沉默狼瘡相關(guān)肺動脈高壓高表達的HMGB1通過TLR4/NF-κB途徑抑制低氧誘導的PASMC增殖、遷移及膠原合成①

李鳴遠 孟 巖 武云（新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院全科醫(yī)學科，烏魯木齊 830054）

肺動脈高壓（pulmonary hypertension，PAH）是系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）嚴重的并發(fā)癥之一，隨著肺動脈壓力與肺部血管阻力的漸進性升高，可導致右心室衰竭而死［1-2］。由于SLE-PAH發(fā)病機制尚未完全闡明，導致臨床藥物治療存在明顯局限性，因此更深層地了解其發(fā)病機制有助于改善患者的療效及預后。

目前公認PAH的病理基礎(chǔ)是由肺動脈平滑肌細胞（pulmonary artery smooth muscle cells，PASMC）異常增殖和膠原蛋白等細胞外基質(zhì)蛋白積累而導致肺血管壁重塑［3-4］。但驅(qū)動PASMC異常生理活動的分子基礎(chǔ)并未得到明確闡述。近年來，越來越多的證據(jù)表明炎癥在PAH的發(fā)病機制中起著至關(guān)重要的作用，并且SLE-PAH相對于其他類型的PAH有更強的炎癥狀態(tài)［5-7］。高遷移率族蛋白1（high mobility group box-1，HMGB1）是一種由細胞主動或被動分泌的致炎因子，多研究顯示HMGB1在PAH患者肺部表達明顯上調(diào)，并能促發(fā)炎癥反應(yīng)及肺血管重構(gòu)，從而誘導PAH發(fā)生［8-9］。

關(guān)于HMGB1在SLE-PAH中是通過何種信號通路誘發(fā)PASMC異常的生理活動目前仍未見報道。TLR4/NF-κB是參與機體炎癥反應(yīng)的重要信號通路之一。XUE等［10］證實了HMGB1通過TLR4/MyD88/NF-κB途徑促進了炎癥細胞因子的釋放，心肌細胞的遷移、黏附和聚集，加重了心肌缺血性輸液損傷，加重了心肌梗死面積。YU等［11］研究發(fā)現(xiàn)HMGB1的抑制通過TLR4和NF-κB信號通路抑制NLRP3介導的炎癥反應(yīng)，從而改善壞死性腸結(jié)腸炎。可見HMGB1與TLR4/NF-κB途徑的相互調(diào)控在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用。

由此推測，SLE患者體內(nèi)高表達的HMGB1可能是通過激活TLR4/NF-κB途徑誘發(fā)炎癥反應(yīng)，促進PASMC的過度增殖、遷移與膠原合成，最終誘發(fā)PAH的發(fā)生。本研究在臨床樣本驗證的基礎(chǔ)上設(shè)計PASMC的體外培養(yǎng)實驗，進一步明確HMGB1參與SLE-PAH疾病進展的作用機制。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 一般資料選取新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院2019年3月至2021年3月收治的健康體檢者（健康對照組）、SLE患者（SLE組）、SLE-PAH（SLE-PAH組）作為研究對象，納入標準：SLE符合1997年美國風濕病協(xié)會制定的SLE分類診斷標準［12］，PAH的診斷符合多普勒超聲測定肺動脈收縮壓（pulmonary artery systolic pressure，PASP）≥30 mmHg［13］。排除標準：由間質(zhì)性肺疾病、肺栓塞、心功能不全、心肌梗死等引發(fā)的PAH。本研究已通過本院倫理委員會審批，所有患者均對本研究知情，并簽署知情同意書。正常對照組30例，平均年齡（37.1±12.4）歲，男11例，女19例；SLE組33例，平均年齡（35.8±10.3）歲，男14例，女19例，SLE持續(xù)時間（59.3±30.1）個月，SLEDAI得分為（12.4±4.8）分；SLE-PAH組31例，平均年齡（36.9±7.9）歲，男15例，女16例，SLE持續(xù)時間（65.5±39.9）個月，SLEDAI得分為（10.8±5.1）分，3組性別組成與年齡無顯著性差異，SLE組與SLE+PAH組SLE持續(xù)時間、SLE疾病活動度指數(shù)（disease activity index of SLE，SLEDAI）得分無差異。

1.1.2 儀器與試劑全自動生化分析儀（7600型，日本日立）；PCR儀器（美國ABI 7500熒光定量PCR儀）；液體閃爍計數(shù)器（liquid scintillation counter，美國Perkin Elmer）；電泳儀（Bio-Rad，美國）；PASMC（武漢云克隆科技股份有限公司）；LipofectamineTM2000（Invitrogen，美國）；MTT檢測試劑盒（酶聯(lián)生物，上海）；酶標儀（America，美國）；EdU細胞增殖檢測試劑盒（銳博生物科技有限公司，廣州）；熒光顯微鏡（fluorescence microscope，日本奧林巴斯）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-PCR檢測試劑盒（美國賽默飛科技）；BCA定量試劑盒（碧云天公司，上海）；Boyden小室（Hm-Kylin/海門麒麟公司）。

1.2 方法

1.2.1 彩色多普勒超聲檢查使用彩色多普勒儀，M4s探頭，頻率為2.0～3.5 MHz，囑患者取左臥位，掃查患者胸骨旁長、短軸、四腔室，測量三尖瓣反流，估測PASP，ePASP=（4×TRV2）+RAP，其中TRV為最大三尖瓣反流速度，RAP為右房壓。

1.2.2 SLEDAI根據(jù)SLE疾病活動度評分量表對SLE-PAH患者SLEDAI進行評分，SLEDAI≥8定義為SLE活動期，另為非活動期。

1.2.3 PAH嚴重程度分級根據(jù)PASP對SLEPAH患者PAH的嚴重程度進行分級。輕度：PASP 30～40 mmHg，中 度：PASP 41～70 mmHg，重 度：PASP≥71 mmHg。

1.2.4 血漿HMGB1含量檢測空腹采集患者的外周靜脈血，迅速分離血漿，采用全自動生化分析儀測定血漿中HMGB1含量。比較3組受試者血漿HMGB1含量，并分析不同SLE活動度、PAH嚴重程度分級的SLE-PAH患者血漿中HMGB1含量。

1.2.5 細胞培養(yǎng)PASMC采用DMEM高糖培養(yǎng)基（含有10%FBS），在37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)至第4～6代使用。

1.2.6 siRNA轉(zhuǎn)染將PASMC培養(yǎng)至30%～50%融合，使用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染25μmol siRNANC/siRNA-HMGB1，轉(zhuǎn)染6 h后，將細胞在含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后進行后續(xù)實驗。所有siRNA均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。

1.2.7 細胞增殖測定采用MTT法與EdU實驗測定PASMC細胞增殖情況，MTT實驗：于96孔板接種（2×103個/孔），培養(yǎng)24 h后按照MTT檢測試劑盒說明書加入MTT試劑，孵育4 h，酶標儀測定細胞在490 nm處的吸光值。EdU實驗：使用EdU細胞增殖檢測試劑盒，加入50μmol/L EdU試劑4 h，1μg/ml DAPI染色20 min，于熒光顯微鏡下觀察染色陽性細胞，計算EdU陽性率。

1.2.8 細胞遷移測定采用Boyden小室試驗測定PASMC細胞遷移能力，將PASMC重新懸浮在含有0.4%BSA的無血清DMEM培養(yǎng)基中，取1×104個細胞加入Boyden上室。下腔充滿含0.4%BSA的無血清培養(yǎng)基，孵育5 h后，將穿透并附著在濾膜底部的細胞固定于甲醇中，并在室溫下用Giemsa溶液染色20 min。使用顯微鏡觀察細胞，并記錄每孔隨機選擇區(qū)域的細胞計數(shù)。

1.2.9 膠原合成測定采用膠原酶消化法測定細胞膠原蛋白的合成，將PASMC置于含有抗壞血酸（50μg/ml）和β-氨基丙腈（80μg/ml）的［2，3，4，5-3H］L-脯氨酸中持續(xù)24 h。移出培養(yǎng)基并將其添加到等體積的冷Tris緩沖液（0.1 mmol/L，pH=7.4）中，緩沖液含有0.65 mmol/L NaCl、5.0 mmol/L CaCl2、2.5 mmol/L N-乙基馬來酰亞胺和100μg/ml牛血清白蛋白，添加三氯乙酸（10%）在4℃下絮凝30 min，于14 000 g、4℃離心10 min，95%冷乙醇洗滌2次，干燥，0.2%SDS溶解，液體閃爍計數(shù)器測定。

1.2.10 RT-PCR采用RT-PCR測定細胞中HMGB1 mRNA的相對表達量，以GAPDH作為內(nèi)部參照基因，HMGB1基因的相對表達水平采用2-ΔΔCt表示。引物序列為：HMGB1正向：5′-GCCGGGAGGAGCACAAGAAGAA-3′，反向：5′-GCCTTGTCAGCCTTTGCCATATCT-3′，GAPDH正向：5′-ACGGCAAGTTCAACGGCACAGTCA-3′，反向：5′-AGCGGAAGGGGCGGAGATGA-3′。

1.2.11 Western blot采用Western blot測定HMGB1、TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-1β、COL1、COL3蛋白質(zhì)的含量。RIPA裂解法提取總蛋白，BCA定量試劑盒定量，使用10%SDS-PAGE于電泳儀進行分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，加入相應(yīng)的抗體孵育，4℃隔夜，然后用辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶5 000稀釋），室溫下孵育1 h，使用Image-Lab軟件檢測生物發(fā)光，并對蛋白質(zhì)進行定量。

1.3 統(tǒng)計學處理采用GraphPad Prism 8.0進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與圖形的繪制，實驗數(shù)據(jù)均采用±s表示，多組間數(shù)據(jù)的分析采用單因素方差分析，兩兩之間的比較采用LSD-t檢驗，當P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 HMGB1在SLE-PAH患者血漿與低氧培養(yǎng)的PASMC中的表達上調(diào)結(jié)果顯示，SLE-PAH患者血漿中HMGB1水平高于SLE患者與正常對照，SLE患者HMGB1水平亦高于正常對照，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，P＜0.001，圖1A）；進一步對HMGB1與SLE-PAH患者病情的關(guān)系進行分析，結(jié)果顯示，SLE活動期患者血漿HMGB1水平高于非活動期（P＜0.05，圖1B），PAH重度患者血漿HMGB1水平高于輕中度患者（P＜0.05，圖1C）。采用低氧環(huán)境培養(yǎng)PASMC模擬PAH環(huán)境，測定HMGB1 mRNA與蛋白質(zhì)的表達，以常氧條件下培養(yǎng)的PASMC作為對照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低氧誘導促進了HMGB1 mRNA與蛋白質(zhì)的表達上調(diào)（P＜0.01，P＜0.001，圖1D、E）。

圖1 臨床SLE-PAH患者血漿與低氧培養(yǎng)的PASMC中HMGB1的水平分析Fig.1 Analysis of HMGB1 level in plasma of patients with SLE-PAH and PASMC induced by hypoxia

2.2 沉默HMGB1抑制低氧誘導PASMC的增殖、遷移與膠原合成及TLR4/NF-κB通路的表達結(jié)果顯示，低氧誘導促進了細胞增殖、遷移（P＜0.001，圖2A～C）與膠原合成（P＜0.001，圖2D、E），而沉默HMGB1則 逆 轉(zhuǎn) 了 此 變 化（P＜0.01，P＜0.001，圖2A～E），以上提示低氧誘導了HMGB1表達增強，從而促進了PASMC增殖、遷移與膠原合成。同時，測定了TLR4/NF-κB通路相關(guān)蛋白的表達，結(jié)果顯示，低氧誘導激活了PASMC細胞中TLR4/NF-κB通路蛋白的表達，而在沉默HMGB1后則又逆轉(zhuǎn)了此變化（P＜0.001，圖2F）。

圖2 沉默HMGB1抑制了低氧誘導的PASMC增殖、遷移與膠原合成及TLR4/NF-κB通路表達Fig.2 Silencing HMGB1 inhibited proliferation，migration and collagen synthesis of PASMC and expression of TLR4/NF-κB pathway induced by hypoxia

2.3 激活TLR4逆轉(zhuǎn)siRNA-HMGB1對低氧誘導PASMC增殖、遷移與膠原合成的抑制作用如圖3所示，為進一步驗證低氧誘導下HMGB1是否通過TLR4/NF-κB通路調(diào)控PASMC增殖、遷移與膠原合成，采用siRNA-HMGB1與TLR4的激活劑LPS分別處理PASMC，均給予低氧培養(yǎng)，結(jié)果顯示，在siRNAHMGB1干預的基礎(chǔ)上采用LPS處理，能逆轉(zhuǎn)siRNAHMGB1對低氧誘導PASMC增殖、遷移（P＜0.05）與膠原合成（P＜0.01）的抑制作用，同時還觀察到，LPS處理使siRNA-HMGB1對TLR4/NF-κB通路的抑制作用也得到逆轉(zhuǎn)（P＜0.01）。

圖3 激活TLR4逆轉(zhuǎn)siRNA-HMGB1對低氧誘導PASMC增殖、遷移與膠原合成的抑制作用Fig.3 Activation of TLR4 reverses inhibitory effect of siRNA-HMGB1 on proliferation，migration and collagen synthesis of PASMC induced by hypoxia

3 討論

HMGB1是一種細胞核非組蛋白DNA結(jié)合蛋白，具有復雜的生物學效應(yīng)，參與了細胞增殖、遷移、分化、炎癥、腫瘤發(fā)展等生理/病理過程，是近年來國內(nèi)外研究熱點之一［14］。

本研究中首先在臨床樣本中證實了HMGB1與SLE-PAH的關(guān)系：與正常受試者及SLE患者相比，SLE-PAH患者血漿中HMGB1含量顯著升高，且處于SLE活動期與合并重度PAH的患者血漿HMGB1含量高于SLE非活動期與合并輕中度PAH的患者。這說明HMGB1與SLE-PAH疾病的進展密切相關(guān)。既往研究已證實SLE患者血清中HMGB1蛋白升高，與SLE疾病活性相關(guān)［15-16］。SLE是一種以產(chǎn)生抗核抗體（ANA）為特征的自身免疫性疾病，ANA能與HMGB1結(jié)合形成復合物后放大機體的炎癥反應(yīng)［17］。YAO等［18］研究中發(fā)現(xiàn)HMGB1是PAH藥物治療中主要的靶點蛋白之一。BAUER等［19］證實HMGB1可介導TLR4的活化促進PAH的進展。YUKARI等［20］證實HMGB1在肺動脈高壓小鼠模型中表達增加，促進了炎癥反應(yīng)，并使肺血管壁增厚。上述研究結(jié)果均為單純探討HMGB1與SLE或PAH疾病之間的關(guān)系，而本研究直接探討了HMGB1在SLE-PAH疾病進展中的作用，可為SLE-PAH疾病的臨床診治實踐提供一定的參考。

隨后本研究采用PASMC體外細胞培養(yǎng)實驗來探討HMGB1在SLE-PAH進展中的作用機制，結(jié)果證實低氧誘導PASMC可促進HMGB1表達，而HMGB1是通過激活TLR4/NF-κB信號通路促進PASMC增殖、遷移及膠原合成。TLR4/NF-κB信號通路是炎癥反應(yīng)的主要調(diào)控通路之一，TLR4是一類跨膜蛋白，能特異性識別病原相關(guān)分子模式，并在免疫和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用；TLR4通過與髓樣分化蛋白88或其他接頭蛋白結(jié)合后，使得核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB p65亞單位磷酸化激活，進入細胞核促進炎癥細胞因子TNF-α、IL-1β等的表達［21］。近年來研究指出TLR4還能識別體內(nèi)危險信號［22］。HMGB1可作為損傷模式相關(guān)分子，是危險信號分子激活模式的識別受體。因而在低氧或SLE導致的炎癥環(huán)境下，HMGB1的表達上調(diào)，被TLR4識別后，激活了NF-κB，從而產(chǎn)生了炎癥級聯(lián)放大反應(yīng)，PASMC細胞過度增殖、遷移，合成膠原，促進了肺血管重構(gòu)，最終引發(fā)或加重了PAH［23］。

綜上所述，HMGB1通過TLR4/NF-κB途徑抑制低氧誘導的PASMC增殖、遷移及膠原合成，是SLEPAH未來可能的生物標志物及治療靶標之一。