骨形態(tài)發(fā)生蛋白15(BMP15)通過Smads信號通路促進雛雞原始卵泡的激活

趙 安，郭長權(quán)，周 爍，吳楊楊，張才喬，米玉玲

(浙江大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310058)

轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)超家族是卵巢內(nèi)最重要的卵泡發(fā)生調(diào)節(jié)因子之一，包括BMPs、激活素、抑制素、生長分化因子和抗繆勒氏管激素，其主要功能是調(diào)節(jié)組織的生長和發(fā)育，包括細胞的增殖、分化和凋亡[9-11]。其中，BMP15的研究最為廣泛。BMP15在卵母細胞中特異性表達，對原始卵泡的激活和發(fā)育起到關(guān)鍵作用。BMP15基因突變的小鼠在卵泡發(fā)育的初級階段受阻最終無法生育[12]。缺乏BMP15的雌性大鼠的排卵率和受精率顯著下降[13]。盡管這些研究表明BMP15可能參與卵泡生長和發(fā)育的調(diào)節(jié)，但其在雛雞卵巢中對原始卵泡發(fā)育的影響尚不清楚。

BMP15通過TGF-β家族受體BMPR2和BMPR1B(ALK6)調(diào)控顆粒細胞的增殖，對雞卵泡顆粒細胞具有促分化作用[14]。BMP15在顆粒細胞表面與BMP受體1B(BMPRIB/ALK-6)或BMP受體(BMPRII)復(fù)合物結(jié)合[15]后，激活細胞內(nèi)Smad1/5/8信號通路。Smad4是常見的協(xié)同Smad作用蛋白(co-Smad)，參與激活BMP和TGF-β/激活素的信號通路[16]。BMP15以劑量依賴的方式通過細胞內(nèi)信號通路Smad1/5/8來促進人原始卵泡的激活[17]。此外，已有研究表明，Smad5突變使小鼠原始生殖細胞的數(shù)量減少[18]。因此，BMP15可通過Smad1、Smad5和Smad4信號通路激活原始卵泡。

本試驗采用雛雞卵巢組織的體外培養(yǎng)模型和體內(nèi)注射試驗，通過形態(tài)學(xué)觀察以及細胞的增殖和凋亡檢測，探索BMP15在雞早期卵巢中對原始卵泡激活和發(fā)育過程中的調(diào)節(jié)作用，為提升家禽繁殖性能提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器BMP15購自武漢云克隆公司；青霉素-鏈霉素溶液、DMEM和胎牛血清(FCS)購自Hyclone公司；胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、亞硒酸鹽和溴脫氧嘧啶核苷(BrdU)購自Sigma公司；ML347購自MedChem Express公司；兔抗BMPR1B、兔抗增殖細胞核抗原(PCNA)、兔抗BCL2、兔抗人單克隆抗體(BAX)、兔抗Smad1、兔抗Smad4、兔抗Smad5、兔抗連接蛋白43(CX43)、鼠抗β-actin、HRP-標記山羊抗兔IgG、HRP-標記山羊抗鼠IgG、TRITC或FITC標記山羊抗兔IgG、TRITC標記山羊抗鼠IgG購自華安生物公司；兔抗細胞周期蛋白依賴性激酶2(CDK2)、抗細胞周期蛋白D1(CCND1)、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)、30%丙烯酰胺、TEMED購自博士德公司；4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、RIPA、PMSF購自碧云天公司；鼠抗BrdU購自DSHB公司；原位末端轉(zhuǎn)移酶標記(TUNEL)試劑盒、HiScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit、ChamQ SYBR qPCR Master Mix購自南京維諾贊公司；TRIzol購自Invitroge公司；BCA蛋白定量試劑盒購自南京建成公司；PageRulerTMPrestained Protein Ladder購自Thermo公司。

1.2 動物和組織制備海蘭蛋雞受精種蛋(購自杭州市正大肉雞場)置于溫度38.5℃、濕度60%的孵化箱中孵育至出雛。雛雞在適宜的條件下飼養(yǎng)，所有操作均按照浙江大學(xué)《實驗動物護理和使用指導(dǎo)原則》(ZJU20170660)進行。將BMP15溶于無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)中，于出雛后第4天按0.2，1.0，5.0 μg/kg 的劑量連續(xù)注射(i.p.)3 d，對照組注射PBS。3 d后將雛雞處死，取出卵巢用于形態(tài)學(xué)觀察，或凍存于液氮中用于Western blot試驗。

1.3 卵巢組織培養(yǎng)將4日齡雛雞卵巢切成2～3片進行組織培養(yǎng)。將0.45 μm濾膜放入24孔細胞培養(yǎng)板(Corning Inc.,NY,USA)，每孔放入2片卵巢組織，加入750 μL的培養(yǎng)液培養(yǎng)3 d。培養(yǎng)液中添加了100 IU/mL青霉素-鏈霉素、5%FCS、10 mg/L 胰島素、5 mg/L轉(zhuǎn)鐵蛋白和30 nmol/L亞硒酸鹽。BMP15的處理劑量分別為20,100,500 μg/L。每24 h更換培養(yǎng)液1次。

1.4 對BMPR1B的抑制作用體外試驗中，4日齡雛雞卵巢組織用10 μmol/L ML347和100 μg/L BMP15單獨或聯(lián)合培養(yǎng),培養(yǎng)3 d后收集卵巢組織進行形態(tài)學(xué)分析和生化檢測。

大學(xué)生學(xué)習(xí)目標不明確，缺乏學(xué)習(xí)動力，學(xué)習(xí)興趣不高，自控能力差 大學(xué)相對寬松自由開放的環(huán)境，使得大學(xué)生有較多的自主時間，與高中高強度的、目標明確的學(xué)習(xí)形成鮮明的對比，極易產(chǎn)生放松心態(tài)。一些大學(xué)生沒能形成合理的人生規(guī)劃，沒有確定的學(xué)習(xí)目標，學(xué)習(xí)動力不足，學(xué)習(xí)興趣不高，面對相對閑暇的時光，加之自控能力差，難免會迷失方向。而手機功能日趨豐富，誘惑力大，導(dǎo)致他們用手機打發(fā)時間，并自然而然地在課堂上使用手機。

1.5 免疫組織化學(xué)卵巢切片脫蠟浸水后，用3% H2O2溶液在室溫下完全覆蓋切片20 min，將切片浸沒在0.01 mol/L檸檬酸緩沖液中20 min(98～100℃)修復(fù)抗原，PBS漂洗后用山羊血清封閉，室溫孵育25 min。此后滴加一抗，包括兔抗BAX(1∶200)、兔抗CDK2(1∶200)、兔抗PCNA(1∶200)和兔抗CCND1(1∶200)，切片在4℃下孵育過夜。第2天用PBS洗3次后滴加HRP-標記山羊抗兔IgG，37℃濕盒中孵育1 h。用DAB顯色2～10 min，鏡檢觀察，蘇木精復(fù)染，脫水、透明、封固以及鏡檢。每組至少采集3個卵巢，每個卵巢最大橫截面連續(xù)5張切片進行免疫組化,在顯微鏡(Nikon，Eclipse 80i)下觀察拍照。

1.6 免疫熒光染色卵巢切片滴加兔抗BMPR1B或兔抗PCNA(1∶200)后在4℃孵育過夜。第2天切片復(fù)溫1 h后用PBS洗3次，用FITC或TRITC標記的山羊抗兔IgG作為二抗，37℃孵育1 h，再用DAPI進行復(fù)染。連續(xù)取各卵巢組織最大橫截面5片,采用熒光顯微鏡觀察拍照。

1.7 BrdU檢測卵巢組織培養(yǎng)48 h后，在含有10 μg/mL BrdU標記液的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。切片在鼠抗BrdU作為一抗在4℃孵育過夜后，PBS洗3次。用TRITC標記的山羊抗小鼠IgG作為二抗孵育1 h，DAPI對切片復(fù)染。每組至少采集3個卵巢，連續(xù)取各卵巢組織最大橫截面5片，采用熒光顯微鏡觀察。

1.8 TUNEL分析步驟按照TUNEL試劑盒說明書操作。每組至少采集3個卵巢，連續(xù)取各卵巢組織最大橫截面5片，采用熒光顯微鏡觀察。

1.9 透射電鏡和細胞超微結(jié)構(gòu)觀察卵巢切片在2.5%戊二醛4℃下固定24 h以上，用PBS清洗后置于1%的鋨酸溶液固定1.5 h，然后用乙醇和丙酮逐級脫水后包埋劑包埋，70℃高溫過夜。使用超微切片機將包埋好的卵巢組織制作厚度為70～90 nm的切片。切片染色后，于Tecnai G2 Spirit型透射電鏡(TEM)下觀察和拍照。

1.10 RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR用TRIzol從雛雞卵巢中提取總RNA。按照HiScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit說明書操作，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。由生工生物工程公司設(shè)計引物，引物序列見表1。將cDNA稀釋10倍，Real-time PCR反應(yīng)體系為20 μL。以β-肌動蛋白(β-actin)為內(nèi)參，使用比較周期閾值法(2-△△Ct)測定mRNA的相對表達。每組采集3個卵巢。

表1 實時熒光定量PCR引物信息

1.11 Western blot分析卵巢組織用含有1 mmol/L PMSF的RIPA研磨后，按照BCA蛋白檢測試劑盒說明書測定總蛋白含量。采用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離30 μL的變性蛋白體系，夾心法(0.22 μm;Micro hole)使蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉1 h后，與相應(yīng)的一抗結(jié)合，包括兔抗BMPR1B(1∶200)、兔抗PCNA(1∶500)、兔抗CDK2(1∶500)、兔抗細胞淋巴瘤(1∶500)、兔抗BAX(1∶500)、兔抗Smad1(1∶200)、兔抗Smad4(1∶200)、兔抗Smad5(1∶200)和兔抗CX43(1∶200)。加入HRP標記的山羊抗鼠或山羊抗兔IgG在搖床上孵育1 h，用ECL顯影液顯色后采用Quantity One軟件進行條帶的灰度分析，以β-actin為內(nèi)參對蛋白進行定量分析。

1.12 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析數(shù)據(jù)均采用形式表示，所得數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 7.0軟件進行單因素方差分析(One-way ANOVA)和Duncan多重比較進行分析，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 BMP15和BMPR1B在雛雞卵巢中表達的變化從出雛第5～9 天(圍繞7 d這一雛雞原始卵泡大量激活的時間點作為所取材的時間點)的卵巢組織中提取蛋白和RNA。qRT-PCR結(jié)果顯示，第7天的卵巢組織中BMP15以及BMPR1B mRNA的表達量與第5，6天卵巢組織相比顯著提高(P<0.05)(圖1A,B)。Western blot結(jié)果顯示，雛雞卵巢中BMPR1B蛋白的表達量在第7天顯著升高(P<0.05)(圖1C,D)。第7天卵巢組織的免疫熒光結(jié)果顯示，BMP15的受體BMPR1B主要表達在卵母細胞上(圖1E)。

2.2 BMP15對體外培養(yǎng)的卵巢細胞的促增殖作用體外培養(yǎng)第4天雛雞卵巢3 d，BrdU染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BMP15 100 μg/L 處理組中BrdU陽性細胞的百分比最高(P<0.01)(圖2A,B)。同時檢測100 μg/L 的BMP15對卵巢中細胞增殖和凋亡的影響。免疫組化結(jié)果顯示，3種增殖相關(guān)蛋白基本都位于卵巢的皮質(zhì)，PCNA、CDK2和CCND1蛋白在顆粒細胞和卵母細胞上都有表達，添加BMP15使3種蛋白染色陽性的著色都變得更深(圖2C)。細胞凋亡相關(guān)蛋白BAX基本都位于卵巢的皮質(zhì)，但是添加BMP15使其著色相對變淺(圖2F)。Western

A.第5～9天雛雞卵巢BMP15 mRNA的表達；B.第5～9天雛雞卵巢BMPR1B mRNA的表達；C,D.在第4～9天雛雞卵巢中BMPR1B蛋白的表達及灰度分析；E.BMPR1B的免疫熒光。三角形指向卵母細胞，箭簇指向顆粒細胞;不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下同

blot分析結(jié)果表明，體外培養(yǎng)時添加BMP15可以顯著增加雛雞卵巢中顆粒細胞和卵母細胞的PCNA、CDK2和CCND1蛋白含量(P<0.05)(圖2D,E)，并且顯著減少BAX蛋白的表達，顯著增加BCL2蛋白的表達(P<0.05)(圖2G,H)。根據(jù)以上結(jié)果，在體外試驗中，選擇100 μg/L的BMP15用于后續(xù)試驗。

A.B.BrdU熒光染色及陽性細胞比例,箭鏃表示卵巢皮質(zhì)中具有BrdU(白色)標記的顆粒細胞和卵母細胞；C～H.BMP15對細胞增殖和抗凋亡的影響；C.PCNA、CDK2和CCND1免疫組化，箭鏃表示染色的顆粒細胞和卵母細胞；D，E.100 μg/L BMP15處理后PCNA、CDK2和CCND1的Western blot和灰色分析；F.箭鏃為BAX染色的卵母細胞；G，H.BAX和BCL2蛋白的Western blot和灰色分析

2.3 BMP15對雛雞卵巢細胞的促增殖作用在體試驗表明，雛雞注射1 μg/kg的BMP15后，PCNA免疫組化染色陽性的著色加深(圖3A)。Western blot分析表明，與對照組相比，注射1，5 μg/kg的BMP15均可顯著增加PCNA的表達量(P<0.05)(圖3B，C)。結(jié)合免疫組化和Western blot的結(jié)果，1 μg/kg BMP15處理組顯著提高了顆粒細胞和卵母細胞中PCNA的含量。此外，與對照組相比，1 μg/kg BMP15處理組PCNA、CDK2和CCND1蛋白的表達量分別增加了62%，70%和63%(P<0.05)(圖3D，E)。

A.PCNA免疫組化，箭簇表示染色的顆粒細胞和卵母細胞；B，C.添加BMP15對PCNA蛋白的Western blot和灰色分析；D，E.1 μg/kg BMP15處理后PCNA、CDK2和CCND1的Western blot和灰色分析

2.4 BMP15對體外培養(yǎng)雛雞卵巢縫隙連接的影響通過透射電鏡觀察卵母細胞和顆粒細胞間的縫隙連接。本試驗在BMP15處理后的卵泡超微結(jié)構(gòu)中觀察到了卵母細胞和顆粒細胞間的縫隙連接(圖4A)，而在對照組中沒有觀察到縫隙連接。此外，Western blot的結(jié)果顯示，BMP15處理組與對照組相比卵巢組織中縫隙連接相關(guān)蛋白CX43的表達量增加了86.8%(P<0.05)(圖4B，C)。

A.對照組以及BMP15處理組卵巢組織的超微結(jié)構(gòu),箭鏃表示縫隙連接,O.卵母細胞，GC.顆粒細胞；B，C.添加BMP15后，縫隙連接相關(guān)蛋白CX43表達變化的Western blot結(jié)果和灰色分析

2.5 BMP15在體外促進原始卵泡的激活由于BMPR1B的表達在原始卵泡激活過程中顯著增加，本試驗研究了BMP15對原始卵泡激活的直接作用。ML347是BMP15受體BMPR1B的抑制劑。在體外試驗中，BMP15和ML347單獨或聯(lián)合處理4日齡雛雞卵巢組織3 d。PCNA免疫熒光和TUNEL的結(jié)果表明，BMP15處理組與對照組相比，卵巢皮質(zhì)中PCNA陽性細胞數(shù)量增加，TUNEL陽性細胞數(shù)量下降。ML347和BMP15聯(lián)合處理組與BMP15單獨處理組相比，卵巢皮質(zhì)中PCNA陽性細胞數(shù)量減少，TUNEL陽性細胞數(shù)量增加(圖5A)。qRT-PCR的結(jié)果顯示，BMP15處理組與對照組相比，PCNA和CDK2 mRNA的表達分別增加了2.4倍和2.7倍，凋亡相關(guān)基因半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase3)和BAX mRNA的表達分別降低了47.9%和74.2%(P<0.05)。而ML347和BMP15聯(lián)合處理組與BMP15單獨處理組相比，PCNA和CDK2 mRNA的表達量分別降低了97.5% 和94.3%，顯著增加Caspase3和BAX的mRNA表達量(P<0.05)(圖5B～E)。Western blot結(jié)果表明，ML347和BMP15聯(lián)合處理組與BMP15單獨處理組相比顯著降低PCNA、CDK2和CCND1蛋白的表達量，顯著增加BAX蛋白的表達量(P<0.05)(圖5F，G)。

A.BMP15和ML347單獨或聯(lián)合處理體外培養(yǎng)的第4天雛雞卵巢3 d，箭簇表示PCNA(紅色)和TUNEL(綠色)的顆粒細胞；B～E.PCNA、CDK2、Caspase3和BAX mRNA的表達；F和G.PCNA、CDK2、CCND1和BAX蛋白的Western blot和灰色分析

2.6 BMP15通過Smad1、Smad5和Smad4信號通路激活原始卵泡通過Smad1、Smad5和Smad4信號通路檢測BMP15對原始卵泡的激活。結(jié)果顯示，Smad1、Smad5和Smad4 mRNA在第7天的雛雞卵巢中表達與第5和6天相比顯著增加(P<0.05)，此時間點與原始卵泡激活時間一致(圖6A～C)。體外試驗BMP15處理3 d后qRT-PCR結(jié)果顯示，BMP15處理組與對照組相比,雛雞卵巢中Smad1和Smad5基因表達量提高1.2倍和1.4倍，Smad4的基因表達量提高了3.2倍(P<0.05)(圖6D～F)；Western blot結(jié)果表明，BMP15處理組與對照組相比，顯著增加Smad1、Smad5和Smad4的蛋白表達量(P<0.05)(圖6G，H)。之后，將BMP15和ML347單獨或聯(lián)合培養(yǎng)4日齡雛雞卵巢組織3 d，驗證BMP15在體外通過受體BMPR1B激活下游通路Smad1、Smad5和Smad4。Western blot結(jié)果表明，ML347和BMP15聯(lián)合處理組與BMP15單獨處理組相比降低了Smad1、Smad5和Smad4蛋白的表達量68.8%，62.9%和83.6%(P<0.05)(圖6I，J)。

A.C.雛雞卵巢中Smad1、Smad5和Smad4 mRNA表達量隨日齡的變化；D～H.采用Western blot和qRT-PCR檢測體外BMP15處理后Smad1、Smad5和Smad4 mRNA和蛋白的變化；I，J.BMP15和ML347單獨或聯(lián)合處理后Smad1、Smad5和Smad4的Western blot和灰色分析

3 討論

家禽卵巢中原始卵泡的激活是一個動態(tài)變化的過程，受多種細胞因子、信號通路和激素的精確調(diào)控。BMP15在某些物種中參與細胞增殖和分化，這一過程對原始卵泡的激活至關(guān)重要[19]。然而，BMP15促進雛雞原始卵泡激活的機制尚不清楚。本試驗初步確定了體內(nèi)外試驗中BMP15處理雛雞卵巢組織的有效濃度。

BMP15通過兩種不同的受體BMPR1B和BMPRII轉(zhuǎn)導(dǎo)其信號通路。在家禽卵巢中BMPR1B和BMPRII基因表達量隨著卵泡的增大而增加，表明BMP15可能在家禽卵泡發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用[12,14]。雛雞孵化后的第7天，原始卵泡被激活[4]，結(jié)果顯示，BMP15和BMPR1B的基因表達量以及BMPR1B的蛋白表達量在此時間點達到最高點；說明BMP15在雛雞卵巢原始卵泡的激活過程中發(fā)揮重要作用。

BMP15促進卵巢中卵母細胞和顆粒細胞之間縫隙連接的形成[20]。本試驗中BMP15處理雛雞卵巢后縫隙連接相關(guān)蛋白CX43的表達量明顯上調(diào)。卵母細胞的發(fā)育是通過卵巢中各結(jié)構(gòu)之間相互作用進行的。縫隙連接在卵母細胞與顆粒細胞之間物質(zhì)信息交換的過程中起著重要的作用[21]。CX43是縫隙連接中的一種連接蛋白，在卵泡發(fā)育過程中發(fā)揮了關(guān)鍵的作用[22]。本試驗結(jié)果表明，BMP15通過增加CX43蛋白的表達，增強卵母細胞與顆粒細胞之間的物質(zhì)信號交換，從而促進原始卵泡的激活。

此外，有研究表明，BMP15可促進卵巢中細胞的增殖，抑制細胞的凋亡[23]。原始卵泡的激活與卵巢細胞的增殖和凋亡密不可分。本試驗結(jié)果表明，與對照組相比，添加BMP15處理增加了卵泡發(fā)育過程中與細胞增殖相關(guān)的PCNA蛋白、細胞周期蛋白CDK2和CCND1的表達。同時，添加BMP15處理增加了BCL2的蛋白表達，降低了BAX的蛋白表達。此外，與對照組相比，添加BMP15處理后TUNEL陽性標記結(jié)果高于對照組。說明添加BMP15處理促進了細胞的增殖，抑制了細胞凋亡的發(fā)生，體外和體內(nèi)試驗支持了這些觀點。特異性的受體抑制劑ML347能夠阻止BMP15的效應(yīng)，所以在ML347和BMP15聯(lián)合處理組中檢測到細胞增殖蛋白PCNA、細胞周期調(diào)節(jié)蛋白CCND1和CDK2的表達水平降低，細胞凋亡蛋白BAX表達量增加。因此，BMP15能夠通過調(diào)控雛雞卵巢中細胞增殖蛋白和細胞程序性死亡蛋白來激活原始卵泡。

BMP15通過刺激下游信號通路Smad/1/5/8通路來激活人卵巢中的原始卵泡[17,24]。并且，Smad1和Smad5在小鼠原始生殖細胞的發(fā)育過程中起著重要作用[18]。本試驗結(jié)果表明，雛雞體內(nèi)Smad1、Smad5和Smad4 mRNA表達的變化在出雛后第7天顯著升高，這與雛雞原始卵泡激活的時間一致。通過檢測阻斷劑ML347阻斷受體BMPR1B后BMP15是否對雛雞原始卵泡仍具激活作用，確定BMP15是否通過激活Smad信號通路來激活原始卵泡。結(jié)果表明，BMP15通過激活下游通路Smad1、Smad5和Smad4促進原始卵泡的激活，而ML347會顯著減弱BMP15的這種刺激作用。說明在原始卵泡活化過程中，BMP15通過受體BMPR1B刺激下游信號通路Smad1、Smad5和Smad4，促進原始卵泡激活。

在雛雞原始卵泡的激活過程中，BMP15通過BMPR1B受體激活Smad1、Smad5和Smad4信號通路從而促進卵巢中細胞的增殖，抑制細胞的凋亡。此外，BMP15通過增強卵母細胞和顆粒細胞之間的縫隙連接促進了原始卵泡的激活。這些作用對于雛雞原始卵泡的生長發(fā)育起著至關(guān)重要的作用(圖7)。

圖7 BMP15激活原始卵泡過程的示意圖