甘草素固體分散體的制備及體內(nèi)藥動學研究

張軍，唐粵鵬，陳劍*（.大理大學 藥學院，云南 大理 67000；.上海交通大學 藥學院，上海 0040）

甘草素（liquiritigenin，LQ）是一種從豆科植物中提取的二氫黃酮單體化合物，在自然界中主要以糖苷苷元形式存在。目前發(fā)現(xiàn)甘草素具有抗腫瘤[1]、抗炎[2]、抗抑郁[3]、抗過敏[4]、保護成骨細胞[5]等作用。甘草素為生物藥劑學分類系統(tǒng)（BCS）中Ⅱ類化合物，其溶解度低導致口服生物利用度很低，限制了該化合物的進一步臨床應用。

為解決這一問題，研究者將其溶于pH 4.0～6.0，含量為40%的丙二醇溶液中制備為注射液[6]。在口服制劑方面，該團隊開發(fā)了甘草素的磷脂復合物和亞微米乳液，將其口服生物利用度提高至2.39 倍和5.95 倍[7-8]。

制備固體分散體是增加難溶性藥物的溶解度，提高其口服生物利用度的常見方法。該技術(shù)簡單、高效，通過將藥物轉(zhuǎn)化為無定型狀態(tài)，增強藥物的溶出。截至2020年，F(xiàn)DA 已經(jīng)批準26 種通過該技術(shù)上市的藥物[9]。其中，多數(shù)制劑使用聚乙烯吡咯烷酮K30（PVP K30）作為載體。PVP 是最常研究的親水性聚合物載體之一[10]，具有良好的穩(wěn)定性和溶解性，可防止無定形藥物結(jié)晶。PVPK30廣泛地應用于各種難溶性藥物的固體分散體中，如尼索地平[11]，吲哚美辛[12]，姜黃素[13]等。

目前尚未見甘草素口服固體制劑的報道，本研究擬采用溶劑蒸發(fā)法，以PVP K30 為載體，介孔二氧化硅為吸收劑[14-15]，制備了一種能夠提高口服生物利用度的口服固體制劑甘草素固體分散體。以差示掃描量熱法（DSC）、X 射線衍射分析（XRD）和紅外光譜（IR）對固體分散體進行表征，并通過體外溶出和體內(nèi)藥代動力學實驗，考察該制劑的溶出行為和口服生物利用度。

1 材料

1.1 儀器

RC806 型溶出試驗儀（天津市天大天發(fā)科技有限公司）；STA449F3 型同步熱分析儀（德國耐馳公司）；D8DaVinci 型多功能X 射線衍射儀（德國布魯克公司）；BZF-30 型真空干燥箱（上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司）；1290 型超高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；Nicolet 6700 型紅外光譜儀（美國賽默飛世爾科技公司）；5415 R 型高速離心機（德國艾本德股份公司）。

1.2 試藥

甘草素原料藥（HPLC ≥98%，四川維克奇生物科技有限公司）；聚乙烯吡咯烷酮K30（批號：010420001，重慶斯泰克瑞登梅爾材料技術(shù)有限公司）；介孔二氧化硅（批號：1000356636，德國Syloid 公司）；氫氯噻嗪（HPLC ≥98%，上海易恩化學技術(shù)有限公司）；無水乙醇（上海麥克林生化公司）；乙腈為色譜級。

1.3 動物

SPF 級健康SD 大鼠，雄性，體質(zhì)量200～230 g[上海吉輝實驗動物飼養(yǎng)有限公司，許可證號：SCXK（滬）2017-0012]。所有涉及大鼠的操作均按照《實驗動物護理與使用指南》及相關(guān)中國法律法規(guī)的要求進行，并經(jīng)上海交通大學機構(gòu)動物護理與使用委員會批準（批準號A2021052）。

2 方法

2.1 甘草素的分析方法

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Eclipse Plus RRHD C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）； 流動相：0.1%乙酸溶液-乙腈（60∶40）；流速：0.1 mL·min－1；檢測波長：278 nm；柱溫：30℃；進樣量：5.0 μL。

出席本次展覽開幕式的嘉賓有：浙江省文聯(lián)書記處書記張均林，浙江省文聯(lián)黨組成員、書記處書記徐曉，浙江省直住房公積金管理中心主任應金龍，浙江省美術(shù)家協(xié)會副主席、浙江畫院院長孫永，嘉興日報原社長張扣林，浙江省美術(shù)家協(xié)會副主席、浙江畫院副院長池沙鴻，浙江畫院黨支部書記、山水畫工作室主任茹峰，浙江畫院專職畫師余昌梅，北京華夏十德文化研究院副院長徐茹，浙江省藝術(shù)品鑒賞研究會會長管建平，海寧天桐家文化傳媒有限公司董事長陳國興等；蘭溪市領(lǐng)導嘉賓有：中共蘭溪市委書記朱瑞俊，蘭溪市委常委、宣傳部長翁柯衛(wèi)，蘭溪市人大副主任胡向東，蘭溪市政協(xié)副主席陳興兵。開幕式由蘭溪市副市長吳麗婭主持。

2.1.2 線性關(guān)系 精密稱取100 mg 甘草素于100 mL 量瓶，加入甲醇完全溶解并定容，得到1 mg·mL－1的對照品儲備液；用流動相依次稀釋，得到1、5、10、25、50、100、150 μg·mL－1的對照品溶液，進樣測定。以其質(zhì)量濃度（X）對甘草素峰面積（Y）進行回歸，得到回歸方程Y＝153.4X＋59.01（R2＝0.9998），甘草素在1～150 μg·mL－1與峰面積線性關(guān)系良好。甘草素理論塔板數(shù)為2455。

2.1.3 方法學驗證 取上述1、25、150 μg·mL－1的甘草素對照品溶液，平行進樣測定6 次，測定RSD分別為0.19%、0.19%、0.30%，表明儀器精密度良好。取“2.2”項下10 mg 甘草素固體分散體于100 mL 量瓶，加入流動相超聲溶解、定容，使用0.22 μm 濾膜過濾，得到供試品溶液。取續(xù)濾液，于0、2、4、6、12、24 h 進樣測定，測得RSD為0.61%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。取10 mg甘草素固體分散體6 份，制備成供試品溶液，進樣測定，測得RSD為0.57%，表明該方法重復性良好。取10 mg 甘草素固體分散體于100 mL 量瓶，分別加入“2.1.2”項下對照品儲備液2、4、6 mL，加入流動相超聲溶解并定容，使用0.22 μm 濾膜過濾，得到9 份供試品溶液，進樣測定，測得低、中、高濃度甘草素的平均加樣回收率為99.72%、100.75%、101.50%，RSD為1.6%、2.0%、0.73%。

2.2 甘草素固體分散體的制備

按LQ∶PVP K30 為1∶1、1∶4、1∶6、1∶8、1∶12 的比例稱取原料于燒杯中，加入適量的無水乙醇密封，于室溫下，磁力攪拌1 h；加入50%（w/w）的介孔二氧化硅作為吸收劑，繼續(xù)攪拌2 h 后，于40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去大部分溶劑，殘余溶劑于40℃真空干燥過夜。將所得固態(tài)混合物轉(zhuǎn)移至研缽中，粉碎，過60目篩，即得甘草素固體分散體。

2.3 物理混合物的制備

稱取100 mg 甘草素原料藥、800 mg PVP K30和450 mg 介孔二氧化硅，采用等量倍增法混合均勻，過60 目篩，置于干燥器中保存，備用。

2.4 含量測定

精密稱取適量甘草素固體分散體分散于乙醇中，水浴超聲10 min 后，用乙醇定容至10 mL，搖晃均勻后，過0.22 μm 濾膜，用流動相稀釋適當倍數(shù)，進樣測定。

2.5 體外溶出研究

參照《中國藥典》（2020年版）中的“溶出度與釋放度測定法”第三法小杯法，測定甘草素固體分散體的體外溶出度。轉(zhuǎn)速為50 r·min－1，溫度為（37±0.5）℃，溶出介質(zhì)為含0.25% Tween 80的0.1 mol·L－1HCl 溶液，介質(zhì)體積為150 mL。取甘草素和各處方量制備得到的固體分散體（相當于甘草素20 mg），置于溶出杯中，分別于5、15、30、45、60、90、120 min 取樣，每次每缸取樣2 mL（同時補充等量同溫介質(zhì)），經(jīng)0.22 μm 水相微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液1.0 mL，進樣測定，計算溶出度，繪制溶出曲線，并采用非模型依賴法——f2法對溶出曲線進行評價[16]。

2.6 DSC 分析

取適量甘草素原料藥、PVP K30、介孔二氧化硅、物理混合物、甘草素固體分散體，放于氧化鋁坩堝內(nèi)，在純氮氣下升溫，溫度范圍為40～250℃，速度10 ℃·min－1，進行DSC 分析。

2.7 XRD 分析

為測定藥物的結(jié)晶特征，取適量甘草素原料藥、PVP K30、介孔二氧化硅、物理混合物、甘草素固體分散體粉末，進行XRD 分析。測定條件為X 線光源 Cu 靶，陶瓷X 光管，電壓≤40 kV，電流≤40 mA；掃描速度0.2 S；掃描范圍2θ5°～60°。

2.8 IR 分析

2.9 體內(nèi)藥代動力學

2.9.1 給藥方案及血漿樣品的采集 取健康SD雄性大鼠6 只，隨機分為實驗組和對照組，每組3 只大鼠，給藥前禁食不少于12 h，自由飲水，進行單次、單劑量給藥實驗。對照組灌胃給予相當于20 mg·kg－1的純甘草素混懸液，實驗組灌胃給予相當于20 mg·kg－1的甘草素固體分散體混懸液。給藥后，分別于5、15、30、45、60 min 及1.5、2、3 h，眼眶取血0.5 mL，置于EDTA 抗凝管中，于4 ℃、4000 r·min－1離心5 min，取上層血清，于－20℃冰箱中冷凍備用。

2.9.2 血漿樣品的處理 取血漿樣品100 μL，置于1.5 mL 離心管中，加入內(nèi)標溶液（氫氯噻嗪，37.7 μg·mL－1）40 μL，渦旋混合30 s。加入1 mL乙醚，渦旋混合3 min，4℃、1 610 000 r·min－1轉(zhuǎn)速離心5 min 后，轉(zhuǎn)移上層溶液，于常溫真空干燥箱40℃揮干。用30 μL 流動相復溶，渦旋5 min后，10 000 g 離心5 min，取上清液，待測。

2.9.3 血藥濃度分析方法

① 線性關(guān)系考察：配制質(zhì)量濃度為10 μg·mL－1的甘草素溶液，使用甲醇稀釋至0.02、0.08、0.15、0.3、0.6、1.2 μg·mL－1，體積為100 μL。氮氣吹干后加入100 μL 空白血漿，按照“2.9.2”項下方法對樣品進行處理，進樣測定。以甘草素質(zhì)量濃度為橫坐標（X），甘草素與內(nèi)標物的峰面積比值（Y）為縱坐標，得到線性回歸方程：Y＝1.595×10－4X＋0.066 25，R2＝0.9997，線性范圍為20～1200 ng·mL－1。

② 方法學考察：制備質(zhì)量濃度0.02、0.3、1.2 μg·mL－1的血漿對照品溶液，進樣測定6 次，測定甘草素與內(nèi)標峰面積比值RSD分別為7.1%、2.3%、1.3%，表明儀器精密度良好。取一份血漿樣品，于0、2、4、6、12、24 h 冷凍溶解后，按照“2.9.2”項下方法進行處理，進樣檢測，測得RSD為9.0%，表明血漿樣品在24 h 內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。取空白血漿，配制20、300、1200 ng·mL－1質(zhì)量濃度的血漿對照品溶液，按照“2.9.2”項下方法進行處理，進樣測定，計算加樣回收率分別為83.80%、88.85%、94.83%，RSD分別為3.8%、1.6%、0.42%。取100 μg·mL－1的儲備液，經(jīng)過流動相逐級稀釋，以信噪比3、10 為檢測限、定量限，測得兩者分別為5 ng·mL－1、10 ng·mL－1。

③ 數(shù)據(jù)處理：統(tǒng)計分析采用DAS 2.0 軟件計算藥代動力學參數(shù)。所有數(shù)值均以均值±標準差（SD）表示。采用t檢驗進行統(tǒng)計分析。P＜0.01為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 體外溶出實驗結(jié)果

如圖1所示，物理混合物和固體分散體均可以提高甘草素的溶出效率，而固體分散體相較于物理混合物更加顯著。原料藥、物理混合物在120 min 內(nèi)的累積溶出率分別為（30.10±1.95）%、（45.33±4.93）%；而在制備為固體分散體后，藥物的溶出率顯著增強，并且隨著PVP K30 用量的增加，藥物的溶出速度與累積溶出率逐漸提高。當LQ∶PVP K30 為1∶8、1∶12 時，前45 min 內(nèi)的累積溶出率超過80%，前120 min 內(nèi)累積溶出率達到95%。對幾個處方在前45 min 的溶出曲線進行了相似因子f2的計算。當f2在50～100 內(nèi)時，認為兩條溶出曲線相似[16]。通過計算發(fā)現(xiàn)，LQ∶PVP K30 比例為1∶6 和1∶8 的兩個處方溶出曲線之間的f2是49.79，而1∶8 和1∶12 之間的f2是55.81。因此，可以認為當兩者比例達到1∶8 之后，溶出速度不再有顯著的增長，后期實驗中選擇LQ∶PVP K30比例為1∶8作為制劑處方。

圖1 甘草素各制劑處方溶出曲線（n＝3）Fig 1 In vitro release curve of liquiritigenin and its preparation（n＝3）

3.2 DSC 分析結(jié)果

在DSC 結(jié)果中，甘草素原料藥在212.19 ℃處有一個明顯的尖峰，此為甘草素的熔點峰；PVP K30 和介孔二氧化硅在40～250 ℃沒有明顯的吸收峰；甘草素固體分散體和原料藥相比，在212.19 ℃處的吸收峰消失，表明甘草素在固體分散體中是以無定型的狀態(tài)分布（見圖2）。

圖2 甘草素原料藥（A）、PVP K30（B）、介孔二氧化硅（C）、物理混合物（D）、固體分散體（E）的DSC 圖譜Fig 2 DSC curves of liquiritigenin（A），PVP K30（B），SiO2（C），physical mixture（D）and LQ-SD（E）

3.3 XRD 分析結(jié)果

甘草素原料藥在2θ為10.8°和16.0°附近有較強的吸收峰，在16°～29.3°附近存在一系小峰，表明原料藥中甘草素以結(jié)晶狀態(tài)存在；PVP K30 及介孔二氧化硅并未出現(xiàn)明顯的吸收峰。物理混合物中，甘草素的吸收峰仍然存在，表明簡單的物理混合過程并沒有改變甘草素的晶型存在狀態(tài)。在甘草素固體分散體中，甘草素的特征吸收峰完全消失，表明經(jīng)過制劑加工，甘草素失去了原有的晶型狀態(tài)，以無定型的形式分散其中（見圖3）。

圖3 甘草素原料藥（A）、物理混合物（B）、PVP K30（C）、介孔二氧化硅（D）、固體分散體（E）的XRD 圖譜Fig 3 XRD curves of liquiritigenin（A），physical mixture（B），PVP K30（C），SiO2（D），and LQ-SD（E）

3.4 IR 分析結(jié)果

在甘草素紅外譜圖中（見圖4），3414～3000 cm－1處的強峰以及1600～1000 cm－1內(nèi)的強峰，是由甘草素分子中O-H、C-O 以及苯環(huán)上C＝C 伸縮振動引起的，驗證了分子中苯環(huán)和酚羥基的存在；在1650 cm－1處有一個較強吸收峰，為C＝O 的伸縮振動引起，并且其與苯環(huán)相鄰，由于共軛效應的存在，使羰基的吸收向低波數(shù)移動。在PVPK30 的譜圖中，3423 cm－1和1647 cm－1處的吸收峰是由是由O-H、C＝O 的伸縮振動引起的[17]。對比物理混合物和固體分散體的譜圖，固體分散體的圖譜中C＝O 的吸收峰從1650 cm－1移至1661 cm－1，表明甘草素與載體之間發(fā)生了相互作用力[7，18-19]；兩者中仍然可以看到甘草素的特征吸收峰，表明甘草素在制備處理過程中未受到影響。

圖4 甘草素原料藥（A）、PVP K30（B）、介孔二氧化硅（C）、物理混合物（D）、固體分散體（E）的紅外圖譜Fig 4 IR of liquiritigenin（A），PVP K30（B），SiO2（C），physical mixture（D）and LQ-SD（E）

3.5 體內(nèi)藥代動力學

血藥濃度-時間曲線如圖5所示，DAS 軟件處理得到的藥代動力學參數(shù)如表1所示。與甘草素原料藥相比，口服固體分散體后，最大血藥濃度提高至6.14 倍，相對生物利用度增加至7.08倍，表明該制劑可以促進甘草素的吸收。

表1 甘草素原料藥和固體分散體的主要藥代動力學參數(shù)(n＝3)Tab 1 Main pharmacokinetic parameters for LQ and LQ-SD (n＝3)

圖5 甘草素血藥濃度-時間曲線（n＝3）Fig 5 Plasma concentration-time curves for LQ and LQ-SD（n＝3）

4 討論

固體分散體技術(shù)在藥學領(lǐng)域的應用已經(jīng)十分廣泛。很多研究表明，將難溶性藥物制備成固體分散體，能夠顯著提高藥物在生物體內(nèi)的生物利用度。甘草素作為BCS 中的Ⅱ類化合物，也具有溶解性差的顯著特點。由于目前對其固體分散體的劑型研究較少，本研究采用PVP K30 為載體，制備出甘草素固體分散體制劑。

在研究過程中，考察了PVP K30 的用量對甘草素溶出行為的影響，藥物的溶解隨著載體含量的增加而增加，高比例的PVP K30 在固體分散體中的溶解速率顯著提高，原因可能是PVP K30 是一種親水性聚合物，能夠與藥物作用形成氫鍵，并且對介質(zhì)的表面張力有降低作用，導致疏水藥物表面的潤濕，擴大了溶解的表面積，從而提高固體分散體樣品的溶出速率[10]。在制備過程中，加入介孔二氧化硅作為吸收劑，可以有效地抑制無定型的藥物析出結(jié)晶[20]，二氧化硅表面的硅烷醇基團還可以通過提高藥物顆粒的潤濕性而加快溶解速度[21]。

經(jīng)過各項試驗證明，甘草素能夠以無定型狀態(tài)分布于固體分散體中，體外溶出可達到95%，有效提高了甘草素的溶出度。之前有文獻報道將甘草素制成磷脂復合物，相對生物利用度提高至239%[7]。本研究大鼠體內(nèi)藥代動力學的結(jié)果顯示，甘草素固體分散體相對生物利用度增加至7.08 倍，有更好的改善效果。

綜上所述，本研究制備出的甘草素固體分散體溶解性好、相對生物利用度高，為提高甘草素的口服生物利用度提供了新的思路。