蓋曉彤，代快，戶艷霞，王繼明，姜寧，盧燦華，夏振遠

云南省煙草鐮刀菌根腐病菌遺傳多樣性分析

蓋曉彤1*，代快2，戶艷霞3，王繼明4，姜寧1，盧燦華1，夏振遠1

1 云南省煙草農業(yè)科學研究院，云南昆明五華區(qū)圓通街33號 650031；2 云南省煙草公司玉溪市公司，云南玉溪紅塔區(qū)鳳凰路102號 653100；3 云南省煙草公司大理州公司，云南大理下關鶴慶路71號 671000；4 云南省煙草公司臨滄市公司，云南臨滄臨翔區(qū)南天路200號 677300

【背景和目的】尖孢鐮刀菌（）引起的根腐病是煙草主要的土傳病害，在云南煙區(qū)普遍發(fā)生。為分析云南省不同地理來源尖孢鐮刀菌的遺傳差異性和親緣關系?！痉椒ā坎捎肐SSR（inter-simple sequence repeat）和SRAP（sequence- related amplified polymorphism）分子標記技術分析40株菌株遺傳多樣性。【結果】（1）采用ISSR技術，供試的7條引物共擴增出53條條帶，其中多態(tài)性條帶44條，平均多態(tài)性條帶83.02%。菌株間的遺傳相似系數為0.49～0.96，存在遺傳背景差異。遺傳相似系數為0.68時，40株菌株可分為3個類群。（2）采用SRAP技術，供試的7對引物共擴增出44條條帶，其中多態(tài)性條帶32條，平均多態(tài)性條帶72.73%，菌株間的遺傳相似系數為0.55～0.96。遺傳相似系數為0.70時，40株菌株可分為3個類群，結果與ISSR一致。【結論】云南省煙草尖孢鐮刀菌菌株間遺傳差異大，ISSR和SRAP分子標記技術可用于煙草尖孢鐮刀菌的遺傳多樣性分析。

煙草鐮刀菌根腐?。患怄哏牭毒?；遺傳多樣性；ISSR；SRAP

煙草鐮刀菌根腐?。╰obacco fusarium root-rot）是煙草主要的土傳病害之一，在煙草苗期至大田期均可發(fā)生，發(fā)病率3%～5%，重病田的發(fā)病率可達30%以上[1]。近年來，煙草鐮刀菌根腐病的發(fā)生范圍不斷擴展[2]，2009年全國16個主產煙區(qū)中僅福建、河南報道該病害，2012年增至7個省份[3]。尖孢鐮刀菌寄主范圍廣，能侵染多種作物[4-5]，既可單獨侵染，也可與其他病害混合侵染[6-7]。該菌遺傳性復雜，易變異，具有明顯的生理分化和高度寄主?；訹8]，依據致病性可在種下分化為不同專化型，有些?；陀挚蓜澐殖霾煌纳硇》N和變種[9]，采用傳統的形態(tài)學分類和致病性等技術手段不能準確揭示該菌的進化關系。

DNA分子標記技術已被廣泛應用于真菌類群的遺傳多樣性研究，國內外學者開發(fā)出RAPD、RFLP、AFLP、ISSR等諸多方法[10-13]。其中ISSR（inter-simple sequence repeat）分子標記技術[14]具有高度的穩(wěn)定性和豐富的多態(tài)性特點，在鐮刀菌遺傳多樣性研究中具有獨特優(yōu)勢[15-16]，如鐮刀菌種間、種內遺傳差異性研究[17]；鐮刀菌種間遺傳差異性和親緣關系研究[18]；玉米禾谷鐮刀菌不同地理位置種群的遺傳變異研究[19]；不同地理來源的尖孢鐮刀菌多樣性分析[20]。SRAP（sequence- related amplified polymorphism）相關序列擴增多態(tài)性技術[21]具有穩(wěn)定性高、重復性強、共顯性高、便于克隆測序等優(yōu)點，在鐮刀菌遺傳多樣性分析中得到應用，延涵等[22]用于研究地理來源不同的尖孢鐮孢菌的遺傳差異；田葉韓等[23]用于研究不同寄主、不同地理來源的瓜類枯萎病菌的遺傳多樣性和親緣關系；劉麗芳等[24]用于研究尖孢鐮孢菌西瓜?；途觊g親緣關系與地理來源的相關性。

病原菌的遺傳多樣性研究可為病原分子分類、遺傳演變與進化提供理論依據，不僅可以對傳統分類學所反映的親緣關系做出更科學的評價，還能根據病原菌的遺傳關系指導病害的防控與抗病育種[25]。鐮刀菌根腐病在云南省各州（市）普遍發(fā)生，但尚無關于煙草鐮刀菌根腐病遺傳多樣性的研究報道。本文采用ISSR與SRAP兩種分子標記對云南省主要煙區(qū)尖孢鐮刀菌進行遺傳多樣性分析，解析了云南省主要煙區(qū)優(yōu)勢鐮刀菌間的遺傳差異與親緣關系。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株

煙草尖孢鐮刀菌菌株（表1），2019—2021年由云南省煙草農業(yè)科學研究院采自云南省10個州市。

表1 40株尖孢鐮刀菌菌株信息表

Tab.1 Information of 40 Fusarium oxysporum isolates

1.1.2 供試引物

SRAP引物：序列參照文獻[26]，由上海生工生物公司合成（表2）。

ISSR引物：從加拿大哥倫比亞大學（UBC）公布的100個通用引物序列中，篩選出7條可用于本研究的引物，由上海生工生物公司合成（表3）。

表2 SRAP引物序列

Tab.2 SRAP Primer sequence

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌的分離與純化

尖孢鐮刀菌分離培養(yǎng)采用組織分離法，菌株純化采用單孢分離法。

1.2.2 DNA的提取及檢測

將純化菌株接種至PDB培養(yǎng)液中富集菌絲，采用DNA提取試劑盒（Fungal DNA Kit，Omiga）提取菌絲DNA，使用Nano Drop ND 2000 蛋白核酸測定儀檢測DNA的純度與濃度。

1.2.3 反應體系與反應參數

ISSR引物篩選與擴增：PCR反應體系（20 μL），包括10 μL2×PCR-mix（大連Takara公司），1 μL DNA模板（50 ng/μL），0.4 μmol 引物，ddH2O補足至20 μL。PCR擴增反應程序：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，50～55℃退火45 s（各引物間最適溫度不同），72℃延伸30 s，37個循環(huán)；72℃終延伸10 min。

在50～56℃間設置不同梯度，根據預實驗電泳圖譜中各條帶的明亮程度獲得每個引物的最佳退火溫度。

SRAP引物篩選與擴增：PCR反應體系（20 μL），包括10 μL2×PCR-mix（大連Takara公司），1 μL DNA模板（50 ng/μL），0.4 μmol 引物，ddH2O補足至20 μL。PCR反應程序：94℃預變性5 min；94℃變性1 min，35℃復性1 min，72℃延伸1 min，5個循環(huán)；94℃變性1 min，50℃復性1 min，72℃延伸1 min，35個循環(huán)；72℃終延伸10 min。

隨機選取8個基因組DNA，對8個上游引物（Me）和8個下游引物（Em）的64對引物組合進行PCR擴增，篩選出條帶清晰、多態(tài)性豐富且重復性好的引物。

利用篩選獲得的引物對40株菌株基因組進行PCR擴增，取5 μL的PCR產物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用紫外凝膠成像系統拍照分析。

1.2.4 數據統計與分析

分別統計ISSR和SRAP的擴增圖譜，按照每個位點的條帶有無計數1或0，統計總條帶數與多態(tài)性條帶數，計算多態(tài)性比率；利用NT-SYS 2.1.0e軟件UPMGA算法進行聚類分析并繪制聚類分析圖。

2 結果

2.1 ISSR分子標記

2.1.1 ISSR引物篩選與擴增

供試100條引物中共篩選出7條背景清晰且多態(tài)性豐富的ISSR引物用于尖孢鐮刀菌的PCR擴增，優(yōu)化退火溫度及擴增條帶數（表3）。40株尖孢鐮刀菌共擴增到53條譜帶，其中44條表現多態(tài)性，多態(tài)性比率83.02%。各引物的擴增條帶數分布在7～9條之間，平均每條引物擴增7.57條多態(tài)性譜帶，多態(tài)性條帶比例為62.50%～100.00%，所有引物均表現出較高的擴增多態(tài)性，表明ISSR分子標記可用于尖孢鐮刀菌遺傳多樣性分析。

表3 40株尖孢鐮刀菌菌株的7條ISSR引物PCR擴增結果

Tab.3 PCR amplification of seven ISSR primers of 40 Fusarium oxysporum isolates

注：*Y=(C,T); B=(C,G,T); H=(A,C,T)。

2.1.2 遺傳多樣性分析

通過NT-SYS 2.1.0e軟件計算得出，供試40株尖孢鐮刀菌菌株間的遺傳相似系數為0.49～0.96，表明供試菌株間遺傳變異較大。各菌株間的遺傳相似系數與地理來源沒有明顯的相關性，其中來自普洱的菌株20和來自紅河的菌株21遺傳相似系數最大，親緣性最近；而同來自紅河的菌株37和菌株6遺傳相似系數最小，親緣性最遠（表4）。

表4 40株尖孢鐮刀菌ISSR遺傳相似系數

Tab.4 Genetic similarity coefficient of ISSR among 40isolates

2.1.3 聚類分析

在遺傳相似系數0.68處可將40株菌株劃分為3個類群。第1個類群29株菌株，第2類群5株菌株，第3類群6株菌株。從地理分布可知，第1類群的菌株涵蓋10個州市，第2類群的菌株分布于曲靖、普洱、紅河以及臨滄，第3類群的菌株僅分布于紅河與昆明。

同一州市來源的菌株具有不同的遺傳背景。紅河州的9株菌株聚類在3個類群中，親緣關系較遠；昆明市的5株菌株聚類于第1和第3類群；普洱市的6株菌株聚類于第1和第3類群；臨滄市的7株菌株有6株聚集在第1類群；來源于文山州、玉溪市的菌株遺傳背景相似。

圖1 40株尖孢鐮刀菌菌株ISSR-PCR標記的UPGMA聚類圖

2.2 SRAP分子標記

2.2.1 SRAP引物篩選與擴增

篩選獲得7對條帶清晰、多態(tài)性豐富且重復性較好的SRAP引物（表5）。40株尖孢鐮刀菌共擴增出44條條帶，其中多態(tài)性條帶32條，多態(tài)性比率72.73%。各引物的擴增條帶數在5～8條之間，平均每對引物擴增出6.29條，其中擴增條帶數最多為8條，擴增條帶數最少為5條。多態(tài)性條帶比例為50.00%～100.00%。

表5 7對SRAP引物對于40株尖孢鐮刀菌菌株的PCR擴增結果

Tab.5 PCR amplification of 40 Fusarium oxysporum isolates using seven SRAP primers

2.2.2 遺傳多樣性分析

遺傳相似系數結果顯示，40株尖孢鐮刀菌的遺傳相似系數在0.55～0.96，表明供試菌株間遺傳變異較大。各菌株間的遺傳相似系數與地理來源沒有明顯的相關性，其中菌株20（來源普洱）和菌株21（來源紅河），菌株10和菌株19（來源臨滄），以及菌株14和菌株37（來源紅河）遺傳相似系數最大，親緣性最近；而菌株38（來源普洱）和菌株23（來源曲靖）遺傳相似系數最小，親緣性最遠（表6）。

表6 40株尖孢鐮刀菌SRAP遺傳相似系數

Tab.6 Genetic similarity coefficient of SRAP among 40isolates

2.2.3 聚類分析

在遺傳相似系數0.70處可將40株菌株劃分為3個類群。每個類群與ISSR聚類結果中的3個類群菌株相同。因此，ISSR與SRAP技術在本研究中分析結果一致，本研究的結論具有一定的可靠性。

3 討論

本研究參試的40株菌株采集區(qū)域覆蓋云南省10個州市，具有一定的代表性，ISSR和SRAP標記技術對尖孢鐮刀菌遺傳多樣性分析的結果具有一致性，均可劃分為3個類群；SRAP顯示遺傳相似系數為0.55～0.96，ISSR為0.49～0.96，表現出菌株間的遺傳多態(tài)性。多態(tài)性比率是衡量物種遺傳多樣性水平的重要指標，ISSR和SRAP的分析結果顯示，多態(tài)性比率分別在83.02%和72.73%，表現出較高的多態(tài)性。從分子水平來看，遺傳距離變幅越大，樣本的遺傳分化越大，遺傳多樣性越高，遺傳背景越復雜[27]。因此，參試的40株菌株具有較豐富的遺傳多樣性，遺傳信息位點豐富，菌株間存在分子遺傳差異。

遺傳多樣性與地理分布關系表明，3個類群中類群1的29株菌株分布在所有采集區(qū)域，類群2的5株菌株分布在普洱、曲靖宣威、紅河彌勒以及臨滄永德；類群3僅包括紅河州的4株菌株與昆明石林的2株菌株。從地理來源分析，文山州的3株菌株均聚類于第1類群，親緣關系近；玉溪市的3株菌株聚類于第1類群，菌株的親緣關系近。而紅河的9株菌株則分別聚類在3個不同類群中，臨滄的8株菌株和普洱的7株菌株聚類于第1和第2類群，昆明的5株菌株聚類于第1和第3類群?？梢钥闯?，分離自同一區(qū)域的菌株間也存在遺傳差異，菌株間的遺傳相似系數與地理來源沒有明顯的相關性。

Bentley等研究表明，鐮刀菌在很小的地理隔離就有多樣性，甚至在間隔l m的種植行種群就出現明顯的差異[28]。本研究中，參試菌株間的遺傳關系同樣與地理間隔沒有關系，相同地塊來源的菌株間表現出明顯的遺傳差異，這一結論和已報道的研究結果一致[29-31]。造成這種結果的原因可能與尖孢鐮刀菌變異快，受氣候條件或土壤環(huán)境等多方面影響有關。

4 結論

本研究中，ISSR與SRAP分析結果一致，可將40株煙草尖孢鐮刀菌菌株分為3個類群，種間具有較高的遺傳差異，遺傳多樣性豐富；研究結果可為煙草尖孢鐮刀菌的遺傳差異和親緣關系研究以及病害防控提供一定的理論依據。

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Genetic diversity ofisolates causing Tobacco Root Rot in Yunnan

GAI Xiaotong1*, DAI Kuai2, HU Yanxia3, WANG Jiming4, JIANG Ning1, LU Canhua1, XIA Zhenyuan1

1 Plant Protection, Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Sciences, Kunming 650031, China;2 Technique Center, Yuxi Tobacco Company of Yunnan, Yuxi 653100, China;3 Technique Center, Dali Tobacco Company of Yunnan, Dali 671000, China;4 Technique Center, Lincang Tobacco Company of Yunnan, Lincang 677300, China

[] Root rot caused by Fusarium oxysporum is the main soil-borne disease of tobacco, which occurs in most of the tobacco growing areas in Yunnan province.is the major pathogen causing tobacco root rot. In order to understand the genetic difference and phylogenic relationship among theisolates collected from the different major tobacco growing areas in Yunnan, the genetic diversity of 40isolates separated from diseased plants was examined. [] The genetic diversity of forty Fusarium root rot pathogen isolates collected from different tobacco growing areas in Yunnan province were studied using inter-simple sequence repeats (ISSR) and sequence related amplified polymorphism (SRAP) molecular marker technology. [] (1) A total of 53 loci were obtained using 7 ISSR primers and 44 loci were polymorphic, and the average polymorphism ratio was 83.02%. UPGMA cluster analysis and genetic similarity coefficient showed that 40isolates could be grouped into three distinct families based on similarity coefficient of 0.68. The similarity coefficient of the 40 isolates ranged from 0.49 to 0.96, indicating differences in the genetic background. (2) Using SRAP molecular markers technology, 44 bands were amplified by 7 pairs of primers, including 32 loci polymorphic bands, the average polymorphism ratio was 72.73%, and the similarity coefficient ranged from 0.55 to 0.96. In the UPGMA cluster analysis, the result of SRAP was consistence with ISSR, 40 isolates could be categorized into three distinct families based on the similarity of 0.7. [] ISSR and SRAP markers were both available in the genetic diversity analysis of, and the tested isolates showed high degree of genetic differentiation.

TobaccoFusarium root rot;; genetic diversity; ISSR；SRAP

. Email：gaixiaotong0617@163.com

蓋曉彤，代快，戶艷霞，等. 云南省煙草鐮刀菌根腐病菌遺傳多樣性分析[J]. 中國煙草學報，2022，28（5）.

GAI Xiaotong, DAI Kuai, HU Yanxia, et al. Genetic diversity of Fusarium oxysporum isolates causing Tobacco Root Rot in Yunnan, 2022,28(5).

10.16472/j.chinatobacco. 2022.017

云南省煙草公司科技計劃項目“煙草鐮刀菌根腐病發(fā)生規(guī)律及防控研究”（No. 2020530000241012）；云南省科技廳科技計劃項目“云南省煙草鐮刀菌根腐病病原鑒定及遺傳多樣性分析”（No. 202001AU070012）

蓋曉彤（1990—），博士，助理研究員，從事煙草植保研究，Tel：13368777940，Email：gaixiaotong0617@163.com

2022-02-15；

2022-06-22