指數(shù)施肥與其他施肥方式相比，能夠較大程度地滿足云曼紅豆杉在不同生長時期對養(yǎng)分的需求，且指數(shù)施肥生長速率穩(wěn)定，更有利于紅豆杉幼苗生長[30-31]；同時云曼紅豆杉幼苗的苗高、地徑對施肥的響應(yīng)與枝葉生物量含量一致，這也表明了在苗木生長發(fā)育過程中，各生長指標之間存在一定協(xié)同性，會相互影響[32]。

實際生產(chǎn)過程中，藥用植物往往很難兼顧有效成分含量與產(chǎn)量，生長分化平衡假說認為，在生長資源匱乏時，植物的生長和分化均減小[33]。在本研究中，云曼紅豆杉枝葉中10-DAB含量最高為EF3處理，枝葉生物量最高為EF2處理，表明枝葉生物量最高的施肥處理，其次生代謝產(chǎn)物含量并不最多，這與生長分化平衡假說一致。綜合本研究中云曼紅豆杉10-DAB含量與枝葉生物量來看，當(dāng)施肥方式為指數(shù)施肥，施肥量為1 600 mg·株-1，生長月份為9～10月份時，此時采收可獲得的10-DAB累積量最高，收益最大。

此外，苗木體內(nèi)的營養(yǎng)元素水平能反映出苗木是否健壯、施肥是否合理[34]。施肥可顯著提高苗木根、莖、葉中的元素累積[35-36]，本研究結(jié)果也證實了這一點，施肥處理EF3云曼紅豆杉幼苗的N、P和K含量最高分別高出對照(CK) 31.27%、288.29%、130.65%。同時，在相同施肥量條件下，指數(shù)施肥處理的云曼紅豆杉幼苗各部位的N、P和K含量均大于相應(yīng)的平均施肥處理，這一結(jié)果與前人關(guān)于指數(shù)施肥可提高苗木養(yǎng)分積累的結(jié)果相一致[37]，其原因是苗木生長后期存在“奢養(yǎng)消耗”現(xiàn)象，指數(shù)施肥處理增加了苗木體內(nèi)更多的養(yǎng)分承載[38]。養(yǎng)分供應(yīng)量不足時，苗木養(yǎng)分含量與養(yǎng)分供給量成正比，但當(dāng)養(yǎng)分供給超過苗木的最佳需求時，養(yǎng)分含量不會繼續(xù)增加，甚至?xí)陆礫39-40]。本研究中，當(dāng)施肥量超過1 600 mg·株-1時，云曼紅豆杉幼苗各部位的P含量以及莖和葉中N含量均出現(xiàn)了下降，而根中的N含量以及各部位的K含量則隨施肥用量的增加而上升，表明云曼紅豆杉幼苗各部位養(yǎng)分吸收能力存在差異，1 600 mg·株-1的施肥用量可能超過了云曼紅豆杉幼苗各部位對P元素以及莖和葉對N元素需求的閾值，這與Malik等[41]和李雙喜等[42]的研究結(jié)果一致。本研究中各施肥處理云曼紅豆杉幼苗中 N、P和K元素含量的分配情況相一致，各部位礦質(zhì)元素含量表現(xiàn)為葉>根>莖，該研究結(jié)果與吳家森等[43]對南方紅豆杉1年生和2年生幼苗的相關(guān)研究結(jié)果相一致，表明葉是養(yǎng)分重要的儲藏器官[44]。本研究中云曼紅豆杉葉片吸收營養(yǎng)元素含量總體呈現(xiàn)出N>K>P的趨勢，表明其對N和K具有高富集特性。此外，有研究表明施加氮素會影響植物對磷鉀的吸收[45]，本研究中云曼紅豆杉幼苗根、莖、葉中N與P、P與K以及根、葉中的N與K呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，表明根和葉中的N、P和K吸收具有協(xié)同作用；而莖中N和K的含量為正相關(guān)(相關(guān)系數(shù)0.614)，但相關(guān)性不顯著(P>0.05)。

綜上所述，施肥顯著促進了云曼紅豆杉幼苗生長、枝葉生物量累積，提高了藥用有效成分10-DAB含量及累積量，促進了器官中營養(yǎng)元素N、P和K的累積；在本試驗條件下，采用指數(shù)施肥方式，施肥量1 600 mg·株-1最有利于云曼紅豆杉幼苗藥用活性成分10-DAB及養(yǎng)分累積。