HS-SPME-GC-MS技術(shù)分析國(guó)內(nèi)不同產(chǎn)地萬(wàn)壽菊花中揮發(fā)性成分

劉 超，劉 莉，韋康秦，余家奇，王 剛

(1.遵義醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院,貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院 中醫(yī)科,貴州 遵義 563000)

萬(wàn)壽菊(TageteserectaL.) 為菊科萬(wàn)壽菊屬一年生草本植物，頭狀花序單生，花冠黃色，花期為每年6～10月，別名臭芙蓉、蜂窩菊、里苦艾、萬(wàn)壽燈等[1-3]。萬(wàn)壽菊原產(chǎn)于墨西哥等中美洲國(guó)家，主要分布于我國(guó)貴州、云南、廣西等地。《中華本草》中收載其花，因有香味，可作芳香劑、天然色素及食品香料等?；ㄈ胨幘哂星鍩峄?、補(bǔ)血通經(jīng)、祛瘀生新之效。據(jù)研究，萬(wàn)壽菊化學(xué)成分豐富，主要含有生物堿、黃酮等化合物[4-5]，具有抑菌、抗病毒、鎮(zhèn)靜、降壓、抗炎、抗氧化等作用[6-7]。

目前對(duì)于揮發(fā)油的提取方法有壓榨法、有機(jī)溶劑萃取法、水蒸氣蒸餾法、微波萃取法等[8]。頂空固相微萃取技術(shù)(Headspace solid phase microextraction，HS-SPME)是一種使用涂覆有固定相的熔融石英纖維膜來直接吸附揮發(fā)性成分的技術(shù)[9-10]。該技術(shù)集采樣、提取和分析于一體，具有操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、耗樣量少的優(yōu)點(diǎn)[11-12]。因此HS-SPME-GC-MS結(jié)合使用對(duì)揮發(fā)油能夠進(jìn)行高效，靈敏和快速的分析，從而實(shí)現(xiàn)復(fù)雜樣品揮發(fā)成分的發(fā)現(xiàn)，有助于復(fù)雜樣品系統(tǒng)中痕量揮發(fā)性成分的分析。

本實(shí)驗(yàn)利用HS-SPME與GC-MS聯(lián)用技術(shù)分析10種不同產(chǎn)地萬(wàn)壽菊花中揮發(fā)性成分，利用聚類分析(Clustering analysis)進(jìn)行分析，為進(jìn)一步探索萬(wàn)壽菊中揮發(fā)性成分的藥用價(jià)值奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1藥材 萬(wàn)壽菊藥材來源于廣西、貴州、云南、安徽、河南等10個(gè)產(chǎn)地，如表1所示，經(jīng)遵義醫(yī)科大學(xué)張玉金副教授鑒定為TageteserectaL。

表1 不同產(chǎn)地萬(wàn)壽菊花樣品

1.1.2 儀器與試劑 氣相-質(zhì)譜聯(lián)用儀P6890-5975C(美國(guó)Agilent Technologies公司)；萃取纖維頭為：2 cm-50/30 μm DVB/CAR/PDMS Stable Flex、手動(dòng)固相微萃取裝置(美國(guó)Supelco公司)；DEY-400搖擺式高速萬(wàn)能粉碎機(jī)(溫嶺市林大機(jī)有限公司)；JJY1002型電子天平(上海浦春計(jì)量?jī)x器有限公司)；加熱器(北京康林科技有限公司)；甲醇(成都市科龍化工試劑廠)、二氯甲烷(天津市富宇精細(xì)化工有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備 10個(gè)產(chǎn)地萬(wàn)壽菊花干燥后經(jīng)粉碎機(jī)粉碎過60目篩，分別密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 SPME法 根據(jù)張鵬云等[13]的SPME方法，取0.5 g萬(wàn)壽菊花粗粉樣品，置于固相微萃取儀采樣瓶中(50 mL)，插入手動(dòng)進(jìn)樣器(纖維頭為：2 cm-50/30 μm DVB/CAR/PDMS StableFlex)，60 ℃下進(jìn)行50 min頂空萃取，快速將萃取頭移出，并插入氣相色譜儀進(jìn)樣口(溫度250 ℃)中，進(jìn)行6 min熱解析后進(jìn)樣。

1.2.3 GC-MS條件 色譜條件為采用GC-MS聯(lián)用儀(P6890-5973C)、彈性石英毛細(xì)管柱HP-5MS (60 m×0.25 mm×0.25 μm)，柱溫40 ℃ 持續(xù)2 min，升溫速度：3.5 ℃/min(40～208 ℃)、10 ℃/min(208～288 ℃)；運(yùn)行時(shí)間：58 min；柱前壓：16.03 psi；汽化室溫度：250 ℃；載氣(99.999% 高純He)流量：1.0 mL/min不分流進(jìn)樣；溶劑延遲3 min。質(zhì)譜條件：采用EI源為離子源；離子源溫度：230 ℃；接口溫度：280 ℃；四極桿溫度：150 ℃；倍增器電壓：2 094 V；電子能量：70 eV；發(fā)射電流：34.6 μA；質(zhì)量范圍：29～500 amu。

1.2.4 方法學(xué)考察

1.2.4.1 精密度試驗(yàn) 按 “2.2、2.3”條件下連續(xù)分析6次，對(duì)山東樣品(S5)中各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間的一致性進(jìn)行考察。測(cè)得各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD值均小于2.0% ，儀器具有良好的精密度。

1.2.4.2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 按“2.2和2.3”項(xiàng)下條件操作進(jìn)樣分析，相同積分條件下，考察S5產(chǎn)地萬(wàn)壽菊花中揮發(fā)性成分的總峰面積，RSD值均小于2.0%，說明該方法具有良好的重復(fù)性，可用于萬(wàn)壽菊植物揮發(fā)性成分分析，符合指紋圖譜要求。

1.2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“2.2和2.3”條件下操作，在0、2、4、8、12 h分別進(jìn)樣1次，對(duì)S5產(chǎn)地萬(wàn)壽菊花中各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間的一致性進(jìn)行考察。得各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD值均小于2.0%，表明12 h內(nèi)樣品成分具有良好的穩(wěn)定性。

1.2.5 共有峰確認(rèn)及相似度分析 10個(gè)產(chǎn)地萬(wàn)壽菊花中揮發(fā)性成分在“2.3”項(xiàng)條件下分析，記錄圖譜，用中藥指紋圖譜相似度2012版處理圖譜，結(jié)果表明10種不同產(chǎn)地的藥材圖譜共有峰的峰面積相似度皆大于0.85，共有峰總共為15個(gè)。10批不同產(chǎn)地萬(wàn)壽菊花之間具有高度的一致性和穩(wěn)定性。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 Origin2019b版建立萬(wàn)壽菊花指紋圖譜；基于各揮發(fā)性成分的特征值及峰面積百分率，采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行層次聚類分析。

2 結(jié)果

2.1 10種不同產(chǎn)地萬(wàn)壽菊揮花中發(fā)性成分分析 經(jīng)HS-SPME-GC-MS萃取分析，用峰面積歸一化法測(cè)定了各化學(xué)成分的相對(duì)百分含量，10個(gè)產(chǎn)地萬(wàn)壽菊花中共鑒定出66種化合物(見圖1、表2)，其中廣東產(chǎn)地分離出31種化合物，占總揮發(fā)性成分的91.50 %；廣西產(chǎn)地分離出23種化合物，占總揮發(fā)性成分的98.80 %；貴州產(chǎn)地分離出50種化合物，占總揮發(fā)性成分的90.06 %；云南產(chǎn)地分離出出43種化合物，占總揮發(fā)性成分的90.76 %；山東產(chǎn)地分離出38種化合物，占總揮發(fā)性成分的90.28 %；安徽產(chǎn)地分離出34種化合物，占總揮發(fā)性成分的94.18 %；內(nèi)蒙古產(chǎn)地分離出49種化合物，占總揮發(fā)性成分的90.59 %；新疆產(chǎn)地分離出43種化合物，占總揮發(fā)性成分的90.02 %；陜西產(chǎn)地分離出22種化合物，占總揮發(fā)性成分的92.95 %；河南產(chǎn)地分離出50種化合物，占總揮發(fā)性成分的90.38 %。

圖1 萬(wàn)壽菊花揮發(fā)油指紋圖譜

表2 10種產(chǎn)地萬(wàn)壽菊花中揮發(fā)性成分及相對(duì)含量(%)

續(xù)表

按照HS-SPME-GC-MS條件，對(duì)10種不同產(chǎn)地萬(wàn)壽菊花中揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，總離子流圖中各峰經(jīng)Nist 17和Wiley 275數(shù)據(jù)庫(kù)解析及鑒定了萬(wàn)壽菊花中揮發(fā)性成分，用峰面積歸一化法對(duì)各化學(xué)成分的相對(duì)百分含量進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果如圖1、表2。鑒定出66種化合物，其中含醛類4種、醇類3種、酮類1種、醚類1種、單萜類33種、倍半萜類19種、酯類1種、呋喃類1種、芳香族類2種、脂肪烴類1種。由表3結(jié)果可以看出，單萜類化合物是萬(wàn)壽菊花中主要的揮發(fā)性成分，其次是倍半萜類化合物。10個(gè)產(chǎn)地萬(wàn)壽菊花中共有成分為檸檬烯、順-羅勒烯、β-羅勒烯、萜品油烯、三甲基苯甲醇、香芹酚、胡椒酮、橙化基丙酮、β-石竹烯、金合歡烯、β-芹子烯、α-紫穗槐烯、吉馬烯、油烯醇、石竹素15種成分，可見不同產(chǎn)地萬(wàn)壽菊花中相對(duì)含量及成份存在聯(lián)系的同時(shí)也具有差異。

表3顯示，10個(gè)產(chǎn)地萬(wàn)壽菊花中揮發(fā)性成分含量較高的為單萜類和倍半萜類成分。其中廣東產(chǎn)地的單萜類、倍半萜類分別占揮發(fā)性成分含量的19.08 %、70.87 %；廣西產(chǎn)地的單萜類和倍半萜類分別占揮發(fā)性成分含量的38.00 %、57.54 %；貴州產(chǎn)地的單萜類、倍半萜類分別占揮發(fā)性成分含量的60.18 %、23.67 %；云南產(chǎn)地的單萜類、倍半萜類分別占揮發(fā)性成分含量的57.30 %、28.98 %；山東產(chǎn)地的單萜類、倍半萜類分別占揮發(fā)性成分含量的40.35 %、45.85 %；安徽產(chǎn)地的單萜類、倍半萜類分別占揮發(fā)性成分含量的46.26 %、43.09 %；內(nèi)蒙的單萜類、倍半萜類分別占揮發(fā)性成分含量的58.61 %、42.06 %；新疆產(chǎn)地的單萜類、倍半萜類分別占揮發(fā)性成分含量的42.72 %、26.67 %；陜西產(chǎn)地的單萜類、倍半萜類分別占揮發(fā)性成分含量的34.26 %、26.86 % ；河南產(chǎn)地的單萜類、倍半萜類分別占揮發(fā)性成分含量的62.08 %、23.10 %。由此可見單萜類和倍半萜類化合物是萬(wàn)壽菊花的主要化學(xué)成分。

表3 10種不同產(chǎn)地萬(wàn)壽菊花中揮發(fā)性成分比較

在10個(gè)不同產(chǎn)地萬(wàn)壽菊花中，揮發(fā)性成分含量超過1 %的主要有檸檬烯(4.67 %～12.75 % )、順-羅勒烯(0.42 %～1.86 %)、β-羅勒烯(0.36 %～8.73 %)、萜品油烯(0.40 %～16.63 %)、三甲基苯甲醇(0.57 %～6.55 %)、月桂烯(0.22 %～5.70 %)、氧化羅勒烯 (0.99 %～8.23 %)、胡椒烯酮醚(0.90 %～1.54 %)、胡椒酮(1.04 %～13.12 %)、薄荷烯酮(0.17 %～1.72 %)、β-石竹烯(18.04 %～51.21 %)、金合歡烯(0.21 %～5.51 %)、吉馬烯(0.41 %～4.79 %)、喇叭烯(0.10 %～1.65 %)、石竹素(0.22 %～2.40 %)等成分。其中石竹烯主要用于配制精油仿制和日化香精[14]，胡椒酮和萜品油烯具有祛痰、平喘、止咳、抗菌的作用，胡椒酮不僅對(duì)吸煙者呼吸道有良好的保護(hù)效果，還可降低吸煙者呼吸道病變，可作為制作功能型卷煙的一種理想添加劑[15]，檸檬烯具有抗氧化、抑菌防腐、殺菌、抗腫瘤、水果飲料和冰淇淋的調(diào)味劑等作用[16-17]，本研究分離了10種類型共計(jì)66種化合物，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS 18.0進(jìn)行主成分分析和層次聚類分析。

2.2 層次聚類分析 對(duì)10種產(chǎn)地萬(wàn)壽菊花進(jìn)行層次聚類分析，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS18.0軟件，聚類方法采用組間聯(lián)接，測(cè)度：平方Eclidean距離，基準(zhǔn)：峰面積百分率，得樹狀圖。由圖2可知，當(dāng)類間聚為10時(shí)分為4類，云南、新疆、貴州、河南的萬(wàn)壽菊花為一類；產(chǎn)地安徽、內(nèi)蒙、山東、陜西的萬(wàn)壽菊花為一類；廣西的萬(wàn)壽菊花為一類；廣東的萬(wàn)壽菊花為一類。整個(gè)聚類過程在該圖2中得到直觀顯示，減少了主觀判斷引起的失誤，結(jié)果表明10種產(chǎn)地萬(wàn)壽菊花的成分具有相似之處，同時(shí)也存在差異。

圖2 10個(gè)產(chǎn)地萬(wàn)壽菊花聚類分析結(jié)果

3 討論

采用HS-SPME-GC/MS聯(lián)用技術(shù)分析10個(gè)不同產(chǎn)地萬(wàn)壽菊花中揮發(fā)性成分，分離出66種成份。10個(gè)產(chǎn)地相同化學(xué)成分有15種，其中檸檬烯(4.67 %～12.75 %)、β-羅勒烯(0.36 %～8.73 %)、萜品油烯(0.40 %～16.63 %)、β-石竹烯(18.04 %～51.21 %)等含量較高，可以作為萬(wàn)壽菊花揮發(fā)油質(zhì)量標(biāo)志物，對(duì)今后萬(wàn)壽菊花的鑒定和品質(zhì)研究提供一個(gè)參考。不同產(chǎn)地相同揮發(fā)性成分含量存在較大差異，β-石竹烯含量分別為廣東51.21 %、廣西48.37 %、貴州18.04 %、云南23.39 %、山東36.97 %、安徽36.27 %、內(nèi)蒙34.47 %、新疆23.21 %、陜西41.55 %、河南18.17 %，可能是不同地區(qū)受土壤、氣候等環(huán)境因素的影響。

通過對(duì)HS-SPME-GC/MS分析出的有效數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，10個(gè)不同產(chǎn)地萬(wàn)壽菊花中揮發(fā)性成分含量存在差異；聚類分析將不同產(chǎn)地萬(wàn)壽菊花分為4類，反映出不同產(chǎn)地萬(wàn)壽菊花間的共性和差異與其它們之間的親緣關(guān)系。以上數(shù)據(jù)為進(jìn)一步研究萬(wàn)壽菊質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考與借鑒。