馬曉惠 王增強(qiáng) 程曉蕾 毛婷婷 陳 宏(天津市人民醫(yī)院皮膚科,天津 300121)
銀屑病是一種常見(jiàn)的以皮膚鱗屑性紅斑為特征的慢性炎癥性皮膚病,以皮損處微血管異常增生為主要病理表現(xiàn)[1-2]。近十年有關(guān)銀屑病與血管新生的研究越來(lái)越多,相關(guān)領(lǐng)域?qū)W者一直致力于探究治療銀屑病的新靶點(diǎn),而中醫(yī)藥治療血管相關(guān)疾病具有豐富經(jīng)驗(yàn)[3]。黃芩素(Baicalein)是從黃芩根中提取的黃酮類單體化合物,對(duì)炎癥、腫瘤、纖維化性疾病、心腦血管性疾病及神經(jīng)性疾病均具有良好防治作用[4-5]。臨床上大黃、黃芩用于治療銀屑病有一定療效,但黃芩素對(duì)銀屑病的治療作用尚未見(jiàn)報(bào)道。既往研究表明,黃芩素能通過(guò)抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表達(dá)抑制血管生成,推測(cè)黃芩素可通過(guò)抑制皮損組織血管新生改善銀屑病樣皮損[6-8]。本研究擬采用咪喹莫特誘導(dǎo)小鼠銀屑病模型,觀察不同濃度黃芩素對(duì)小鼠皮損組織病理學(xué)變化及炎癥因子表達(dá)的影響,探討其可能作用機(jī)制,為銀屑病防治提供參考。
1.1 材料
1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物60只8周齡雄性SPF級(jí)BALB/c小鼠,體質(zhì)量(20±2)g,由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供,許可證號(hào):SCXK(京)2019-0011。飼養(yǎng)條件:22~24℃,50%~65%相對(duì)濕度,12 h光/12 h暗循環(huán),自由進(jìn)食和飲水,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
1.1.2 試劑與儀器黃芩素(純度≥98%,上海阿拉丁生化科技股份有限公司);咪喹莫特乳膏(四川明欣藥業(yè)有限責(zé)任公司);IL-17、IL-23、TNF-α、IFN-γ ELISA檢測(cè)試劑盒(武漢愛(ài)博泰克生物公司);HE染色試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、蛋白裂解液(上海碧云天生物技術(shù)公司);CD31、TGF-β1、VEGF、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor,CTGF)、GAPDH抗體(美國(guó)Abcam公司);7500熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司);電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司);多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司);RM2016病理切片機(jī)(上海萊卡儀器有限公司)。
1.2 方法
1.2.1 分組及建模60只BALB/c小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、地塞米松組(5 mg/kg)、黃芩素低(15 mg/kg)、中(30 mg/kg)、高(60 mg/kg)劑量組,每組10只。脫去所有小鼠背部毛發(fā)(2 cm×3 cm),空白對(duì)照組小鼠背部涂抹62.5 mg凡士林,同時(shí)灌胃給予生理鹽水(0.2 ml/只);其余各組小鼠背部涂抹62.5 mg 5%咪喹莫特乳膏,模型組小鼠灌胃給予生理鹽水(0.2 ml/只),地塞米松組小鼠灌胃給予地塞米松溶液(5 mg/kg,0.2 ml/只);黃芩素低、中、高劑量組小鼠灌胃給予黃芩素溶液(15、30、60 mg/kg,0.2 ml/只),1次/d,共7 d。
1.2.2 銀屑病皮損面積及嚴(yán)重程度(PASI)評(píng)分涂抹咪喹莫特乳膏第1天開(kāi)始,每天觀察并記錄各組小鼠皮損變化,根據(jù)PASI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)小鼠皮損處紅斑、鱗屑、表皮厚度情況進(jìn)行評(píng)分,0分:無(wú)損傷;1分:輕度損傷;2分:中度損傷;3分:重度損傷;4分:極重度損傷,各指標(biāo)分?jǐn)?shù)總和為最終得分,總分12分,評(píng)分越高代表銀屑病情況越嚴(yán)重[9]。
1.2.3 HE染色觀察小鼠皮膚組織病理學(xué)變化取各組小鼠背部部分皮損組織,4%多聚甲醛溶液固定24 h,梯度乙醇脫水,石蠟包埋并切片,按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行HE染色,顯微鏡下觀察拍照。
1.2.4 ELISA檢測(cè)皮膚組織IL-17、IL-23、TNF-α、IFN-γ含量取小鼠皮損組織,加入裂解液冰浴超聲勻漿,吸取勻漿置于離心管,4℃、12 000 r/min離心10 min,吸取上清保存待用。按照ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作,吸取等量上清置于96孔板,酶標(biāo)儀測(cè)定各孔光密度(OD450),根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)液結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算皮膚組織IL-17、IL-23、TNF-α和IFN-γ含量。
1.2.5 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)皮損組織微血管密度(MVD)取1.2.3制備的皮損組織石蠟切片,按照免疫組化試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行CD31染色,顯微鏡下可觀察到陽(yáng)性染色部分為棕黃色,選取血管密度較高區(qū)域,高倍鏡下選取3個(gè)密度較大視野進(jìn)行微血管計(jì)數(shù)并取平均值,MVD以每平方毫米的毛細(xì)血管數(shù)為單位進(jìn)行計(jì)算(個(gè)/mm2)。
1.2.6 qRT-PCR檢測(cè)皮膚組織TGF-β1、CTGF和VEGF mRNA水平取各組小鼠背部皮損組織冰浴勻漿,加入Trizol混勻,靜置孵育20 min充分提取樣本RNA,4℃、12 000 r/min離心20 min,移除上清,底部白色沉淀即為RNA,溶解底部RNA,紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA濃度,按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA,以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性15 s,95℃變性10 s,60℃退火20 s,72℃延伸32 s,40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參,2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá),引物序列見(jiàn)表1。
表1 引物序列Tab.1 Primer sequences
1.2.7 Western blot檢測(cè)皮損組織TGF-β1、CTGF和VEGF蛋白表達(dá)取小鼠背部皮膚組織,RIPA裂解液裂解組織提取總蛋白,BCA法測(cè)定蛋白濃度,取等量蛋白進(jìn)行凝膠電泳分離,轉(zhuǎn)至PVDF膜,5%脫脂奶粉室溫封閉3 h,加入TGF-β1、CTGF、VEGF和GAPDH一抗稀釋液(1∶1 000)4℃孵育過(guò)夜,洗滌,添加HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h,ECL發(fā)光顯影,光凝膠成像儀中成像,Image J圖像分析軟件分析,以目的條帶與GAPDH灰度值比值作為目的蛋白相對(duì)表達(dá)。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以±s表示,多組間比較采用單方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 黃芩素對(duì)小鼠皮損的影響與空白對(duì)照組相比,模型組小鼠皮膚在涂抹咪喹莫特乳膏1 d后即出現(xiàn)紅斑,第2、3天出現(xiàn)鱗屑,隨著時(shí)間推移皮損日益嚴(yán)重,紅斑由淡粉色小斑點(diǎn)變?yōu)榇竺娣e暗紅色斑塊,鱗屑增多成片狀,皮膚增厚浸潤(rùn)明顯。與模型組同期相比,黃芩素中、高劑量組及地塞米松組小鼠皮損癥狀明顯減輕,鱗屑稀少,浸潤(rùn)增厚不明顯,紅斑色淺,但黃芩素低劑量組皮損情況變化不明顯。與空白對(duì)照組相比,模型組小鼠PASI評(píng)分顯著提高(P<0.05),與模型組相比,黃芩素中、高劑量組及地塞米松組小鼠PASI評(píng)分顯著降低(P<0.05),黃芩素低劑量組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,表2)。
表2 小鼠PASI評(píng)分比較(±s,n=10)Tab.2 Comparison of PASI scores in mice(±s,n=10)
表2 小鼠PASI評(píng)分比較(±s,n=10)Tab.2 Comparison of PASI scores in mice(±s,n=10)
Note:Compared with control group,1)P<0.05;compared with model group,2)P<0.05.
Groups Control Model Dex Baicalein low-dose Baicalein medium-dose Baicalein high-dose 1 d 0 0 0 0 0 0 2 d 0.22±0.01 1.15±0.041)0.76±0.032)1.09±0.06 0.94±0.062)0.85±0.072)3 d 0.20±0.05 2.56±0.331)1.37±0.092)2.42±0.14 2.07±0.102)1.69±0.112)4 d 0.26±0.05 4.14±0.141)2.05±0.112)4.01±0.17 3.38±0.122)2.89±0.162)5 d 0.23±0.04 6.48±0.181)2.99±0.172)6.32±0.10 5.61±0.152)4.26±0.142)6 d 0.20±0.06 8.48±0.111)4.47±0.142)8.32±0.09 7.40±0.212)6.04±0.202)7 d 0.19±0.07 9.79±0.221)5.85±0.172)9.56±0.26 8.46±0.192)7.70±0.212)
2.2 黃芩素對(duì)小鼠皮膚組織病理學(xué)變化的影響空白對(duì)照組小鼠皮膚表皮層薄且排列規(guī)則;模型組和黃芩素低劑量組小鼠表皮增生明顯,角質(zhì)層存在大量未完全角化角質(zhì)細(xì)胞;黃芩素中、高劑量組及地塞米松組小鼠皮膚表皮層較模型組薄,角化不全細(xì)胞明顯減少(圖1)。
圖1 各組小鼠皮膚組織病理學(xué)觀察(HE染色,×200)Fig.1 Skin histopathological observation of mice in each group(HE staining,×200)
2.3 黃芩素對(duì)小鼠皮膚組織IL-17、IL-23、TNF-α和IFN-γ含量的影響與空白對(duì)照組相比,模型組小鼠皮膚組織IL-17、IL-23、TNF-α和IFN-γ含量顯著上升(P<0.05);與模型組相比,黃芩素中、高劑量組及地塞米松組IL-17、IL-23、TNF-α和IFN-γ含量顯著下降(P<0.05),黃芩素低劑量組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,表3)。
表3 小鼠皮膚組織IL-17、IL-23、TNF-α和IFN-γ含量比較(±s,n=10,pg/ml)Tab.3 Comparison of contents of IL-17,IL-23,TNF-αand IFN-γin skin tissues(±s,n=10,pg/ml)
表3 小鼠皮膚組織IL-17、IL-23、TNF-α和IFN-γ含量比較(±s,n=10,pg/ml)Tab.3 Comparison of contents of IL-17,IL-23,TNF-αand IFN-γin skin tissues(±s,n=10,pg/ml)
Note:Compared with control group,1)P<0.05;compared with model group,2)P<0.05.
Groups Control Model Dex Baicalein low-dose Baicalein medium-dose Baicalein high-dose IL-17 151.59±15.49 470.16±17.031)236.01±15.532)431.58±20.48 372.60±28.562)288.13±19.472)IL-23 38.53±5.78 99.47±8.541)54.78±6.252)97.51±8.11 84.32±9.452)63.38±6.472)TNF-α 96.59±9.17 404.03±26.921)170.22±18.312)393.08±28.57 273.90±14.712)198.78±13.382)IFN-γ 112.81±11.33 386.63±13.661)185.90±10.852)375.33±25.73 290.25±10.532)247.97±14.982)
2.4 黃芩素對(duì)小鼠皮膚組織CD31表達(dá)及MVD值的影響CD31在血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿中表達(dá),染色后呈棕黃色(圖2)。與空白對(duì)照組(4.12±0.71)相比,模型組小鼠皮膚組織MVD值(15.49±2.32)顯著提高(P<0.05);與模型組比較,黃芩素中(10.78±1.32)、高(7.04±1.21)劑量組及地塞米松組(5.97±1.06)皮膚組織MVD值顯著降低(P<0.05),黃芩素低劑量組(14.78±1.62)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
圖2 各組小鼠皮膚組織CD31免疫組織化學(xué)染色(×400)Fig.2 CD31 immunohistochemical staining of skin tissue in each group(×400)
2.5 黃芩素對(duì)小鼠皮膚組織TGF-β1、CTGF和VEGF表達(dá)的影響與空白對(duì)照組相比,模型組小鼠皮膚組織TGF-β1、CTGF和VEGF mRNA及蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.05);與模型組相比,黃芩素中、高劑量組及地塞米松組皮膚組織TGF-β1、CTGF和VEGF mRNA及蛋白表達(dá)顯著減少(P<0.05),黃芩素低劑量組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,表4、圖3)。
圖3 Western blot檢測(cè)皮膚組織TGF-β1、CTGF和VEGF蛋白表達(dá)Fig.3 Protein expressions of TGF-β1,CTGF and VEGF in skin tissues detected by Western blot
表4 小鼠皮膚組織中TGF-β1、CTGF和VEGF mRNA及蛋白表達(dá)比較(±s,n=10)Tab.4 Comparison of mRNA and protein expressions of TGF-β1,CTGF and VEGF in skin tissue(±s,n=10)
表4 小鼠皮膚組織中TGF-β1、CTGF和VEGF mRNA及蛋白表達(dá)比較(±s,n=10)Tab.4 Comparison of mRNA and protein expressions of TGF-β1,CTGF and VEGF in skin tissue(±s,n=10)
Note:Compared with control group,1)P<0.05;compared with model group,2)P<0.05.
Groups Control Model Dex Baicalein low-dose Baicalein medium-dose Baicalein high-dose TGF-β1 mRNA 1.02±0.09 3.97±0.241)1.57±0.122)3.87±0.21 2.83±0.152)2.38±0.122)Protein 0.14±0.03 1.18±0.051)0.23±0.032)1.17±0.07 0.88±0.042)0.57±0.052)CTGF mRNA 1.02±0.07 4.00±0.221)1.61±0.072)3.93±0.16 2.99±0.112)2.38±0.102)Protein 0.07±0.03 1.07±0.081)0.18±0.042)1.07±0.08 0.80±0.072)0.31±0.042)VEGF mRNA 1.00±0.03 3.00±0.141)1.44±0.072)2.91±0.10 2.42±0.092)2.15±0.102)Protein 0.09±0.03 1.06±0.081)0.17±0.032)1.08±0.06 0.76±0.062)0.45±0.052)
銀屑病臨床治療多采用免疫抑制劑、激素類、維生素A酸類等藥物,雖有療效但易復(fù)發(fā),且副作用大,尋求經(jīng)濟(jì)、副作用小的藥物對(duì)臨床治療銀屑病具有重要意義。隨著中醫(yī)藥在銀屑病血管新生方面研究進(jìn)展,近年研究發(fā)現(xiàn),中醫(yī)藥治療銀屑病具有顯著臨床療效[10]。本研究通過(guò)向BALB/c小鼠背部涂抹咪喹莫特建立銀屑病動(dòng)物模型,采用PASI評(píng)分和HE病理染色評(píng)估各組小鼠背部皮膚病理變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn),模型組小鼠背部皮膚出現(xiàn)紅斑、表皮肥厚、鱗屑成層等現(xiàn)象,病理切片顯示表皮層增生明顯,角質(zhì)層角化不全,與既往研究一致,提示建模成功[11]。給予中劑量和高劑量黃芩素治療后,小鼠銀屑病癥狀明顯改善,銀屑病樣皮損減輕,PASI評(píng)分降低,角化不全現(xiàn)象改善,表皮厚度明顯薄于模型組,其中高劑量黃芩素改善效果接近地塞米松組,提示黃芩素能改善咪喹莫特誘導(dǎo)的小鼠銀屑病樣皮損。
現(xiàn)有研究認(rèn)為,銀屑病是一種免疫介導(dǎo)的炎癥性皮膚病,IL-23/IL-17炎癥軸在銀屑病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用[12-13]。本研究通過(guò)ELISA檢測(cè)皮損組織IL-17、IL-23、TNF-α和IFN-γ含量,結(jié)果顯示模型組炎癥因子水平均顯著上調(diào),與HAU等[14]研究結(jié)果相符,而黃芩素治療能明顯降低皮損處炎癥因子表達(dá),與病理結(jié)果炎癥浸潤(rùn)減輕一致,提示黃芩素可能通過(guò)降低銀屑病小鼠皮損組織炎癥因子水平發(fā)揮治療作用。
銀屑病發(fā)生發(fā)展和復(fù)發(fā)與微血管生成異常關(guān)系密切,而血管形成通過(guò)多種血管生成誘導(dǎo)因子和抑制因子平衡進(jìn)行調(diào)節(jié)。VEGF可通過(guò)調(diào)節(jié)血管通透性使血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生增生、遷移,促使新生血管形成[15];CTGF主要通過(guò)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞黏附,促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞存活,誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞形成管狀而促進(jìn)新生血管形成;TGF-β1也是創(chuàng)面愈合過(guò)程中一種重要的作用因子,參與成纖維細(xì)胞增生、血管再生、細(xì)胞外基質(zhì)合成與重塑等過(guò)程,而CTGF作為TGF-β1表達(dá)通路下游調(diào)節(jié)因子,在血管再生過(guò)程中和TGF-β1具有協(xié)同作用[16]。CD31主要存在于內(nèi)皮細(xì)胞表面,可反映血管增殖變化及組織形態(tài)變化,而MVD代表單位面積內(nèi)微血管數(shù),能反映組織血管生成活性[17]。本研究通過(guò)CD31免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)并計(jì)算皮損處MVD,同時(shí)檢測(cè)皮損組織TGF-β1、CTGF和VEGF表達(dá)以評(píng)估新生血管情況,結(jié)果顯示,模型組小鼠皮損MVD值及TGF-β1、CTGF和VEGF mRNA和蛋白表達(dá)顯著上升,而中劑量和高劑量黃芩素干預(yù)組相關(guān)指標(biāo)均明顯下調(diào),說(shuō)明黃芩素能通過(guò)抑制皮損組織血管新生改善銀屑病樣皮損。
綜上所述,黃芩素可通過(guò)阻斷TGF-β1/CTGF信號(hào)通路減輕炎癥反應(yīng),抑制皮損組織血管新生,從而延緩咪喹莫特誘導(dǎo)的小鼠銀屑病進(jìn)展,且黃芩素對(duì)銀屑病皮損的改善效果呈劑量依賴性。本研究可為黃芩素治療銀屑病提供依據(jù),并為其作用靶點(diǎn)及相關(guān)通路深入研究奠定了基礎(chǔ)。