結(jié)直腸癌研究熱點(diǎn)之腫瘤異質(zhì)性研究進(jìn)展

胡 邦，任東林

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)發(fā)布的最新報(bào)告顯示，全球CRC總體發(fā)病率、死亡率分別上升至第三位和第二位。到2020年，CRC占全球新發(fā)癌癥病例的10%(190萬(wàn))和死亡病例的9.4%(90萬(wàn))。遺傳因素和環(huán)境危險(xiǎn)因素在CRC的發(fā)生發(fā)展中都起著重要作用，家族遺傳背景主要影響個(gè)體患病風(fēng)險(xiǎn)，而環(huán)境因素，包括飲食和生活方式，影響人群的發(fā)病率。僅10%～20%的CRC患者有陽(yáng)性家族史，提示大多數(shù)CRC是散發(fā)性。根據(jù)世界癌癥研究基金(World Cancer Research Fund，WCRF)/美國(guó)癌癥研究所(American Institute for Cancer Research，AICR)持續(xù)更新的項(xiàng)目報(bào)告，吸煙、肥胖、低體力活動(dòng)、西方飲食習(xí)慣和酒精增加了CRC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。TNM腫瘤分期系統(tǒng)由美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)(American Joint Committee on Cancer，AJCC)和國(guó)際抗癌聯(lián)盟(Union for International Cancer Control，UICC)共同制定，是目前臨床對(duì)患者進(jìn)行分層診治最可靠的預(yù)后參數(shù)。TNM分期系統(tǒng)描述了腫瘤侵入整個(gè)腸壁的深度(T)、轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)數(shù)量(N)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況(M)。根據(jù)T、N和M分類將腫瘤分為4個(gè)不同的階段，具有不同的預(yù)后和治療結(jié)局。Ⅰ期CRC患者的5年生存率為94%，Ⅱ期CRC患者的5年生存率為82%，Ⅲ期CRC患者則下降至67%，而轉(zhuǎn)移性或Ⅳ期CRC的5年生存率只有11%。CRC治療策略高度依賴于診斷時(shí)的臨床分期，手術(shù)被認(rèn)為是Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期CRC患者的一線治療方法，術(shù)后Ⅲ期和合并高危險(xiǎn)因素的Ⅱ期CRC患者追加輔助化療。在Ⅳ期CRC患者中，可切除轉(zhuǎn)移瘤CRC患者的治療選擇包括新輔助化療、原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶切除術(shù)。如果存在廣泛不可切除的轉(zhuǎn)移病灶，主要行姑息性化療或放射治療緩解臨床癥狀。盡管CRC的治療在過(guò)去的20年里取得了明顯進(jìn)展，但是，即使在相同的TNM分期階段，不同患者的生存率仍然有較大的差異。近10年來(lái)，研究人員認(rèn)識(shí)到這些CRC患者預(yù)后的差異可部分用腫瘤生物學(xué)行為的差異來(lái)解釋，CRC被認(rèn)為是一種高度異質(zhì)性和動(dòng)態(tài)性的疾病，在整個(gè)腫瘤進(jìn)化過(guò)程中通過(guò)多種分子途徑表現(xiàn)出來(lái)。近年對(duì)CRC基因組差異表達(dá)和腫瘤異質(zhì)性的認(rèn)識(shí)，導(dǎo)致治療方式向個(gè)性化用藥的逐步轉(zhuǎn)變。腫瘤異質(zhì)性是近年來(lái)各類腫瘤研究的熱點(diǎn)方向，可分為腫瘤間異質(zhì)性和腫瘤內(nèi)異質(zhì)性。腫瘤間異質(zhì)性包括患者之間相同組織學(xué)類型腫瘤的差異，更罕見(jiàn)的是發(fā)生在單個(gè)患者內(nèi)的多原發(fā)CRC的差異。腫瘤內(nèi)異質(zhì)性可分為空間異質(zhì)性和時(shí)間異質(zhì)性?？臻g異質(zhì)性是指在原發(fā)腫瘤部位內(nèi)的不同亞群腫瘤細(xì)胞或原發(fā)腫瘤與轉(zhuǎn)移病灶之間的差異；時(shí)間異質(zhì)性是指CRC的動(dòng)態(tài)進(jìn)化性，隨著時(shí)間的推移，瘤內(nèi)腫瘤細(xì)胞發(fā)生基因改變。CRC的異質(zhì)性研究已經(jīng)在不同的細(xì)胞分子水平上進(jìn)行了探討，包括基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、組織病理學(xué)特征和炎癥浸潤(rùn)的特征。本文將概述CRC腫瘤間和腫瘤內(nèi)異質(zhì)性研究進(jìn)展，并進(jìn)一步探討腫瘤異質(zhì)性對(duì)治療決策的影響以及不同生物標(biāo)志物的預(yù)后價(jià)值。

1 腫瘤間異質(zhì)性

CRC在組織病理、細(xì)胞分子不同水平上存在差異，導(dǎo)致預(yù)后和治療反應(yīng)不同，即使是具有相同TNM分期的CRC患者。這些差異需要我們進(jìn)一步完善現(xiàn)有的分期系統(tǒng)，以便更好地指導(dǎo)CRC的治療和預(yù)后預(yù)測(cè)。目前臨床上常用的CRC診斷檢查方案包括TNM分期、病理組織生物標(biāo)志物分析和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(microsatellite instability,MSI)分析。當(dāng)CRC患者出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移時(shí)，KRAS、NRAS和BRAF突變狀態(tài)的確定是至關(guān)重要的，以優(yōu)化治療的選擇和指導(dǎo)抗表皮生長(zhǎng)因子受體的靶向治療。

1

.

1

腫瘤間組織病理學(xué)異質(zhì)性 WHO根據(jù)CRC組織病理學(xué)表現(xiàn)定義了CRC的不同組織學(xué)亞型。如果觀察癌組織中腺體的結(jié)構(gòu)且沒(méi)有過(guò)多的黏液產(chǎn)生，則腫瘤被評(píng)估為腺癌。當(dāng)超過(guò)50%的腫瘤組織內(nèi)產(chǎn)生黏液時(shí)，該腫瘤被評(píng)估為黏液腺癌。黏液性癌占所有CRC的10%左右，主要位于右半結(jié)腸，其MSI-H比例較高，且KRAS、BRAF和PIK3CA突變率較高。CRC黏液腺癌的預(yù)后目前存在一些爭(zhēng)議，黏液腺癌最初被認(rèn)為是CRC預(yù)后差的組織學(xué)類型。然而，當(dāng)糾正術(shù)后TNM分期時(shí)，沒(méi)有觀察到腺癌和黏液腺癌患者的生存預(yù)后存在顯著差異。印戒細(xì)胞癌是CRC少見(jiàn)的組織學(xué)亞型，占CRC比例不到1%。它的特征是印戒細(xì)胞的增殖，細(xì)胞內(nèi)有黏液湖，將細(xì)胞核推向胞漿外周。印戒細(xì)胞癌通常在年輕患者中被診斷，在多達(dá)40%的病例中觀察到其與右半結(jié)腸和MSI狀態(tài)相關(guān)。印戒細(xì)胞癌在早期就容易轉(zhuǎn)移到肝臟、腹膜和卵巢等多個(gè)部位，而腺癌的轉(zhuǎn)移大部分只轉(zhuǎn)移到肝臟。髓樣癌是CRC另一種罕見(jiàn)的組織學(xué)亞型，每10萬(wàn)例CRC中僅有5～8例。髓樣癌分化差，其特征是腫瘤細(xì)胞排列呈片狀或巢狀，上皮組織內(nèi)大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，并罕見(jiàn)腺體形成。與黏液腺癌類似，髓樣癌在右半結(jié)腸更為常見(jiàn)，并與MSI(高達(dá)60%的病例)和BRAF突變(約85%的病例)密切相關(guān)。髓質(zhì)分化被認(rèn)為是CRC的一個(gè)良好的預(yù)后標(biāo)志物，髓樣癌通常不發(fā)生壁外浸潤(rùn)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。髓樣癌中的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)促進(jìn)了抗腫瘤相關(guān)炎癥反應(yīng)，從而防止腫瘤擴(kuò)散和微轉(zhuǎn)移的發(fā)生。不同的組織學(xué)亞型闡明了CRC組織病理學(xué)特征的異質(zhì)性，對(duì)應(yīng)不同的進(jìn)化途徑，并可預(yù)測(cè)治療反應(yīng)。雖然已經(jīng)有一些研究探討了不同組織學(xué)亞型對(duì)預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值，但很少有研究探討其在治療決策中的作用。此外，一些典型組織病理學(xué)特征，也有助于了解CRC的異質(zhì)性和生物學(xué)行為。腫瘤出芽是腫瘤組織中常見(jiàn)的病理特征，其在20%～40%的CRC病例中觀察到。腫瘤出芽被認(rèn)為是腫瘤轉(zhuǎn)移的第一步，出芽細(xì)胞被認(rèn)為已經(jīng)通過(guò)細(xì)胞外基質(zhì)遷移，侵襲淋巴脈管組織，并在淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處形成轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞集落。同時(shí)，腫瘤出芽與低分化簇的存在密切相關(guān)，這種現(xiàn)象可以預(yù)測(cè)CRC預(yù)后不良。然而，腫瘤出芽在預(yù)測(cè)治療反應(yīng)方面的作用尚未明確。

1

.

2

腫瘤間分子異質(zhì)性

1.2.1 發(fā)病機(jī)制的異質(zhì)性 CRC的發(fā)生主要有3種途徑：染色體不穩(wěn)定性(chromosome instability,CIN)導(dǎo)致70%～90%的CRC；CpG島甲基化表型(CpG island methylator phenotype,CIMP)導(dǎo)致10%～20%的CRC；錯(cuò)配修復(fù)基因突變(different mis-match repair,dMMR)。根據(jù)Fearon和Vogelstein在1990年提出的模型，大多數(shù)散發(fā)性CRC(約占85%)來(lái)自腺瘤癌變，它們的特征是CIN、陰性的CIMP、微衛(wèi)星穩(wěn)定性(microsatellite stable，MSS)以及KRAS突變和BRAF野生型基因。約15%的CRC起源于鋸齒狀腺瘤癌變，其途徑以CIMP、MSI和BRAF突變?yōu)樘卣鳌SI這類腫瘤中的一部分具有顯著升高的基因突變率[高腫瘤突變負(fù)荷(tumor mutational burden,TMB)]，其特征是dMMR并MSI-H/L。左側(cè)和右側(cè)CRC腫瘤的不同來(lái)源導(dǎo)致不同的基因表達(dá)和突變譜，最終影響預(yù)后。右側(cè)腫瘤顯示出更高頻率的BRAF突變和MSI，并傾向于發(fā)生在具有CRC遺傳易感性的患者中。相反，左側(cè)腫瘤的特征是CIN和涉及表皮生長(zhǎng)因子受體通路激活的基因突變。此外，與左側(cè)腫瘤相比，右側(cè)腫瘤的突變數(shù)量明顯增加。

1.2.2 MSI狀態(tài) MSI患者占CRC病例的15%，其特征是DNA錯(cuò)配修復(fù)( mis-match repair,MMR)系統(tǒng)存在缺陷，導(dǎo)致微衛(wèi)星水平上的基因組不穩(wěn)定。MMR系統(tǒng)的缺陷導(dǎo)致DNA修復(fù)不足，從而導(dǎo)致高水平的DNA復(fù)制錯(cuò)誤。在散發(fā)性CRC，MSI腫瘤是通過(guò)MMR基因的高甲基化修飾，而在Lynch綜合征患者，失活突變存在于MMR基因。MSI腫瘤通常位于右邊結(jié)腸，伴有組織分化低，以及大量腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(tumor infiltrating lymphocyte,TIL)浸潤(rùn)和腫瘤周圍Crohn樣反應(yīng)。MSI腫瘤不太容易發(fā)生淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，是腫瘤預(yù)后良好的標(biāo)志。

1.2.3 分子分型 在這個(gè)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的時(shí)代，傳統(tǒng)的腫瘤形態(tài)學(xué)分類不能完全體現(xiàn)CRC異質(zhì)性，不能適應(yīng)現(xiàn)代腫瘤治療的需要。需要依據(jù)CRC的異質(zhì)性特征進(jìn)行分子分型，指導(dǎo)CRC的精準(zhǔn)化治療。2015年，CRC亞型聯(lián)盟對(duì)這些數(shù)據(jù)集進(jìn)行了聯(lián)合分析和聚類分析，得到了4個(gè)具有獨(dú)特特征的共識(shí)分子亞型(consensus molecular subgroups,CMS)，1個(gè)亞組缺乏特異性分子特征。CMS1，是一類以CD8細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞浸潤(rùn)和高突變頻率為特征的CRC；CMS2，是具有上皮標(biāo)志物表達(dá)和Wnt通路激活的CIN腫瘤；CMS3，是一種同時(shí)包含MSI和MSS狀態(tài)、高代謝活性和KRAS突變的CRC；CMS4，被稱為間充質(zhì)亞型，包括具有較高的間質(zhì)含量和腫瘤生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)，并且CMS4患者的總生存率最差。然而，仍有13%的CRC病例不能被分類，導(dǎo)致第5種亞型沒(méi)有明確的分子特征。這表明需要進(jìn)一步對(duì)CRC基因組和表觀基因組分析，以增加對(duì)CRC生物學(xué)行為的了解，并獲得更好的疾病分層。

1

.

3

炎癥異質(zhì)性 越來(lái)越多的證據(jù)表明，CRC的發(fā)生發(fā)展不僅取決于腫瘤細(xì)胞本身的基因變化，還取決于腫瘤細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境之間復(fù)雜的相互作用。腫瘤微環(huán)境由上皮細(xì)胞、血液、淋巴管、基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞組成，其中起到重要作用的免疫細(xì)胞既可以通過(guò)識(shí)別并殺滅腫瘤細(xì)胞抑制腫瘤生長(zhǎng)，也可以通過(guò)過(guò)度誘導(dǎo)腫瘤進(jìn)展控制適應(yīng)性免疫反應(yīng)，刺激腫瘤細(xì)胞的增殖和存活，促進(jìn)血管生成和轉(zhuǎn)移。大量研究已經(jīng)證明了MSI腫瘤被TIL高度浸潤(rùn)，這提示TIL可能是一個(gè)有益的預(yù)后因素。Galon等發(fā)現(xiàn)，相比目前CRC組織病理學(xué)分期，腫瘤組織中免疫細(xì)胞的分布和密度可以更好地預(yù)測(cè)患者的預(yù)后。該研究設(shè)計(jì)了基于腫瘤中心和周圍T淋巴細(xì)胞(特別是細(xì)胞毒性T細(xì)胞和記憶T細(xì)胞)的定量免疫評(píng)分，同時(shí)該研究結(jié)果證明免疫評(píng)分是CRC患者的預(yù)后相關(guān)指標(biāo)。近10年在腫瘤免疫學(xué)研究方面的進(jìn)展也使CRC免疫治療取得了巨大進(jìn)步。免疫檢查點(diǎn)阻斷治療(immune checkpoint therapy)是一個(gè)熱門研究方向，這類藥物的作用機(jī)制是通過(guò)解除腫瘤細(xì)胞對(duì)宿主的逃逸，進(jìn)而促進(jìn)宿主免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。

2 腫瘤內(nèi)異質(zhì)性

腫瘤內(nèi)異質(zhì)性被描述為在一個(gè)腫瘤中存在不同的亞克隆現(xiàn)象，這種腫瘤內(nèi)異質(zhì)性與進(jìn)化過(guò)程中產(chǎn)生了基因不同的亞克隆腫瘤細(xì)胞有關(guān)，也與腫瘤組織中完全分化的癌細(xì)胞和未成熟的癌癥干細(xì)胞的共存有關(guān)。CRC內(nèi)異質(zhì)性主要表現(xiàn)為腫瘤內(nèi)組織病理學(xué)異質(zhì)性和腫瘤內(nèi)分子異質(zhì)性。

2

.

1

腫瘤內(nèi)組織病理學(xué)異質(zhì)性 腫瘤內(nèi)組織病理學(xué)異質(zhì)性定義為一個(gè)腫瘤內(nèi)包含2種或以上形態(tài)學(xué)腫瘤細(xì)胞混合生長(zhǎng)的特征，如腺癌、黏液或髓質(zhì)。與MSS腫瘤相比，MSI腫瘤組織病理學(xué)水平的異質(zhì)性已被證明更為廣泛。De Smedt等研究發(fā)現(xiàn)，超過(guò)50%的MSI腫瘤顯示混合形態(tài)生長(zhǎng)模式，這種混合形態(tài)的特征僅在10%的MSS腫瘤中可見(jiàn)。除了存在形態(tài)學(xué)生長(zhǎng)模式外，在同一個(gè)腫瘤組織病理中還觀察到炎癥浸潤(rùn)(T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)的變化。同樣，與MSS腫瘤相比，這些差異在MSI腫瘤中更為常見(jiàn)，并且與腫瘤的形態(tài)學(xué)生長(zhǎng)模式高度相關(guān)。

2

.

2

腫瘤內(nèi)分子異質(zhì)性

2.2.1 原發(fā)腫瘤內(nèi)分子異質(zhì)性 Baisse等研究表明，在腫瘤內(nèi)15～20個(gè)區(qū)域組織檢測(cè)基因改變和雜合性缺失(loss of heterozygosity,LOH)時(shí)，發(fā)現(xiàn)67%的晚期CRC存在腫瘤內(nèi)分子異質(zhì)性，這表明了腫瘤取樣的重要性。在大多數(shù)研究中，當(dāng)組織被福爾馬林固定和石蠟包埋時(shí)，沒(méi)有考慮到特定的組織區(qū)域圖譜，因此無(wú)法分析腫瘤內(nèi)特定位置之間的異質(zhì)性。當(dāng)考慮術(shù)前新輔助治療時(shí)，方案制定通常是基于從腫瘤表面進(jìn)行的抽樣活檢的狀態(tài)，故有時(shí)會(huì)導(dǎo)致不恰當(dāng)?shù)闹委煕Q定。因此，建議從腫瘤的不同部位至少進(jìn)行2次活檢，以避免取樣錯(cuò)誤導(dǎo)致沒(méi)有準(zhǔn)確地評(píng)估腫瘤內(nèi)異質(zhì)性。Suzuki等研究發(fā)現(xiàn)，在不同的CRC患者中，使用靶向二代測(cè)序(next generation sequencing,NGS)和三代擴(kuò)增子測(cè)序觀察到腫瘤內(nèi)異質(zhì)性的差異。在對(duì)4例CRC患者的24例標(biāo)本的分析中，通過(guò)NGS發(fā)現(xiàn)不同的腫瘤區(qū)域在APC、KRAS和TP53等驅(qū)動(dòng)基因突變情況高度一致。然而，進(jìn)一步通過(guò)擴(kuò)增子測(cè)序方法發(fā)現(xiàn)在原發(fā)腫瘤周圍的亞克隆水平上存在大量突變，在MSI腫瘤中觀察到更廣泛的腫瘤內(nèi)分子差異。

2.2.2 原發(fā)性腫瘤與轉(zhuǎn)移瘤之間的分子差異 大多數(shù)情況下，原發(fā)性結(jié)直腸腫瘤和轉(zhuǎn)移瘤的基因突變圖譜是一致的。Brannon等證明了KRAS、NRAS和BRAF的突變分析結(jié)果顯示，在原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移組織中發(fā)現(xiàn)的結(jié)果完全匹配。這一發(fā)現(xiàn)也適用于其他驅(qū)動(dòng)基因，如APC、TP53和PIK3CA。然而，數(shù)量遠(yuǎn)多于驅(qū)動(dòng)基因的“乘客性”突變，常常在原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移瘤之間產(chǎn)生異質(zhì)性。在微衛(wèi)星狀態(tài)方面，Galon等也觀察到原發(fā)腫瘤與其轉(zhuǎn)移病灶之間的MSI狀態(tài)的高度一致性，只有在有限數(shù)量的病例中觀察到MSS轉(zhuǎn)移與MSI原發(fā)腫瘤。由于散發(fā)性背景下的MSI是MMR基因的表觀遺傳沉默的結(jié)果，因此原發(fā)性腫瘤和轉(zhuǎn)移瘤的MSI狀態(tài)的差異是非?？赡艿摹Ｈ藗兤毡檎J(rèn)為，MSI在腫瘤的起始階段很重要，而對(duì)腫瘤的進(jìn)展并不重要。因此，MSI已經(jīng)表現(xiàn)在癌癥進(jìn)展的早期階段，這也解釋了為什么在MSI原發(fā)腫瘤的轉(zhuǎn)移中可見(jiàn)MSI的丟失。但迄今為止，在MSS腫瘤的轉(zhuǎn)移過(guò)程中還沒(méi)有觀察到MSI的出現(xiàn)。

3 結(jié)語(yǔ)

CRC是一種高度異質(zhì)性的疾病，因此，非常需要精準(zhǔn)的疾病分層來(lái)區(qū)別腫瘤間和腫瘤內(nèi)的異質(zhì)性。在病理報(bào)告中總結(jié)MSI狀態(tài)、TNM分期、淋巴管浸潤(rùn)、腫瘤出芽、腫瘤分化以及BRAF、KRAS、NRAS突變狀態(tài)是很重要的。它們共同提供了疾病行為、疾病進(jìn)展和預(yù)后的指示，并指導(dǎo)治療決策。預(yù)計(jì)腫瘤免疫評(píng)分和分子分型將被添加到未來(lái)的病理報(bào)告中，進(jìn)一步提供大量關(guān)于預(yù)后和對(duì)靶向、免疫治療反應(yīng)的信息。展望未來(lái)，伴隨多區(qū)域和組學(xué)測(cè)序、單細(xì)胞測(cè)序以及縱向液體活檢方法的廣泛應(yīng)用，我們?cè)谂R床上對(duì)腫瘤異質(zhì)性的評(píng)估將更加精確，進(jìn)而促進(jìn)更有效的CRC個(gè)性化精準(zhǔn)治療。