黃芩素對(duì)咪喹莫特誘導(dǎo)的小鼠銀屑病樣皮損及TGF-β1/CTGF通路的影響①

馬曉惠 王增強(qiáng) 程曉蕾 毛婷婷 陳 宏（天津市人民醫(yī)院皮膚科，天津 300121）

銀屑病是一種常見(jiàn)的以皮膚鱗屑性紅斑為特征的慢性炎癥性皮膚病，以皮損處微血管異常增生為主要病理表現(xiàn)［1-2］。近十年有關(guān)銀屑病與血管新生的研究越來(lái)越多，相關(guān)領(lǐng)域?qū)W者一直致力于探究治療銀屑病的新靶點(diǎn)，而中醫(yī)藥治療血管相關(guān)疾病具有豐富經(jīng)驗(yàn)［3］。黃芩素（Baicalein）是從黃芩根中提取的黃酮類單體化合物，對(duì)炎癥、腫瘤、纖維化性疾病、心腦血管性疾病及神經(jīng)性疾病均具有良好防治作用［4-5］。臨床上大黃、黃芩用于治療銀屑病有一定療效，但黃芩素對(duì)銀屑病的治療作用尚未見(jiàn)報(bào)道。既往研究表明，黃芩素能通過(guò)抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表達(dá)抑制血管生成，推測(cè)黃芩素可通過(guò)抑制皮損組織血管新生改善銀屑病樣皮損［6-8］。本研究擬采用咪喹莫特誘導(dǎo)小鼠銀屑病模型，觀察不同濃度黃芩素對(duì)小鼠皮損組織病理學(xué)變化及炎癥因子表達(dá)的影響，探討其可能作用機(jī)制，為銀屑病防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物60只8周齡雄性SPF級(jí)BALB/c小鼠，體質(zhì)量（20±2）g，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供，許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0011。飼養(yǎng)條件：22～24℃，50%～65%相對(duì)濕度，12 h光/12 h暗循環(huán)，自由進(jìn)食和飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 試劑與儀器黃芩素（純度≥98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；咪喹莫特乳膏（四川明欣藥業(yè)有限責(zé)任公司）；IL-17、IL-23、TNF-α、IFN-γ ELISA檢測(cè)試劑盒（武漢愛(ài)博泰克生物公司）；HE染色試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、蛋白裂解液（上海碧云天生物技術(shù)公司）；CD31、TGF-β1、VEGF、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（connective tissue growth factor，CTGF）、GAPDH抗體（美國(guó)Abcam公司）；7500熒光定量PCR儀（美國(guó)ABI公司）；電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）；多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo公司）；RM2016病理切片機(jī)（上海萊卡儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組及建模60只BALB/c小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、地塞米松組（5 mg/kg）、黃芩素低（15 mg/kg）、中（30 mg/kg）、高（60 mg/kg）劑量組，每組10只。脫去所有小鼠背部毛發(fā)（2 cm×3 cm），空白對(duì)照組小鼠背部涂抹62.5 mg凡士林，同時(shí)灌胃給予生理鹽水（0.2 ml/只）；其余各組小鼠背部涂抹62.5 mg 5%咪喹莫特乳膏，模型組小鼠灌胃給予生理鹽水（0.2 ml/只），地塞米松組小鼠灌胃給予地塞米松溶液（5 mg/kg，0.2 ml/只）；黃芩素低、中、高劑量組小鼠灌胃給予黃芩素溶液（15、30、60 mg/kg，0.2 ml/只），1次/d，共7 d。

1.2.2 銀屑病皮損面積及嚴(yán)重程度（PASI）評(píng)分涂抹咪喹莫特乳膏第1天開(kāi)始，每天觀察并記錄各組小鼠皮損變化，根據(jù)PASI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)小鼠皮損處紅斑、鱗屑、表皮厚度情況進(jìn)行評(píng)分，0分：無(wú)損傷；1分：輕度損傷；2分：中度損傷；3分：重度損傷；4分：極重度損傷，各指標(biāo)分?jǐn)?shù)總和為最終得分，總分12分，評(píng)分越高代表銀屑病情況越嚴(yán)重［9］。

1.2.3 HE染色觀察小鼠皮膚組織病理學(xué)變化取各組小鼠背部部分皮損組織，4%多聚甲醛溶液固定24 h，梯度乙醇脫水，石蠟包埋并切片，按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行HE染色，顯微鏡下觀察拍照。

1.2.4 ELISA檢測(cè)皮膚組織IL-17、IL-23、TNF-α、IFN-γ含量取小鼠皮損組織，加入裂解液冰浴超聲勻漿，吸取勻漿置于離心管，4℃、12 000 r/min離心10 min，吸取上清保存待用。按照ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，吸取等量上清置于96孔板，酶標(biāo)儀測(cè)定各孔光密度（OD450），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)液結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算皮膚組織IL-17、IL-23、TNF-α和IFN-γ含量。

1.2.5 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)皮損組織微血管密度（MVD）取1.2.3制備的皮損組織石蠟切片，按照免疫組化試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行CD31染色，顯微鏡下可觀察到陽(yáng)性染色部分為棕黃色，選取血管密度較高區(qū)域，高倍鏡下選取3個(gè)密度較大視野進(jìn)行微血管計(jì)數(shù)并取平均值，MVD以每平方毫米的毛細(xì)血管數(shù)為單位進(jìn)行計(jì)算（個(gè)/mm2）。

1.2.6 qRT-PCR檢測(cè)皮膚組織TGF-β1、CTGF和VEGF mRNA水平取各組小鼠背部皮損組織冰浴勻漿，加入Trizol混勻，靜置孵育20 min充分提取樣本RNA，4℃、12 000 r/min離心20 min，移除上清，底部白色沉淀即為RNA，溶解底部RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA濃度，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性15 s，95℃變性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸32 s，40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)，引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.7 Western blot檢測(cè)皮損組織TGF-β1、CTGF和VEGF蛋白表達(dá)取小鼠背部皮膚組織，RIPA裂解液裂解組織提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，取等量蛋白進(jìn)行凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉3 h，加入TGF-β1、CTGF、VEGF和GAPDH一抗稀釋液（1∶1 000）4℃孵育過(guò)夜，洗滌，添加HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，ECL發(fā)光顯影，光凝膠成像儀中成像，Image J圖像分析軟件分析，以目的條帶與GAPDH灰度值比值作為目的蛋白相對(duì)表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黃芩素對(duì)小鼠皮損的影響與空白對(duì)照組相比，模型組小鼠皮膚在涂抹咪喹莫特乳膏1 d后即出現(xiàn)紅斑，第2、3天出現(xiàn)鱗屑，隨著時(shí)間推移皮損日益嚴(yán)重，紅斑由淡粉色小斑點(diǎn)變?yōu)榇竺娣e暗紅色斑塊，鱗屑增多成片狀，皮膚增厚浸潤(rùn)明顯。與模型組同期相比，黃芩素中、高劑量組及地塞米松組小鼠皮損癥狀明顯減輕，鱗屑稀少，浸潤(rùn)增厚不明顯，紅斑色淺，但黃芩素低劑量組皮損情況變化不明顯。與空白對(duì)照組相比，模型組小鼠PASI評(píng)分顯著提高（P＜0.05），與模型組相比，黃芩素中、高劑量組及地塞米松組小鼠PASI評(píng)分顯著降低（P＜0.05），黃芩素低劑量組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表2）。

表2 小鼠PASI評(píng)分比較（±s，n=10）Tab.2 Comparison of PASI scores in mice（±s，n=10）

表2 小鼠PASI評(píng)分比較（±s，n=10）Tab.2 Comparison of PASI scores in mice（±s，n=10）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05.

Groups Control Model Dex Baicalein low-dose Baicalein medium-dose Baicalein high-dose 1 d 0 0 0 0 0 0 2 d 0.22±0.01 1.15±0.041）0.76±0.032）1.09±0.06 0.94±0.062）0.85±0.072）3 d 0.20±0.05 2.56±0.331）1.37±0.092）2.42±0.14 2.07±0.102）1.69±0.112）4 d 0.26±0.05 4.14±0.141）2.05±0.112）4.01±0.17 3.38±0.122）2.89±0.162）5 d 0.23±0.04 6.48±0.181）2.99±0.172）6.32±0.10 5.61±0.152）4.26±0.142）6 d 0.20±0.06 8.48±0.111）4.47±0.142）8.32±0.09 7.40±0.212）6.04±0.202）7 d 0.19±0.07 9.79±0.221）5.85±0.172）9.56±0.26 8.46±0.192）7.70±0.212）

2.2 黃芩素對(duì)小鼠皮膚組織病理學(xué)變化的影響空白對(duì)照組小鼠皮膚表皮層薄且排列規(guī)則；模型組和黃芩素低劑量組小鼠表皮增生明顯，角質(zhì)層存在大量未完全角化角質(zhì)細(xì)胞；黃芩素中、高劑量組及地塞米松組小鼠皮膚表皮層較模型組薄，角化不全細(xì)胞明顯減少（圖1）。

圖1 各組小鼠皮膚組織病理學(xué)觀察（HE染色，×200）Fig.1 Skin histopathological observation of mice in each group（HE staining，×200）

2.3 黃芩素對(duì)小鼠皮膚組織IL-17、IL-23、TNF-α和IFN-γ含量的影響與空白對(duì)照組相比，模型組小鼠皮膚組織IL-17、IL-23、TNF-α和IFN-γ含量顯著上升（P＜0.05）；與模型組相比，黃芩素中、高劑量組及地塞米松組IL-17、IL-23、TNF-α和IFN-γ含量顯著下降（P＜0.05），黃芩素低劑量組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表3）。

表3 小鼠皮膚組織IL-17、IL-23、TNF-α和IFN-γ含量比較（±s，n=10，pg/ml）Tab.3 Comparison of contents of IL-17，IL-23，TNF-αand IFN-γin skin tissues（±s，n=10，pg/ml）

表3 小鼠皮膚組織IL-17、IL-23、TNF-α和IFN-γ含量比較（±s，n=10，pg/ml）Tab.3 Comparison of contents of IL-17，IL-23，TNF-αand IFN-γin skin tissues（±s，n=10，pg/ml）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05.

Groups Control Model Dex Baicalein low-dose Baicalein medium-dose Baicalein high-dose IL-17 151.59±15.49 470.16±17.031）236.01±15.532）431.58±20.48 372.60±28.562）288.13±19.472）IL-23 38.53±5.78 99.47±8.541）54.78±6.252）97.51±8.11 84.32±9.452）63.38±6.472）TNF-α 96.59±9.17 404.03±26.921）170.22±18.312）393.08±28.57 273.90±14.712）198.78±13.382）IFN-γ 112.81±11.33 386.63±13.661）185.90±10.852）375.33±25.73 290.25±10.532）247.97±14.982）

2.4 黃芩素對(duì)小鼠皮膚組織CD31表達(dá)及MVD值的影響CD31在血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿中表達(dá)，染色后呈棕黃色（圖2）。與空白對(duì)照組（4.12±0.71）相比，模型組小鼠皮膚組織MVD值（15.49±2.32）顯著提高（P＜0.05）；與模型組比較，黃芩素中（10.78±1.32）、高（7.04±1.21）劑量組及地塞米松組（5.97±1.06）皮膚組織MVD值顯著降低（P＜0.05），黃芩素低劑量組（14.78±1.62）差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖2 各組小鼠皮膚組織CD31免疫組織化學(xué)染色（×400）Fig.2 CD31 immunohistochemical staining of skin tissue in each group（×400）

2.5 黃芩素對(duì)小鼠皮膚組織TGF-β1、CTGF和VEGF表達(dá)的影響與空白對(duì)照組相比，模型組小鼠皮膚組織TGF-β1、CTGF和VEGF mRNA及蛋白表達(dá)顯著增加（P＜0.05）；與模型組相比，黃芩素中、高劑量組及地塞米松組皮膚組織TGF-β1、CTGF和VEGF mRNA及蛋白表達(dá)顯著減少（P＜0.05），黃芩素低劑量組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表4、圖3）。

圖3 Western blot檢測(cè)皮膚組織TGF-β1、CTGF和VEGF蛋白表達(dá)Fig.3 Protein expressions of TGF-β1，CTGF and VEGF in skin tissues detected by Western blot

表4 小鼠皮膚組織中TGF-β1、CTGF和VEGF mRNA及蛋白表達(dá)比較（±s，n=10）Tab.4 Comparison of mRNA and protein expressions of TGF-β1，CTGF and VEGF in skin tissue（±s，n=10）

表4 小鼠皮膚組織中TGF-β1、CTGF和VEGF mRNA及蛋白表達(dá)比較（±s，n=10）Tab.4 Comparison of mRNA and protein expressions of TGF-β1，CTGF and VEGF in skin tissue（±s，n=10）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05.

Groups Control Model Dex Baicalein low-dose Baicalein medium-dose Baicalein high-dose TGF-β1 mRNA 1.02±0.09 3.97±0.241）1.57±0.122）3.87±0.21 2.83±0.152）2.38±0.122）Protein 0.14±0.03 1.18±0.051）0.23±0.032）1.17±0.07 0.88±0.042）0.57±0.052）CTGF mRNA 1.02±0.07 4.00±0.221）1.61±0.072）3.93±0.16 2.99±0.112）2.38±0.102）Protein 0.07±0.03 1.07±0.081）0.18±0.042）1.07±0.08 0.80±0.072）0.31±0.042）VEGF mRNA 1.00±0.03 3.00±0.141）1.44±0.072）2.91±0.10 2.42±0.092）2.15±0.102）Protein 0.09±0.03 1.06±0.081）0.17±0.032）1.08±0.06 0.76±0.062）0.45±0.052）

3 討論

銀屑病臨床治療多采用免疫抑制劑、激素類、維生素A酸類等藥物，雖有療效但易復(fù)發(fā)，且副作用大，尋求經(jīng)濟(jì)、副作用小的藥物對(duì)臨床治療銀屑病具有重要意義。隨著中醫(yī)藥在銀屑病血管新生方面研究進(jìn)展，近年研究發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)藥治療銀屑病具有顯著臨床療效［10］。本研究通過(guò)向BALB/c小鼠背部涂抹咪喹莫特建立銀屑病動(dòng)物模型，采用PASI評(píng)分和HE病理染色評(píng)估各組小鼠背部皮膚病理變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠背部皮膚出現(xiàn)紅斑、表皮肥厚、鱗屑成層等現(xiàn)象，病理切片顯示表皮層增生明顯，角質(zhì)層角化不全，與既往研究一致，提示建模成功［11］。給予中劑量和高劑量黃芩素治療后，小鼠銀屑病癥狀明顯改善，銀屑病樣皮損減輕，PASI評(píng)分降低，角化不全現(xiàn)象改善，表皮厚度明顯薄于模型組，其中高劑量黃芩素改善效果接近地塞米松組，提示黃芩素能改善咪喹莫特誘導(dǎo)的小鼠銀屑病樣皮損。

現(xiàn)有研究認(rèn)為，銀屑病是一種免疫介導(dǎo)的炎癥性皮膚病，IL-23/IL-17炎癥軸在銀屑病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用［12-13］。本研究通過(guò)ELISA檢測(cè)皮損組織IL-17、IL-23、TNF-α和IFN-γ含量，結(jié)果顯示模型組炎癥因子水平均顯著上調(diào)，與HAU等［14］研究結(jié)果相符，而黃芩素治療能明顯降低皮損處炎癥因子表達(dá)，與病理結(jié)果炎癥浸潤(rùn)減輕一致，提示黃芩素可能通過(guò)降低銀屑病小鼠皮損組織炎癥因子水平發(fā)揮治療作用。

銀屑病發(fā)生發(fā)展和復(fù)發(fā)與微血管生成異常關(guān)系密切，而血管形成通過(guò)多種血管生成誘導(dǎo)因子和抑制因子平衡進(jìn)行調(diào)節(jié)。VEGF可通過(guò)調(diào)節(jié)血管通透性使血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生增生、遷移，促使新生血管形成［15］；CTGF主要通過(guò)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞黏附，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞存活，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞形成管狀而促進(jìn)新生血管形成；TGF-β1也是創(chuàng)面愈合過(guò)程中一種重要的作用因子，參與成纖維細(xì)胞增生、血管再生、細(xì)胞外基質(zhì)合成與重塑等過(guò)程，而CTGF作為TGF-β1表達(dá)通路下游調(diào)節(jié)因子，在血管再生過(guò)程中和TGF-β1具有協(xié)同作用［16］。CD31主要存在于內(nèi)皮細(xì)胞表面，可反映血管增殖變化及組織形態(tài)變化，而MVD代表單位面積內(nèi)微血管數(shù)，能反映組織血管生成活性［17］。本研究通過(guò)CD31免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)并計(jì)算皮損處MVD，同時(shí)檢測(cè)皮損組織TGF-β1、CTGF和VEGF表達(dá)以評(píng)估新生血管情況，結(jié)果顯示，模型組小鼠皮損MVD值及TGF-β1、CTGF和VEGF mRNA和蛋白表達(dá)顯著上升，而中劑量和高劑量黃芩素干預(yù)組相關(guān)指標(biāo)均明顯下調(diào)，說(shuō)明黃芩素能通過(guò)抑制皮損組織血管新生改善銀屑病樣皮損。

綜上所述，黃芩素可通過(guò)阻斷TGF-β1/CTGF信號(hào)通路減輕炎癥反應(yīng)，抑制皮損組織血管新生，從而延緩咪喹莫特誘導(dǎo)的小鼠銀屑病進(jìn)展，且黃芩素對(duì)銀屑病皮損的改善效果呈劑量依賴性。本研究可為黃芩素治療銀屑病提供依據(jù)，并為其作用靶點(diǎn)及相關(guān)通路深入研究奠定了基礎(chǔ)。