于尹，馮飛，馬艷龍，朱云凱，葉榮，張榮

復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系，教育部/衛(wèi)健委/醫(yī)科院醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200032

鼠肝炎病毒(mouse hepatitis virus，MHV)即鼠冠狀病毒(murine coronavirus)，屬于乙型冠狀病毒屬(Betacoronavirus，β-CoV)，與嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV)、中東呼吸綜合征冠狀病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV)和嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)為同一屬的不同譜系。MHV不感染人類，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員具有很高的安全性，是目前研究冠狀病毒的模式病毒。該病毒于1949年首次被報(bào)道[1]，根據(jù)組織嗜性不同，可分為呼吸株[respiratory strain；又稱多嗜株(polytropic strain)]和腸嗜株(enterotropic strain)[2]。實(shí)驗(yàn)室中研究較多的A59毒株是從患有白血病的小鼠體內(nèi)分離出來(lái)的，具有弱的神經(jīng)毒性和溫和的嗜肝性，屬于呼吸株[3]。

MHV是正鏈RNA病毒，基因組全長(zhǎng)約 31 kb，具有5’帽子結(jié)構(gòu)和poly(A)尾。基因組的前 2/3 是開放閱讀框(open reading frame，ORF)1a和1b，翻譯出多聚蛋白(polyprotein，pp)1a和1ab，編碼病毒RNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄所需的16個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白[4]。基因組后1/3包含7個(gè)ORF，其中ORF2a、ORF4和ORF5a分別編碼種屬特異性的輔助蛋白ns2、ns4和ns5a[5-7]。ORF2b編碼血凝素酯酶(hemagglutinin esterase，HE)，具有唾液酸結(jié)合和乙酰酯酶活性[8]。ORF3編碼的刺突蛋白(spike protein，S)可與細(xì)胞受體癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞黏附分子1(carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1，CEACAM-1)結(jié)合，并決定病毒的細(xì)胞嗜性[9]。ORF5b、ORF6和ORF7分別編碼包膜蛋白(envelope protein，E)、膜蛋白(membrane protein，M)和核衣殼蛋白(nucleocapsid protein，N)[10]。在N基因內(nèi)還含有編碼I蛋白(internal protein)的ORF[11]。

反向遺傳操作系統(tǒng)是研究病毒基因組功能、構(gòu)建重組病毒的重要工具，能幫助更好地理解病毒的生物學(xué)特性，亦可用作基因傳遞載體和表達(dá)系統(tǒng)[12-13]。1992年，Masters等首先基于RNA靶向重組技術(shù)和病毒溫度敏感表型，對(duì)不耐熱的親本病毒進(jìn)行識(shí)別篩選，開發(fā)出了MHV反向遺傳系統(tǒng)[14-15]。2000年，Kuo等[16]利用病毒的宿主嗜性，通過病毒S基因的替換改進(jìn)了這一系統(tǒng)。2002年，Yount等[17]基于體外連接技術(shù)，開發(fā)了一種由7個(gè)片段構(gòu)成全長(zhǎng)感染性cDNA克隆的MHV反向遺傳系統(tǒng)，此系統(tǒng)需要構(gòu)建質(zhì)粒并在大腸埃希菌中表達(dá)，但病毒基因組中含有毒性序列，高拷貝數(shù)時(shí)對(duì)大腸埃希菌有毒性。2005年，Coley等[18]使用痘苗病毒作為真核表達(dá)系統(tǒng)，構(gòu)建了MHV反向遺傳系統(tǒng)，并且可通過痘苗病毒介導(dǎo)的同源重組進(jìn)行突變。最近，Thi Nhu Thao等[19]建立了基于酵母人工染色體(yeast artificial chromosome，YAC)系統(tǒng)的RNA病毒拯救平臺(tái)并拯救出MHV，此系統(tǒng)利用了釀酒酵母體內(nèi)高效的同源重組系統(tǒng)，無(wú)須考慮酶切位點(diǎn)的選擇。在特定的實(shí)驗(yàn)環(huán)境下，上述反向遺傳系統(tǒng)各有優(yōu)劣，須綜合考慮實(shí)驗(yàn)因素選擇合適的病毒拯救策略。

在眾多反向遺傳系統(tǒng)中，體外連接是最經(jīng)典和相對(duì)簡(jiǎn)單、直接的方法。本研究?jī)?yōu)化了Yount等構(gòu)建的反向遺傳操作系統(tǒng)，利用ⅡS類限制性內(nèi)切酶BsmBⅠ和BsaⅠ，成功構(gòu)建了MHV A59毒株的六質(zhì)粒系統(tǒng)，通過觀察細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect，CPE)和生長(zhǎng)曲線等，證明拯救的重組病毒與原始毒株的生物學(xué)特性一致。相較于之前的七質(zhì)粒系統(tǒng)，本研究?jī)?yōu)化的六質(zhì)粒系統(tǒng)未對(duì)病毒基因組序列進(jìn)行任何同義突變，完整保留了原始毒株的序列，簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作流程，也提高了連接和拯救效率；還構(gòu)建了含ZsGreen(Zoanthussp.green fluorescent protein)或Nluc(NanoLuc luciferase)基因的報(bào)告病毒，為后續(xù)研究MHV的生物學(xué)特性、測(cè)試抗病毒藥物等提供了強(qiáng)有力的工具。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞和質(zhì)粒BHK-R(穩(wěn)定表達(dá)MHV受體CEACAM-1的BHK細(xì)胞)和L2細(xì)胞均為美國(guó)賓夕法尼亞大學(xué)醫(yī)學(xué)院Susan Weiss教授饋贈(zèng)。MHV原始毒株A59(wtA59)由本單位測(cè)序并保存[20]。大腸埃希菌Stabl3感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自Thermo公司。pSMART載體質(zhì)粒購(gòu)自美國(guó)Lucigen公司。

1.1.2 試劑主要試劑有NEBNext Ultra II Q5?預(yù)混液(北京NEB公司，M0544L)、限制性內(nèi)切酶BsmBⅠ-v2(北京NEB公司，R0739L)、限制性內(nèi)切酶BsaⅠ-HF v2(北京NEB公司，R3733L)、T4 DNA連接酶(北京NEB公司，M0202L)、總RNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司，DP419]、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司，DP209]、無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司，DP120]，QIAquick Gel Extraction Kit(德國(guó)QIAGEN公司，28706)、In-Fusion?HD Cloning Kit(TaKaRa公司，639650)、1 st Strand cDNA Synthesis Kit(日本TaKaRa公司，6110A)、AxyPrep質(zhì)粒DNA小量試劑盒[康寧生命科學(xué)(吳江)有限公司，AP-MN-P-250]、mMESSAGE mMACHINETMT7 Transcription Kit[英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司，AM1344]、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(美國(guó)Sigma公司，A4416-1ML)、TrueBlueTMPeroxidase Substrate(英國(guó)SeraCare公司，5510-0050)、Nano-Glo?Luciferase Assay System(美國(guó)Promega公司，N1110)。小鼠抗MHV-N抗體由本單位制備。

1.2 方法

1.2.1 MHV全基因組分段擴(kuò)增用總RNA提取試劑盒抽提MHV原始毒株A59(wtA59)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的病毒RNA，并用PrimeScriptTM1 st Strand cDNA Synthesis Kit將病毒RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，于-80 ℃保存。根據(jù)全基因組序列、酶切位點(diǎn)分布及DNA聚合酶適宜擴(kuò)增長(zhǎng)度，將全基因組分為6個(gè)片段進(jìn)行擴(kuò)增。在A片段5’端引物中引入T7啟動(dòng)子序列，F(xiàn)2片段3’端引物中引入poly(A)尾，相鄰引物間使用“No See′m”的BsmBⅠ或BsaⅠ酶切位點(diǎn)[17]。經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)，獲得A、B、C、D、E、F片段(擴(kuò)增程序見表1)，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，用普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒純化。

表1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)步驟

1.2.2 MHV重組質(zhì)粒的構(gòu)建通過PCR擴(kuò)增pSMART質(zhì)粒獲得線性化載體。用In-Fusion?HD Cloning Kit將目的基因片段和載體片段無(wú)縫連接，獲得分別含A、B、C、D、E、F片段的6個(gè)質(zhì)粒。構(gòu)建的質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定為陽(yáng)性后送蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 MHV全長(zhǎng)cDNA克隆的構(gòu)建將構(gòu)建的6個(gè)質(zhì)粒分別用BsmBⅠ或BsaⅠ酶切線性化(詳見圖1)，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，用QIAquick Gel Extraction Kit進(jìn)行膠回收，回收產(chǎn)物用T4 DNA連接酶進(jìn)行體外連接，用氯仿-異丙醇-乙醇抽提法抽提核酸，獲得A59 全長(zhǎng)感染性cDNA克隆(infectious cDNA clone of A59，icA59)。

1.2.4 MHV表達(dá)ZsGreen或Nluc的全長(zhǎng)cDNA克隆構(gòu)建以構(gòu)建的F質(zhì)粒為骨架，去掉ORF4前的3對(duì)核苷酸，獲得SalⅠ酶切位點(diǎn)，在ORF4內(nèi)第281位核苷酸后引入NotⅠ酶切位點(diǎn)[21]。將該質(zhì)粒酶切后，分別與ZsGreen和Nluc基因片段進(jìn)行無(wú)縫連接，獲得帶有ZsGreen或Nluc基因的重組 F-ZsGreen 和F-Nluc質(zhì)粒。按照1.2.3中的方法進(jìn)行后續(xù)酶切和連接，獲得icA59-ZsGreen和icA59-Nluc全長(zhǎng)cDNA。

1.2.5 病毒的拯救本實(shí)驗(yàn)使用mMESSAGE mMACHINETMT7 Transcription Kit對(duì)cDNA進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，獲得基因組全長(zhǎng)RNA，電轉(zhuǎn)BHK-R細(xì)胞。每天觀察拯救病毒感染細(xì)胞后的CPE，當(dāng)50%的細(xì)胞出現(xiàn)CPE時(shí)，收集上清并保存于-80 ℃。

1.2.6 噬斑和CPE實(shí)驗(yàn)將原始毒株和拯救的重組病毒按照感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)為0.01分別感染6孔板中的L2細(xì)胞，感染后2 h每孔加入3 mL 2%低熔點(diǎn)瓊脂糖與2×DMEM的混合物，室溫放置20 min后放入培養(yǎng)箱孵育。48 h后，觀察CPE，并用結(jié)晶紫染色15 min，觀察病毒噬斑的大小及形態(tài)。

1.2.7 病毒滴度測(cè)定采用斑點(diǎn)形成實(shí)驗(yàn)(focus forming assay，F(xiàn)FA)測(cè)定病毒滴度[22]，具體步驟如下。將L2細(xì)胞鋪于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞匯合度達(dá)到100%時(shí)，將病毒用含2%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的培養(yǎng)基進(jìn)行10倍梯度稀釋，每個(gè)稀釋度進(jìn)行3個(gè)重復(fù)，每孔加100 μL病毒液，在培養(yǎng)箱中孵育2 h后，每孔加入125 μL甲基纖維素溶液與2×DMEM的混合物，繼續(xù)放回培養(yǎng)箱中孵育16 h，用4%組織細(xì)胞固定液固定30 min。與1∶40 000 稀釋的小鼠抗MHV-N抗體孵育2 h后，用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline, PBS)洗3遍，然后與1∶2 500 稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG孵育2 h，用PBS洗3遍，最后用TrueBlueTMPeroxidase Substrate染色 30 min，在顯微鏡下對(duì)藍(lán)色斑點(diǎn)計(jì)數(shù)。

1.2.8 多步生長(zhǎng)曲線的測(cè)定將原始毒株和拯救的重組病毒按照MOI為0.01分別感染12孔板中的L2細(xì)胞，感染后2 h棄去含病毒的上清，用培養(yǎng)基洗3遍，每孔加1 mL培養(yǎng)基。收集感染后2、8、12、16和24 h的上清，按照1.2.7中的方法測(cè)定病毒滴度，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)均有3個(gè)復(fù)孔，繪制病毒多步生長(zhǎng)曲線。

1.2.9 藥物抑制實(shí)驗(yàn)將L2細(xì)胞鋪到96孔板中，用藥物處理2 h后加入報(bào)告病毒，在感染后12 h和24 h分別檢測(cè)綠色熒光強(qiáng)度和熒光素酶活性。檢測(cè)熒光素酶活性時(shí)，棄去病毒上清，加入30 μL含2% FBS的培養(yǎng)基和30 μL Nano-Glo?Luciferase Reagent，室溫孵育15 min，將孔中的液體全部轉(zhuǎn)移至白色不透明板中，用Flex Station 3多功能微孔板讀板機(jī)進(jìn)行讀值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用GraphPad Prism 8軟件，采用ANOVA或unpaired t-test進(jìn)行組間差異分析，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P<0.005為有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P<0.001為有極顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 成功構(gòu)建MHV全長(zhǎng)cDNA克隆

從原始病毒wtA59感染的細(xì)胞上清中提取RNA，作為RT-PCR模板，制備cDNA片段。通過設(shè)計(jì)構(gòu)建6個(gè)連續(xù)的cDNA片段，以覆蓋整個(gè)病毒基因組(見圖1B)，這些cDNA片段全部通過RT-PCR制備，然后克隆到pSMART質(zhì)粒載體中。每個(gè)cDNA片段兩側(cè)都有一個(gè)ⅡS類限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)(BsmBⅠ或BsaⅠ)，以產(chǎn)生特異的黏性末端(見圖1C)，然后正確連接成全長(zhǎng)cDNA。本研究采用一種稱為“No See′m”的“隱形克隆”策略[17]，使回收片段不含內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)。圖1C描述了這6個(gè)片段的詳細(xì)信息：A(T7啟動(dòng)子序列加1～3 513 位核苷酸)、B(3 514～8 095 位核苷酸)、C(8 096～12 109 位核苷酸)、D(12 110～17 132 位核苷酸)、E(17 133～23 850 位核苷酸)和F[23 851～31 333 位核苷酸加poly(A)序列]。

將6個(gè)cDNA片段分別克隆到質(zhì)粒載體中，并對(duì)它們進(jìn)行測(cè)序以確保序列正確。然后用BsmBⅠ或BsaⅠ酶切這6個(gè)質(zhì)粒，將得到的DNA片段通過瓊脂糖凝膠回收(見圖1D)，在體外連接成全長(zhǎng)基因組cDNA，純化后進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，生成病毒全長(zhǎng)基因組RNA。

A: Genome structure of MHV A59.B: Strategy for in vitro assembly of an infectious cDNA clone of MHV A59.C: Diagram of the terminal sequences of each cDNA fragment recognized by BsmBI and BsaI.D: Gel analysis of the six purified cDNA fragments.The 1-kb DNA ladders are indicated.

2.2 重組病毒與原始毒株復(fù)制特性相似

為了從icA59中拯救出重組A59(recombinant A59，rA59)毒株，本研究直接將體外轉(zhuǎn)錄的基因組RNA電轉(zhuǎn)至BHK-R細(xì)胞中。有報(bào)道稱，N蛋白可增強(qiáng)冠狀病毒RNA轉(zhuǎn)錄物的感染性[17,23-24]，但本研究未同時(shí)電轉(zhuǎn)編碼A59 N蛋白的RNA。細(xì)胞在電轉(zhuǎn)后12 h就出現(xiàn)了以合胞體為典型特征的CPE，成功拯救出有感染性的重組病毒。對(duì)比重組病毒(rA59)與原始毒株(wtA59)的復(fù)制特性，rA59形成的CPE和噬斑形態(tài)與wtA59相似(見圖2A和2B)，且在L2細(xì)胞中表現(xiàn)出相似的生長(zhǎng)曲線(見圖2C)。以上結(jié)果表明，體外轉(zhuǎn)錄的全長(zhǎng)RNA在電轉(zhuǎn)進(jìn)入細(xì)胞后具有感染性，且重組病毒重現(xiàn)了原始毒株在L2細(xì)胞中的復(fù)制特性。

A: Bright-field images of the original wild-type wtA59 and the recombinant rA59.B: Plaque morphology of the original wtA59 and the recombinant rA59.C: Growth curve of the original wtA59 and the recombinant rA59 in L2 cells at an MOI of 0.01.

2.3 rA59-ZsGreen和rA59-Nluc報(bào)告病毒的構(gòu)建

表達(dá)報(bào)告基因(即熒光蛋白或化學(xué)發(fā)光)的報(bào)告病毒是研究病毒復(fù)制、組織嗜性、發(fā)病機(jī)制以及篩選藥物的有力工具。為了構(gòu)建報(bào)告病毒，本研究將ZsGreen和Nluc基因分別插入病毒基因組的ORF4中(見圖3A)。采用與上述icA59相同的體外連接方法制備icA59-ZsGreen和icA59-Nluc全長(zhǎng)cDNA克隆，經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄和電轉(zhuǎn)基因組RNA，獲得rA59-ZsGreen和rA59-Nluc重組病毒。為了檢查報(bào)告基因是否抑制了病毒復(fù)制，本研究比較了攜帶報(bào)告基因的病毒與其原始重組病毒在L2細(xì)胞中的復(fù)制特性。結(jié)果顯示，rA59-ZsGreen和rA59-Nluc報(bào)告病毒感染L2細(xì)胞后，產(chǎn)生了與原始重組病毒rA59相似的CPE和噬斑形態(tài)(見圖3B和3C)。rA59-Nluc與rA59的多步生長(zhǎng)曲線幾乎完全一致，而rA59-ZsGreen與rA59的多步生長(zhǎng)曲線略有差異，但不顯著(見圖3D)。以上結(jié)果表明，rA59-ZsGreen和rA59-Nluc病毒所攜帶的報(bào)告基因未顯著影響病毒復(fù)制，可以很好地反映rA59病毒的復(fù)制特性。

A: Assembly of the rA59-ZsGreen and rA59-Nluc cDNA.The ORF4 sequence is replaced by ZsGreen or Nluc gene.B: Fluorescence microscopy and light microscopy of virus-infected cells.Representative images are shown.C: Plaque morphology of the rA59-ZsGreen and rA59-Nluc viruses.D: Growth curve of the rA59, reporter viruses rA59-ZsGreen and rA59-Nluc in L2 cells at an MOI of 0.01.

2.4 rA59-ZsGreen和rA59-Nluc用于藥物篩選的價(jià)值

為了探索rA59-ZsGreen和rA59-Nluc的應(yīng)用價(jià)值，使用這兩種病毒驗(yàn)證瑞德西韋(remdesivir)的抗病毒活性。瑞德西韋是一種核苷酸類似物前體藥物，在細(xì)胞培養(yǎng)和小鼠模型中對(duì)人冠狀病毒和人畜共患冠狀病毒表現(xiàn)出廣譜的抗病毒活性[25]。用10 μmol/L 瑞德西韋預(yù)處理L2細(xì)胞2 h，加入病毒(藥物一直存在)，在感染后12 h和24 h分別進(jìn)行檢測(cè)(見圖4A)。與對(duì)照組二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)比較，rA59-ZsGreen感染后的熒光細(xì)胞可被藥物明顯抑制(見圖4B)。藥物處理同樣顯著抑制了熒光素酶活性，表明rA59-Nluc病毒的復(fù)制水平降低(見圖4C)。與傳統(tǒng)的噬斑測(cè)定相比，報(bào)告病毒檢測(cè)更加快速便捷。以上結(jié)果表明，rA59-ZsGreen和rA59-Nluc可用于高效的抗病毒藥物篩選平臺(tái)。

A: Schematic diagram of remdesivir treatment.B: Representative fluorescent images of virus-infected L2 cells after remdesivir treatment.Color representations are as follows: green, ZsGreen; red, N protein; blue, nucleus.C: Luciferase signal produced from virus-infected L2 cells after remdesivir treatment.L: Luminescence.

3 討論

小鼠不僅是研究炎癥、免疫反應(yīng)和感染的經(jīng)典模型，而且可用于開發(fā)新的診斷、預(yù)防和治療方法。MHV是天然感染小鼠的冠狀病毒，是研究冠狀病毒嗜性、毒力和免疫應(yīng)答等發(fā)病機(jī)制的優(yōu)秀模型，已被廣泛用作模型冠狀病毒來(lái)研究人類肝炎和多發(fā)性硬化癥(multiple sclerosis，MS)等脫髓鞘疾病[26-27]。MHV ns2和MERS-CoV NS4b都具有2′，5′-磷酸二酯酶(2′, 5′-phosphodiesterase，2′, 5′-PDE)活性，可切割2′，5′-寡腺苷酸(2′, 5′-oligoadenylate，2-5A)，從而阻止核糖核酸酶L(ribonuclease L，RNase L)的激活[28]。同屬于β-CoV的MHV和SARS-CoV-2含有相似的基因組結(jié)構(gòu)，且編碼相似的蛋白，特別是非結(jié)構(gòu)蛋白。雖然兩者的受體利用存在差異，但MHV受體的細(xì)胞表達(dá)譜與SARS-CoV-2類似，MHV可感染肺部并誘導(dǎo)與SARS-CoV-2相似的炎癥反應(yīng)和病理變化[29]。因此，MHV也被用作研究MERS-CoV和SARS-CoV-2的模型。此外，操作MHV只需要二級(jí)生物安全防護(hù)，而操作SARS-CoV-2等高致病性病毒需要三級(jí)生物安全防護(hù)。因此，深入研究MHV-A59病毒為更好地了解高致病性冠狀病毒提供了有力幫助。

MHV A59毒株基因組內(nèi)含有毒性序列，高拷貝數(shù)時(shí)對(duì)大腸埃希菌有毒性，可能導(dǎo)致序列突變和缺失，所以構(gòu)建質(zhì)粒時(shí)必須要考慮毒性序列所在區(qū)域。此外，之前的七質(zhì)粒系統(tǒng)須對(duì)MHV A59毒株基因組序列原有的3處BsmBⅠ酶切位點(diǎn)進(jìn)行同義突變，而本研究?jī)?yōu)化的六質(zhì)粒反向遺傳操作系統(tǒng)直接利用了基因組序列中的2處BsmBⅠ酶切位點(diǎn)，并使用BsaⅠ來(lái)避開基因組序列中剩余1處BsmBⅠ酶切位點(diǎn)在酶切質(zhì)粒時(shí)的影響，從而完整保留了原始毒株的基因組序列，簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作流程，也提高了連接和拯救的效率。

本研究成功構(gòu)建了基于六質(zhì)粒的MHV A59毒株全長(zhǎng)感染性克隆。與原始毒株相比，重組病毒rA59在噬斑形態(tài)和生長(zhǎng)曲線等方面沒有差異。因此，該重組病毒可替代原始毒株，也可通過操作基因組突變病毒來(lái)研究突變對(duì)病毒的影響。本研究還拯救了rA59-ZsGreen和rA59-Nluc兩株報(bào)告病毒，通過測(cè)定ZsGreen和Nluc的表達(dá)情況以反映病毒的復(fù)制能力。Nluc能定量測(cè)定其催化反應(yīng)的化學(xué)發(fā)光值，而且在細(xì)胞內(nèi)沒有背景，可檢測(cè)到非常微弱的表達(dá)，靈敏度很高，適用于高通量篩選[30]，還可用于研究病毒的小鼠組織器官嗜性和感染路徑。不過，rA59-Nluc攜帶的Nluc需要額外的底物才能激活，因此不適合在顯微鏡下觀察細(xì)胞間的病毒復(fù)制，而rA59-ZsGreen攜帶的ZsGreen熒光標(biāo)記可清楚直觀地觀察病毒的感染擴(kuò)散情況。用瑞德西韋處理后，兩種報(bào)告病毒都可快速有效地驗(yàn)證抗病毒效果。因此，本研究中構(gòu)建的rA59-ZsGreen和rA59-Nluc可滿足不同實(shí)驗(yàn)場(chǎng)景下的使用需求。

有研究報(bào)道，冠狀病毒的基因組可容納10%～20%的外源基因插入[31-32]，而基因組中20%～30%的區(qū)域可被替換，甚至僅須復(fù)制酶基因就可介導(dǎo)基因組mRNA轉(zhuǎn)錄[33-34]。因此，本研究建立的MHV A59反向遺傳操作系統(tǒng)不僅可構(gòu)建報(bào)告病毒，用作高通量藥物篩選和中和抗體測(cè)定的工具，還可作為模式病毒，研究MHV及其他冠狀病毒的基因組功能和生物學(xué)特性，甚至可作為病毒載體，在受體細(xì)胞和體內(nèi)高效表達(dá)異源蛋白來(lái)研究其功能。