秦 娣，楊 雪，秦學(xué)林

(1.南京體育學(xué)院 運(yùn)動(dòng)健康學(xué)院，江蘇 南京 210014； 2.江蘇省運(yùn)動(dòng)與健康工程協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210014；3.南京傳奇生物科技有限公司，江蘇 南京 211100)

0 引 言

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是一種原發(fā)性肝癌，是全球常見癌癥之一，主要在亞洲和非洲地區(qū)，在我國(guó)尤為常見[1].HCC的治療包括肝移植、手術(shù)切除、局部消融、經(jīng)動(dòng)脈導(dǎo)管栓塞化療(TACE)、放療、靶向藥物和免疫療法等多種手段[2].盡管隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，這些治療方法取得了很大進(jìn)展，但是HCC仍然是全球第三大癌癥死亡原因，患者生存率低和預(yù)后差的原因是腫瘤復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率較高[1].因此，尋找肝癌診斷或預(yù)后有效的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)具有重要意義.

Fcγ受體(Fc gamma Receptor，F(xiàn)cγR)是所有IgG分子重鏈Fc部分的受體，屬于免疫球蛋白超家族，在人類中含有FcγRI、FcγRII、FcγRIII，在小鼠中還包括FcγRIV[3].人類FcγRII包括FcγRIIA、FcγRIIB和FcγRIIC三個(gè)亞型，小鼠FcγRII僅有FcγRIIB一個(gè)成員.FcγR在功能上分為活化性受體和抑制性受體兩類，其中FcγRIIB是唯一已知的抑制性受體，其胞內(nèi)段的免疫受體酪氨酸抑制基序(Immunoreceptor Tyrosine-based Inhibition Motif，ITIM)發(fā)揮負(fù)向調(diào)節(jié)作用[4].FcγRIIB的兩個(gè)主要變體FcγRIIB1和FcγRIIB2分別在B細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞上高表達(dá)，在巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等白細(xì)胞和其他非白細(xì)胞上也有表達(dá)，F(xiàn)cγRIIB的異常表達(dá)與許多自身免疫性疾病和惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[5-8].

大量流行病學(xué)研究已經(jīng)證實(shí)，多種腫瘤與慢性炎癥有關(guān)，其中HCC是典型代表.機(jī)體在感染因素，例如乙型或丙型肝炎病毒的慢性感染以及非感染因素如黃曲霉毒素暴露、酒精、非酒精性脂肪沉積等長(zhǎng)期刺激下，形成慢性炎癥，炎癥持續(xù)破壞肝細(xì)胞，加快肝細(xì)胞基因突變，從而誘發(fā)癌變[9].然而，慢性炎癥和肝癌之間的分子機(jī)制尚未完全清楚.鑒于FcγRIIB是人和小鼠體內(nèi)唯一的抑制性FcγR，具有抑制炎性反應(yīng)作用，因此，本研究檢測(cè)了FcγRIIB在肝癌中的表達(dá)，為肝癌診斷或預(yù)后提供新的生物標(biāo)志物，并為進(jìn)一步揭示FcγRIIB在肝癌中的作用以及深入研究肝臟炎癌轉(zhuǎn)化的調(diào)控機(jī)制提供潛在靶點(diǎn)和理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 生物信息學(xué)分析

HCC的RNASeq數(shù)據(jù)來源于腫瘤基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA).微陣列中的數(shù)據(jù)基于Affymetrix平臺(tái)，并從基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)(Gene Expression Omnibus，GEO)GSE14520下載.利用Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)分析HCC和正常肝組織中FcγRIIB mRNA的表達(dá)水平，搜索參數(shù)如下：“FcγRIIB”、“癌癥和正常分析”、“肝細(xì)胞癌”和“mRNA”.

1.2 臨床樣本

12例肝癌患者的癌巢、癌旁、無明顯病變的肝組織標(biāo)本，12例血管瘤患者的肝組織標(biāo)本，均取自南京鼓樓醫(yī)院.標(biāo)本取出后，立即將其在液氮中保存 30 min 以上，并轉(zhuǎn)移到 -80 ℃ 超低溫冰箱中長(zhǎng)期儲(chǔ)存.所有患者均簽署了知情同意書，醫(yī)院倫理委員會(huì)審查委員會(huì)批準(zhǔn)了該研究.

1.3 小鼠肝細(xì)胞癌模型

C57BL/6野生型小鼠，6～8周齡，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司.動(dòng)物飼養(yǎng)在中國(guó)藥科大學(xué)新藥安全評(píng)價(jià)研究中心SPF動(dòng)物房.小鼠繁殖后，在2周齡時(shí)腹腔注射 25 mg/kg N-亞硝基二乙胺(DEN)(Sigma公司).注射DEN后8個(gè)月，小鼠被頸椎脫位處死后取肝臟.

1.4 實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)

在NCBI中找到各個(gè)目的基因的編碼序列，利用Beacon designer軟件設(shè)計(jì)引物，并在NCBI基因上進(jìn)行驗(yàn)證，各個(gè)目的基因引物序列見表1.上述臨床組織樣本和小鼠肝組織勻漿后，采用Trizol試劑(Takara，RNAiso Plus，貨號(hào)9109)提取總RNA.運(yùn)用PrimeScriptTMRT試劑盒(Takara，貨號(hào)RR047A)生成cDNA.使用TB Green Real-time Master Mix(Takara, 貨號(hào)RR420A)在Applied Biosystems StepOne儀器(Bio-rad)上運(yùn)行qRT-PCR.通過雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算mRNA表達(dá).

表1 基因引物序列

續(xù)表1

1.5 蘇木精-伊紅(H&E)染色

小鼠新鮮肝組織在4%多聚甲醛溶液中固定 24 h 以上，水沖洗組織塊除去固定劑，組織置于梯度濃度乙醇后，在二甲苯和蠟中滲透.組織經(jīng)過包埋、修剪、切片、干燥后完成石蠟切片.將石蠟切片浸泡在二甲苯和酒精中，蘇木精染色 5 min，伊紅染色 3 min，然后重新浸泡在酒精和二甲苯中.載玻片用合成樹脂固定，顯微鏡下觀察結(jié)果并拍照.

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

統(tǒng)計(jì)分析采用GraphPad Prism 5的t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié) 果

2.1 生物信息學(xué)分析顯示FcγRIIB在HCC中低表達(dá)

TCGA和GSE14520數(shù)據(jù)庫(kù)用于分析HCC、正常肝組織中FcγRIIB和其他FcγRs mRNA的表達(dá).在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中，比較374例HCC組織和50例正常組織，結(jié)果顯示，HCC組織中FcγRIIB的表達(dá)明顯低于正常組織(圖1a).通過比較225例HCC組織和220例正常組織，在GSE14520數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)現(xiàn)類似結(jié)果(圖1a).HCC組織和正常組織之間，F(xiàn)cγRI、FcγRIIA和FcγRIII的表達(dá)水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1b).

(a)TCGA和GSE14520數(shù)據(jù)庫(kù)分析HCC組織和 (b) TCGA和GSE14520數(shù)據(jù)庫(kù)分析HCC組織和正常肝正常肝組織中FcγRIIB的表達(dá)組織中FcγRI、FcγRIIA、FcγRIII的表達(dá)*P<0.05，***P<0.001，ns：無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異圖1 TCGA和GSE14520數(shù)據(jù)庫(kù)分析HCC組織和正常肝組織中FcγRs mRNA的表達(dá)Fig.1 Analysis of FcγRs mRNA expression in HCC and normal liver tissue by TCGA and GSE14520 databases

通過Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)cγRIIB的下調(diào)也見于其他腫瘤，例如結(jié)直腸癌、白血病和肺癌等(圖2a).在Roessler和Wurmbach肝臟數(shù)據(jù)集中發(fā)現(xiàn)，與正常肝組織相比，HCC組織中FcγRIIB mRNA水平顯著降低(圖2b).

(a)各種腫瘤和相應(yīng)正常對(duì)照組織中FcγRIIB表達(dá)的比較 (b)HCC組織和正常肝組織中FcγRIIB的表達(dá)***P<0.001圖2 Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)分析HCC中FcγRIIB mRNA的表達(dá)Fig.2 Analysis of FcγRIIB mRNA expression in HCC by Oncomine databases

2.2 臨床HCC組織中FcγRIIB表達(dá)降低

通過qRT-PCR檢測(cè)臨床HCC患者的癌巢、癌旁組織和無明顯病變的肝組織樣本中FcγRs的表達(dá)水平，將臨床血管瘤患者的肝組織樣本作為另一個(gè)對(duì)照.如圖3a所示，與癌旁和非病理性肝組織相比，癌巢中FcγRIIB1和FcγRIIB2的表達(dá)水平顯著降低，與血管瘤肝組織相比，癌巢中FcγRIIB2的表達(dá)顯著下調(diào).FcγRI、FcγRIIA和FcγRIII的表達(dá)在各組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖3b).

(a) 臨床HCC組織中FcγRIIB1、FcγRIIB2的表達(dá)

2.3 DEN誘導(dǎo)小鼠肝癌模型中FcγRIIB表達(dá)下調(diào)

DEN注射后8個(gè)月，小鼠肝臟有明顯的腫瘤結(jié)節(jié)(圖4a).H&E染色顯示，模型組肝組織具有明顯的癌變特征，細(xì)胞壞死，細(xì)胞核大而深，核質(zhì)比例增加，非典型細(xì)胞增多(圖4b).qRT-PCR檢測(cè)DEN誘導(dǎo)小鼠肝癌模型中FcγRIIB mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示，與正常肝組織相比，模型組肝組織中FcγRIIB的表達(dá)顯著下調(diào)(圖5).對(duì)照組和模型組之間FcγRIII和FcγRIV的表達(dá)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.

(a) 肝臟腫瘤結(jié)節(jié)的觀察 (b) 肝組織H&E染色圖4 DEN誘導(dǎo)小鼠肝細(xì)胞癌Fig.4 Induction of HCC in mouse by DEN

***P<0.001，**P<0.01圖5 qRT-PCR檢測(cè)DEN誘導(dǎo)小鼠肝癌模型中FcγRIIB mRNA的表達(dá)Fig.5 Detection of FcγRIIB mRNA expression in DEN-induced mouse HCC model by qRT-PCR

3 討 論

長(zhǎng)期以來，慢性炎癥一直被視為促發(fā)癌癥的一個(gè)關(guān)鍵風(fēng)險(xiǎn)因素，慢性炎癥增加了患腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)并促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移[10-11].HCC的發(fā)生是一個(gè)多步驟多節(jié)點(diǎn)的過程，病毒感染、肝臟毒性藥物、代謝紊亂等多種危險(xiǎn)因素導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷或死亡，肝臟中免疫細(xì)胞活化，誘發(fā)肝臟遷延不愈的慢性非可控性炎癥，引起肝細(xì)胞失控的代償性增殖修復(fù)，癌細(xì)胞產(chǎn)生的幾率增加，最終導(dǎo)致肝臟炎癌轉(zhuǎn)化[12-13].據(jù)報(bào)道，鋅指轉(zhuǎn)錄因子Miz1在HCC小鼠模型和相當(dāng)一部分HCC患者中下調(diào)，產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子等，使腫瘤浸潤(rùn)巨噬細(xì)胞的極化偏向促炎表型，從而促進(jìn)HCC[14].該研究表明，慢性炎癥在HCC中起到核心作用.

FcγR家族最重要的功能之一是在同一細(xì)胞上共同表達(dá)活化性受體和抑制性受體，共同設(shè)定免疫細(xì)胞活化閾值.活化性FcγR很多，例如人的FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIC、FcγRIII和小鼠的FcγRI、FcγRIII、FcγRIV.活化性受體通過免疫受體酪氨酸活化基序(Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif，ITAM)傳遞信號(hào)，促進(jìn)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)、抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的吞噬作用(ADCP)、抗原抗體免疫復(fù)合物(IC)的內(nèi)吞作用和炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生等[15].人和小鼠均只有一種抑制性FcγR，即FcγRIIB，F(xiàn)cγRIIB能夠調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和細(xì)胞因子釋放.Kovacs等人[16]研究表明，F(xiàn)cγRIIB在一種自身免疫性皮膚病即獲得性大皰性表皮松解癥(EBA)模型中能夠抑制皮膚炎癥，保護(hù)皮膚免受中性粒細(xì)胞的早期浸潤(rùn)和激活.張唯等人[17]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)cγRIIB-/-小鼠與FcγRIIB+/+小鼠相比，血清中炎性因子TNF-α、IL-6和IFN-γ水平明顯升高，脂肪組織巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)顯著增加，M1型極化基因TNF-α、MCP-1增加，表明敲除FcγRIIB加重高脂飲食誘導(dǎo)下的小鼠全身及脂肪組織局部炎癥反應(yīng).Akyol等人[18]研究表明，小鼠腦出血后，靜脈注射免疫球蛋白(IVIG)通過激活FcγRIIB-SHIP1-PIP3通路減弱腦出血誘導(dǎo)的肥大細(xì)胞激活，從而抑制腦炎癥，減輕腦水腫，改善腦出血后的神經(jīng)功能.Pandey等人[19]發(fā)現(xiàn)，由過敏原和過敏原特異性IgG形成的免疫復(fù)合物(IgG1-IC)與FcγRIIB結(jié)合抑制了C5a介導(dǎo)的炎癥信號(hào)，減少過敏性疾病的炎癥反應(yīng).本實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)cγRIIB在HCC中的低表達(dá)可能是肝臟慢性非可控性炎癥并最終進(jìn)展為HCC的重要原因之一.

Ishikawa等人[20]研究非酒精性脂肪肝疾病時(shí)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)cγRIIB的表達(dá)與纖維化分期成反比關(guān)系.Vilar-Gomez等人[21]發(fā)現(xiàn)非酒精性脂肪肝患者的血小板計(jì)數(shù)隨著肝纖維化的發(fā)展而減少.Jin等人[22]以及上述Ishikawa等人[20]也指出，肝竇內(nèi)皮細(xì)胞上血小板計(jì)數(shù)與FcγRIIB水平成正相關(guān)，在肝臟高纖維化階段血小板計(jì)數(shù)偏低，F(xiàn)cγRIIB的表達(dá)也降低.Jin等人還發(fā)現(xiàn)，慢性乙型肝炎患者血清樣本中的FcγRIIB水平與HBV攜帶者和健康對(duì)照組相比顯著降低，中度和重度慢性乙型肝炎組FcγRIIB的表達(dá)顯著低于對(duì)照組，F(xiàn)cγRIIB可以作為預(yù)測(cè)慢性乙型肝炎患者炎癥程度和纖維化分期的指標(biāo)[22].本研究中FcγRIIB在HCC中低表達(dá)的原因可能是，在肝癌進(jìn)展過程中，炎癥和纖維化影響了FcγRIIB的表達(dá).由于FcγRIIB能夠抑制活化性受體介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，其表達(dá)降低可能進(jìn)一步加重肝臟炎癥并誘導(dǎo)肝癌發(fā)生.

肝癌傳統(tǒng)診斷方法，例如甲胎蛋白(AFP)的特異性和敏感性有限，尤其敏感性僅為60%～70%.目前，沒有單一的生物標(biāo)志物單獨(dú)用于診斷HCC，尤其在肝癌早期.盡管，一些基因已被視為是肝癌診斷的新生物標(biāo)志物或肝癌的潛在預(yù)測(cè)指標(biāo)和治療靶點(diǎn)，例如SCAMP3、STK39和SOX4等，但是，仍然需要更多更好的肝癌特異性的診斷、預(yù)后和進(jìn)展生物標(biāo)志物[23-24].本研究首先采用生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)FcγRIIB在HCC組織中低表達(dá)，然后通過臨床患者樣本證實(shí)了FcγRIIB在HCC中表達(dá)降低，最后在DEN誘導(dǎo)的小鼠肝癌模型中也檢測(cè)到FcγRIIB表達(dá)下調(diào)，因此，F(xiàn)cγRIIB可能成為肝癌診斷或預(yù)后的生物標(biāo)志物或新的治療靶點(diǎn).作者將在FcγRIIB基因敲除小鼠中繼續(xù)探討FcγRIIB與炎癥的相關(guān)性以及FcγRIIB在HCC發(fā)生發(fā)展中的作用.本研究為肝癌診斷或預(yù)后提供新的生物標(biāo)志物，并為進(jìn)一步明晰肝臟炎癌轉(zhuǎn)化的分子調(diào)控機(jī)制進(jìn)而干預(yù)HCC的發(fā)生奠定基礎(chǔ).

4 結(jié) 論

本文研究抑制性受體FcγRIIB在HCC中的表達(dá)，生物信息學(xué)、臨床樣本和小鼠模型的結(jié)果均表明，F(xiàn)cγRIIB在HCC中低表達(dá)，提示FcγRIIB可能成為肝癌診斷或預(yù)后新的生物標(biāo)志物，并在肝臟炎癌轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要作用.