lncRNA NEAT1促進(jìn)宮頸癌發(fā)展的作用及機(jī)制研究

李怡琳梅 劼 郭曉霞 雷 華 江廖治 凌 波 江 虹②

（四川省人民醫(yī)院，電子科技大學(xué)附屬醫(yī)院，成都 610000）

宮頸癌包括宮頸鱗癌和宮頸腺癌，是一種宮頸上皮細(xì)胞惡性增殖導(dǎo)致的婦科惡性腫瘤，發(fā)病率逐年升高，手術(shù)切除或放化療后極易再次復(fù)發(fā)，預(yù)后不佳，成為嚴(yán)重困擾女性健康的社會公共問題之一［1］。雖然宮頸癌的篩查以及疫苗預(yù)防等方面有了較為明顯的進(jìn)展，但具體發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，尚未出現(xiàn)針對該病的根治性治療措施，因此深入揭示疾病的分子機(jī)制，尋找宮頸癌特有的分子標(biāo)志物，為患者開展基因靶向治療成為目前宮頸癌研究的熱點之一［2］。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一種長度大于200 bp具有種屬特異性的非編碼RNA。近來研究顯示lncRNA通過干預(yù)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，在乳腺癌、前列腺癌、肝癌等惡性腫瘤中發(fā)揮促癌或抑癌的作用［3］。近來長鏈非編碼核富含豐富的轉(zhuǎn)錄本1（long non-coding RNA nuclear-enriched abundant transcript 1，lncRNA NEAT1）在肺癌、胃癌等多種腫瘤中過表達(dá)，且與腫瘤的增殖以及病情進(jìn)展密切相關(guān)引起廣泛關(guān)注［4］。CHEN等［5］研究顯示lncRNA NEAT1在非小細(xì)胞肺癌中高表達(dá)，并增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的增殖能力，推動腫瘤病情進(jìn)展。QUAN等［6］研究表明乳腺癌患者血清中l(wèi)ncRNA NEAT1的水平升高，可作為腫瘤預(yù)后不良的生物標(biāo)志物。但有關(guān)lncRNA NEAT1在宮頸癌中的作用報道較少。本研究以宮頸癌組織和宮頸腫瘤細(xì)胞HeLa作為研究對象，研究lncRNA NEAT1在宮頸癌中的表達(dá)情況，揭示其對腫瘤細(xì)胞增殖的影響機(jī)制，為宮頸癌的靶基因治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 一般資料選取2018年3月至2020年3月在四川省人民醫(yī)院進(jìn)行外科切除病灶的宮頸癌患者50例，所有患者均為原發(fā)性宮頸癌患者，且經(jīng)病理驗證為首次確診者，年齡25～73，平均（30.53±8.67）歲，入選患者均未經(jīng)放化療、免疫或激素干預(yù)，排除其他部位惡性腫瘤以及自身免疫性疾?。?］。另取同期50例因子宮平滑肌瘤（宮頸無任何病變）等良性疾病而切除子宮的正常宮頸組織作為對照，年齡22～76，平均（31.25±9.48）歲，本研究已獲得患者或家屬的知情同意書，且經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.2 實驗動物、細(xì)胞及主要試劑人宮頸癌細(xì)胞HeLa購自美國菌種保藏中心（ATCC）；沉默lnc-RNA NEAT1表 達(dá) 的lncRNA NEAT1-siRNA以 及 陰性對照（lncRNA NEAT1-siRNA-NC）由上海吉凱生物技術(shù)有限公司提供。兔抗大鼠磷酸化組蛋白（γ-H2AX）、毛細(xì)血管擴(kuò)張性共濟(jì)失調(diào)癥突變蛋白激酶（ataxia-telangiectasia mutated kinase，ATM）抗體（美國Jackson公司）；CCK-8試劑盒、Western blot試劑盒（美國Invitrogen公司）；蘇凈Airtech超凈工作臺（美國Thermo Fisher公司），BD-56集成式恒溫恒濕細(xì)胞培養(yǎng)箱（德國BINDER公司）；ⅨPlore Standard倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；凝膠自動成像系統(tǒng)（美國Sigma-Aldrich公司）；實時熒光定量PCR儀（美國Thermo Fisher公司）。

1.2 方法

1.2.1 應(yīng)用在線生物數(shù)據(jù)庫檢索lncRNA NEAT1表達(dá)從GEO中提取GSE63514和GSE6791兩個宮頸癌芯片數(shù)據(jù)，通過R軟件分析lncRNAs在正常組織和腫瘤組織中的表達(dá)，確定在兩個數(shù)據(jù)集中表達(dá)差異最為明顯的lncRNA；利用UALCAN分析lnc-RNA NEAT1表達(dá)對宮頸癌患者生存期的影響［8］。

1.2.2 qRT-PCR進(jìn)行驗證使用Trizol試劑盒分別提取宮頸癌組織和正常宮頸組織中總的RNA，根據(jù)Prime ScripTM試劑要求逆轉(zhuǎn)錄生成反義cDNA，以此為模板采用PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增（95℃5 s，單次循環(huán)后；95℃5 s；60℃60 s，采集熒 光 信號40個 循環(huán)）［9］；U6作為內(nèi)參（正向引物為5'-CTTCCAATACGTGCAGCAGA-3'，反向引物為5'-CCCCAGAGACATGATGAAGTCA-3'），lncRNA NEAT1（正向引物為5'-CACCATGGGAGAAGGCCGGGG-3'，反向引物為5'-GACGGACACATTGGGGGTAG-3'），各目的基因的相對表達(dá)量采用2-ΔΔCt表示。

1.2.3 lncRNA NEAT1的表達(dá)與宮頸癌患者臨床病理相關(guān)指標(biāo)的關(guān)系提取入選患者的臨床病理資料，將lncRNA NEAT1的表達(dá)與患者的年齡、腫瘤大小、組織分化程度、TNM分期、組織學(xué)分級情況進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染以及分組處理將人HeLa細(xì)胞株復(fù)蘇后，接種于含有滅活的10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于恒溫恒濕生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，設(shè)定條件：37℃，5%CO2，當(dāng)細(xì)胞生長密度達(dá)85%時開始實驗。本研究中細(xì)胞實驗分為3組［10］：正常組、對照組、實驗組。正常組：不加任何藥物，常規(guī)培養(yǎng)；對照組：細(xì)胞轉(zhuǎn)染150 nmol/L的lncRNA NEAT1-siRNA-NC后，常規(guī)培養(yǎng)；實驗組：細(xì)胞轉(zhuǎn)染150 nmol/L的lncRNA NEAT1-siRNA后，常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.5 CCK-8法檢測各組細(xì)胞的增殖調(diào)整細(xì)胞濃度，以1×104個/孔接種于96孔培養(yǎng)板，分組處理同上，輕輕混勻后，在恒溫恒濕生化培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)24 h后，每孔加入100μl的CCK-8試劑，孵育2 h，使用多功能酶標(biāo)儀測定OD450［11］，每組連續(xù)測量4 d。

1.2.6 DNA ladder分析各組細(xì)胞DNA的損傷情況將細(xì)胞調(diào)整3×105個/ml接種6孔板，分組處理同1.2.4，37℃、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，添加細(xì)胞裂解液，留取上清，依次添加適量Tris液、RNA酶，在50 V下進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，常溫染色，紫外燈下拍照，自動成像系統(tǒng)分析條帶的相對強(qiáng)度，以表示細(xì)胞DNA的損傷情況［12］。

1.2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞的細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡率調(diào)整細(xì)胞3×105個/ml接種6孔板，分組處理同1.2.4，37℃、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，PBS緩沖液將各組細(xì)胞重懸，以70%乙醇固定，離心后，棄上清，加入碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色［13］，PBS重懸，避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞的細(xì)胞周期變化。

調(diào)整細(xì)胞濃度3×105個/ml接種6孔板，分組處理同1.2.4，37℃、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，PBS緩沖液將各組細(xì)胞重懸，滴加5μl的V-FITC和5μl的PI染色［14］，避光孵育，流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞的凋亡率。

1.2.8 裸鼠皮下種植瘤模型檢測各組細(xì)胞的體內(nèi)生長調(diào)整細(xì)胞濃度，分組同1.2.4，以1×106個/孔接種后，在恒溫恒濕生化培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，待生長密度達(dá)到1×107個/ml時，制成單細(xì)胞懸液，進(jìn)行動物實驗。使用異氟烷將SD雌鼠麻醉，在裸鼠右前肢近胸腔處進(jìn)行消毒、備皮，使用100μl的注射器進(jìn)行皮下注射［15］，4周后脫頸處死裸鼠，無菌剝離瘤體，稱重。

1.2.9 Western blot檢測各組細(xì)胞中γ-H2AX、ATM蛋白表達(dá)水平胰酶消化細(xì)胞，離心稀釋成單細(xì)胞懸液，分組處理同1.2.4，按1×105個/孔接種至6孔板；置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱24 h，加入蛋白裂解液，分別提取各組細(xì)胞的總蛋白，測定濃度，置于沸水中變性，進(jìn)行電泳分離，轉(zhuǎn)膜，清洗后，在封閉液中孵育30 min，加入一抗（1∶500），孵育過夜，加入二抗（1∶1 000），二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色［16］，以GAPDH作為內(nèi)參，Image J圖像分析軟件統(tǒng)計分析各條帶的灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析SPSS19.0對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以±s表示，采用t檢驗進(jìn)行分析；所有數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 lncRNA NEAT1在宮頸癌中表達(dá)升高宮頸癌組織和正常組織間存在表達(dá)差異的lncRNA（圖1），進(jìn)一步采用維恩圖對兩基因芯片中的表達(dá)上調(diào)或下調(diào)的lncRNA進(jìn)行說明（圖2A），發(fā)現(xiàn)lncRNA NEAT1在兩芯片中的表達(dá)均明顯升高（圖2B、C）；UALCAN分析顯示lncRNA NEAT1低表達(dá)患者的生存期優(yōu)于lncRNA NEAT1高表達(dá)患者（圖2D），說明在宮頸癌中l(wèi)ncRNA NEAT1的研究具有潛在臨床價值。

圖1 宮頸癌組織和正常組織差異表達(dá)的lncRNAFig.1 Differentially expressed lncRNA in cervical cancer tissue and normal tissue

圖2 lncRNA NEAT1表達(dá)Fig.2 Expression of lncRNA NEAT1

2.2 qRT-PCR結(jié)果qRT-PCR結(jié)果顯示，與正常宮頸組織（1.04±0.15）相比，lncRNA NEAT1在宮頸癌組織中的相對表達(dá)量（2.27±0.41）明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖3。

圖3 lncRNA NEAT1表達(dá)Fig.3 Expression of lncRNA NEAT1

2.3 lncRNA NEAT1表達(dá)與宮頸癌患者臨床病理相關(guān)指標(biāo)的關(guān)系統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，lncRNA NEAT1的相對表達(dá)與宮頸癌患者的腫瘤大小、組織學(xué)分級相關(guān)（均P＜0.05），與患者的年齡、組織類型、TNM臨床分期、浸潤深度無關(guān)（P＞0.05），見表1。

表1 lncRNA NEAT1的相對表達(dá)與宮頸癌患者的臨床病理參數(shù)的關(guān)系Tab.1 Relationship between relative expression of lnc-RNA NEAT1 and clinicopathological parameters of cervical cancer patients

2.4 CCK-8法檢測各組細(xì)胞的增殖CCK-8實驗結(jié)果顯示，從檢測第2天后，與正常組相比，實驗組細(xì)胞的OD450值明顯下降，增殖能力明顯下降（均P＜0.05）。正常組與對照組，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖4。

圖4 CCK-8實驗結(jié)果Fig.4 Experimental results of CCK-8

2.5 DNA ladder分析各組細(xì)胞DNA的損傷情況瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，正常組和對照組細(xì)胞呈現(xiàn)一條較明顯的DNA大分子片段，實驗組細(xì)胞DNA出現(xiàn)3～4條200 bp、400 bp、800 bp、1 000 bp的區(qū)帶，即細(xì)胞凋亡獨有的“階梯圖譜”，說明實驗組細(xì)胞的DNA鏈斷裂嚴(yán)重，DNA損傷明顯，見圖5。

圖5 DNA ladder分析實驗結(jié)果Fig.5 Experimental results of DNA ladder analysis

2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞的細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡率流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與正常組相比，實驗組中處于G1期的細(xì)胞的比例明顯下降，處于S期細(xì)胞的比例明顯升高，形成S期阻滯，細(xì)胞凋亡率明顯升高（均P＜0.05），正常組與對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖6、圖7。

圖6 各組細(xì)胞的細(xì)胞周期Fig.6 Cell cycle of Cells in each group

圖7 各組細(xì)胞的細(xì)胞凋亡Fig.7 Cell apoptosis of each group

2.7 皮下種植瘤結(jié)果比較 皮下種植瘤實驗結(jié)果如圖8所示，與正常組相比，4周后，實驗組裸鼠內(nèi)移植瘤明顯變小，瘤體重量明顯降低（P＜0.05），正常組與對照組，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖8 皮下種植瘤實驗結(jié)果Fig.8 Experimental results of subcutaneous tumor implantation

2.8 Western blot檢測各組細(xì)胞中DNA損傷標(biāo)志物Western blot結(jié)果顯示，與正常組相比，實驗組細(xì)胞γ-H2AX、ATM蛋白表達(dá)明顯升高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），正常組與對照組，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖9。

圖9 Western blot結(jié)果Fig.9 Results of Western blot

3 討論

隨著宮頸細(xì)胞學(xué)與病毒學(xué)的進(jìn)步，宮頸癌的早期篩查率有了較為明顯的突破，在一定程度減輕了對女性群體的威脅。但技術(shù)仍有地區(qū)并未開展宮頸癌篩查或篩查項目嚴(yán)重不足，導(dǎo)致宮頸癌仍是困擾發(fā)展中地區(qū)和國家女性健康的癌癥類型之一［17］。手術(shù)與放化療是宮頸癌的主要治療措施，但由于腫瘤細(xì)胞旺盛的生命力，腫瘤復(fù)發(fā)率不斷攀升，患者預(yù)后不佳，因此基因靶向治療成為提高患者生命質(zhì)量的最有前景的治療方案之一［18］。目前眾多研究宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制，開展多方面的實驗，積極尋找癌細(xì)胞惡性增殖的分子標(biāo)志物。

lncRNA NEAT1又被稱為HSALNG0000014，定位在染色體11q13.1。研究顯示作為細(xì)胞旁斑結(jié)構(gòu)的主要構(gòu)成部分，lncRNA NEAT1在維系腫瘤細(xì)胞內(nèi)蛋白-mRNA結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性中發(fā)揮重要作用［19］。深入研究發(fā)現(xiàn)在膠質(zhì)瘤、結(jié)腸癌、胰腺癌等惡性腫瘤中高表達(dá)的lncRNA NEAT1明顯增強(qiáng)癌細(xì)胞的生長與增殖能力，加快腫瘤細(xì)胞的免疫浸潤及患者的病情進(jìn)展［20］。CHEN等［5］研究顯示，在非小細(xì)胞癌中，抑制lncRNA NEAT1的表達(dá)能明顯抑制腫瘤細(xì)胞的生長與侵襲能力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。LI等［21］研究表明沉默lncRNA NEAT1的表達(dá)能明顯降低乳腺癌細(xì)胞在小鼠成瘤模型中的體內(nèi)生長。WANG等［22］研究表明結(jié)腸癌患者血清中l(wèi)ncRNA NEAT1明顯升高，也是患者預(yù)后不良的獨立評價因子。本研究從LncExpDB數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)lncRNA NEAT1在宮頸癌細(xì)胞系中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)。對GEO數(shù)據(jù)庫GSE6791和GSE63514宮頸癌患者芯片的研究發(fā)現(xiàn)lncRNA NEAT1在兩組數(shù)據(jù)集中的表達(dá)明顯升高。進(jìn)一步對本研究收集的宮頸癌組織標(biāo)本研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA NEAT1的表達(dá)升高，并且lncRNA NEAT1的表達(dá)與患者腫瘤大小以及組織學(xué)分級相關(guān)，說明lncRNA NEAT1的表達(dá)與宮頸癌的病情進(jìn)展關(guān)系密切。沉默其表達(dá)后，HeLa細(xì)胞的DNA損傷明顯，細(xì)胞的有絲分裂被阻滯在S期，體外增殖與體內(nèi)生長明顯受限，細(xì)胞的凋亡率明顯升高。

細(xì)胞的DNA為雙鏈閉環(huán)超螺旋結(jié)構(gòu)，是遺傳物質(zhì)的載體。其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定是腫瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)功能的基礎(chǔ)［23］。DNA損傷是指細(xì)胞有絲分裂過程中DNA較為穩(wěn)定的核苷酸序列出現(xiàn)永久性的改變，進(jìn)而影響染色體復(fù)制以及基因轉(zhuǎn)錄、翻譯。DNA雙鏈結(jié)構(gòu)受損是導(dǎo)致細(xì)胞周期調(diào)控紊亂進(jìn)而使細(xì)胞趨于凋亡的主要原因。γ-H2AX、ATM蛋白是DNA雙鏈結(jié)構(gòu)受損的生物標(biāo)志物［24］。TAIANA等［25］研究報道在多發(fā)性骨髓瘤中l(wèi)ncRNA NEAT1維系DNA結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，并幫助腫瘤細(xì)胞進(jìn)行DNA損傷修復(fù)。本研究表明沉默lncRNA NEAT1的表達(dá)后，HeLa的DNA雙鏈結(jié)構(gòu)受損明顯，有序的細(xì)胞分裂阻滯在S期，細(xì)胞凋亡率升高。說明沉默lncRNA NEAT1有望成為潛在的宮頸癌細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)抑制劑，給宮頸癌的靶向治療帶來新的靶點。

綜上，在宮頸癌組織中l(wèi)ncRNA NEAT1的表達(dá)明顯升高，沉默其表達(dá)后，宮頸癌細(xì)胞的HeLa細(xì)胞的DNA損傷明顯，細(xì)胞周期被阻滯在S期，體外增殖與體內(nèi)生長明顯受限，細(xì)胞的凋亡率明顯升高。但是開展lncRNA NEAT1靶向治療宮頸癌仍需大樣本以及多維度的系統(tǒng)研究。