基于高效液相色譜指紋圖譜和化學(xué)模式識別的至寶三鞭丸質(zhì)量一致性評價

王官連，張詠梅，高文雅，劉佳霖，鮑磊，劉傳文，趙小亮，焦玥，劉洋，王志國，李濤，*，杜茂波*（.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 00700；.煙臺中亞至寶藥業(yè)有限公司，山東 煙臺 64000；.中國中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，北京 00700）

中藥丸劑系指原料藥物與適宜的輔料制成的球形或類球形固體制劑，主要包括蜜丸、水蜜丸、水丸等[1]。中藥丸劑的使用歷史悠久，眾多使用至今的中醫(yī)名方如六味地黃丸、逍遙丸等均為丸劑。據(jù)統(tǒng)計，2020年版《中國藥典》一部收載的1607 種成方或單味制劑中，丸劑有412 種，占比達(dá)25%[2]。中藥丸劑的配伍藥味一般較多，且多以飲片細(xì)粉直接入藥，輔料用量大，各藥味占比較低，所以中藥丸劑的物質(zhì)基礎(chǔ)研究更為復(fù)雜和困難[2]。高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜分析技術(shù)由于其覆蓋性強(qiáng)、操作簡單、使用經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)，在中藥的物質(zhì)基礎(chǔ)研究方面顯示出巨大的優(yōu)勢[3]。化學(xué)模式識別可以對指紋圖譜進(jìn)行數(shù)據(jù)降維、識別和分類，強(qiáng)調(diào)其相似性和差異性[4]。通過HPLC 指紋圖譜等現(xiàn)代分析技術(shù)對中藥的化學(xué)組成進(jìn)行全面表征，進(jìn)一步利用化學(xué)模式識別技術(shù)對其相似性或差異性進(jìn)行分析，是建立中藥丸劑質(zhì)量評價和控制體系、提升制劑批次間一致性的有效途徑。

至寶三鞭丸，收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑》（第十六冊），是由海狗鞭、狗鞭、鹿鞭、人參、淫羊藿等40 多味中藥配伍而成的中藥蜜丸，具有補(bǔ)血生精、健腦補(bǔ)腎等功效[5]，用于治療體質(zhì)虛弱、腰背酸痛、腎虧遺精、神經(jīng)衰弱等癥[6-7]。據(jù)統(tǒng)計，至寶三鞭丸已在日本、東南亞、歐美等30 多個國家和地區(qū)銷售，使用相當(dāng)廣泛，對其制劑質(zhì)量的一致性進(jìn)行評價至關(guān)重要。目前，對至寶三鞭丸的質(zhì)量控制和物質(zhì)基礎(chǔ)有一定的研究，如使用薄層色譜對其當(dāng)歸的定性鑒別、HPLC 對其山茱萸中馬錢苷的含量測定等[8-9]，但這些方法遠(yuǎn)不能全面表征其化學(xué)組成，制約了至寶三鞭丸制劑批間一致性的評價和進(jìn)一步質(zhì)量提升的要求。

前期，本課題組提出了應(yīng)用“制劑質(zhì)量標(biāo)志物”進(jìn)行中藥制劑質(zhì)量評價和控制的思路[10-12]，其主要包含以下特點(diǎn)：制劑質(zhì)量標(biāo)志物在中醫(yī)藥理論的指導(dǎo)下，依據(jù)臨床適應(yīng)證的要求，按照君-臣-佐-使配伍后產(chǎn)生；制劑質(zhì)量標(biāo)志物不在原料階段產(chǎn)生，而在制劑階段產(chǎn)生，由工藝所決定；制劑質(zhì)量標(biāo)志物可用于制劑的工藝篩選、質(zhì)量評價及質(zhì)量控制；制劑質(zhì)量標(biāo)志物與臨床適應(yīng)證直接相關(guān)，其含量高低反映了藥效的高低，也就是產(chǎn)品的優(yōu)劣。本研究以已上市銷售且廣泛應(yīng)用的中成藥制劑至寶三鞭丸為研究對象，利用HPLC指紋圖譜分析和化學(xué)模式識別等技術(shù)，對多個批次至寶三鞭丸制劑進(jìn)行分析，探索中藥丸劑物質(zhì)基礎(chǔ)全面表征、質(zhì)量一致性評價策略，為篩選至寶三鞭丸制劑質(zhì)量標(biāo)志物提供前期研究基礎(chǔ)。

1 材料

1260 Infinity Ⅱ液相系統(tǒng)（美國Aglient 公司），包括G7111B 四元泵、G7129A 進(jìn)樣器、G7116A柱溫箱、G7115A DAD 檢測器和OpenLAB CDS 色譜數(shù)據(jù)系統(tǒng)等；SCIENTZ-18N 型冷凍干燥機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；KQ-500DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Milli-Q Integral 5 超純水制備儀（美國Millipore 公司）；甲醇、甲酸（北京Dikma 公司），其他試劑均為色譜級。

15 批次至寶三鞭丸樣品由同一生產(chǎn)廠家按相同的制劑工藝制備，樣品編號（批號）分別為S1（批號：200710）、S2（批號：200811）、S3（批號：200814）、S4（批號：200815）、S5（批號：201018）、S6（批號：201019）、S7（批號：201123）、S8（批號：201124）、S9（批號：201125）、S10（批號：201126）、S11（批號：201128）、S12（批號：201129）、S13（批號：201130）、S14（批號：210301）和S15（批號：210403）（煙臺中亞醫(yī)藥保健酒有限公司）；人參對照藥材（批號：Y09S11H124052）、淫羊藿對照藥材（批號：O21GB165114）（上海源葉生物科技有限公司）；遠(yuǎn)志酮Ⅲ、丹皮酚、淫羊藿苷等對照品（成都普思生物科技股份有限公司），芍藥苷、蛇床子素等對照品（成都曼思特生物科技有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用Waters BEH C18 色譜柱（2.1 mm× 100 mm，1.7 μm）；流動相為0.1%甲酸溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脫（0～5 min，2%B；5～15 min，2%～50%B；15～45 min，50%～98%B；45～50 min，98%B；50～50.1 min，98%～2%B；50.1～60 min，2%B）； 流速為0.2 mL·min－1；柱溫為35℃；樣品室溫度為6℃；檢測波長為203 nm；進(jìn)樣量為20 μL。

2.2 供試品溶液的制備

取至寶三鞭丸小蜜丸，剪碎。取剪碎后的小蜜丸樣品約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入75%甲醇溶液10 mL，稱定重量，振搖至全部溶散，室溫超聲30 min 后，取出，放冷，再次稱定重量，并用75%甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，濾過，再取續(xù)濾液2 mL，用水定容至10 mL，搖勻，于20 000 g 離心15 min，上清液即為至寶三鞭丸供試品溶液。

2.3 人參、淫羊藿對照藥材溶液的制備

取人參和淫羊藿對照藥材粉末約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入75%甲醇溶液10 mL，稱定重量，室溫超聲30 min 后，取出，放冷，再次稱定重量，并用75%甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，濾過，再取續(xù)濾液2 mL，用水稀釋合適倍數(shù)，搖勻，于20 000 g 離心15 min，上清液即為人參（0.005 g·mL－1）和淫羊藿（0.002 g·mL－1）對照藥材溶液。

2.4 對照品溶液的配制

精密稱取各對照品約20 mg，分別置于5 mL量瓶中，加入甲醇溶解，配制成單個對照品儲備液，稀釋合適倍數(shù)備用。其中，淫羊藿苷使用50%甲醇溶解和配制。上述對照品溶液均低溫密封保存。

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取同一批次至寶三鞭丸供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下方法制備，連續(xù)進(jìn)樣6 次，以18 號淫羊藿苷色譜峰作為參照峰，計算得各共有峰相對保留時間RSD＜0.12%，相對峰面積RSD＜1.5%，相似度在0.996 以上，表明該儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批次至寶三鞭丸樣品，按“2.2”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，進(jìn)樣測定，以18 號淫羊藿苷色譜峰作為參照峰，計算得各共有峰相對保留時間RSD＜0.10%，相對峰面積RSD＜2.7%，相似度在0.994 以上，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批次至寶三鞭丸樣品，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別在制備后0、4、8、12 和24 h 進(jìn)行測定，以18 號淫羊藿苷色譜峰作為參照峰，計算得各共有峰相對保留時間RSD＜0.11%，相對峰面積RSD＜3.1%，相似度在0.984 以上，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 指紋圖譜研究

2.8.1 指紋圖譜共有峰的標(biāo)定 根據(jù)15 批次至寶三鞭丸樣品檢測的HPLC 圖譜，選擇穩(wěn)定性、重復(fù)性較好及特征明顯的色譜峰作為共有峰，共標(biāo)定32 個（峰面積均大于總峰面積0.6%），典型的樣品色譜圖見圖1。其中，18 號色譜峰的分離度好、峰高適中、峰面積穩(wěn)定和保留時間居中（28.5 min），且已鑒定為淫羊藿苷，為至寶三鞭丸功效相關(guān)的活性成分[13]，因此選擇18 號峰作為參照峰，計算至寶三鞭丸指紋圖譜中各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果見表1。

表1 至寶三鞭丸指紋圖譜各共有峰的相對保留時間與相對峰面積Tab 1 Relative retention time and relative peak area of the common peak in fingerprint of Zhibao Sanbian pill

2.8.2 指紋圖譜色譜峰的歸屬和成分指認(rèn) 取至寶三鞭丸供試品溶液，人參、淫羊藿對照藥材溶液以及各對照品溶液，進(jìn)樣測定。結(jié)果歸屬了淫羊藿和人參對照藥材在至寶三鞭丸中的特征峰，見圖1，可知淫羊藿藥材對至寶三鞭丸的6 號、7號、12 號、18 號、20 號、23 號、27 號、29 號、30 號和32 號峰有貢獻(xiàn)，人參藥材對27 號、28號、29 號和30 號峰有貢獻(xiàn)。在至寶三鞭丸指紋圖譜標(biāo)定的共有峰中，淫羊藿藥材至少貢獻(xiàn)了10個峰，占總數(shù)的近33.3%。通過至寶三鞭丸樣品與對照品的保留時間、紫外吸收光譜特征的比對，指認(rèn)了至寶三鞭丸指紋圖譜中5 個色譜峰，分別是芍藥苷（7 號峰）、遠(yuǎn)志酮Ⅲ（11 號峰）、丹皮酚（16 號峰）、淫羊藿苷（18 號峰）和蛇床子素（21 號峰），見圖1。

圖1 至寶三鞭丸（A）、淫羊藿對照藥材（B）和人參對照藥材（C）的HPLC 圖譜Fig 1 HPLC chromatogram of Zhibao Sanbian pill（A），Epimedii Folium（B）and Ginseng Radix Et Rhizoma（C）

2.8.3 指紋圖譜的分析與相似度計算 取15 批次至寶三鞭丸供試品溶液，按建立的指紋圖譜方法進(jìn)行分析，將采集到15 批次指紋圖譜數(shù)據(jù)以AIA 格式導(dǎo)入《中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012 版）》，以S12 為參照圖譜，利用中位數(shù)法，設(shè)置時間窗為0.1 min，進(jìn)行全譜峰匹配，對色譜峰進(jìn)行多點(diǎn)校正后自動匹配，并進(jìn)一步手動檢查，生成至寶三鞭丸指紋圖譜疊加圖，見圖2A。對15 批次至寶三鞭丸的指紋圖譜與生成的對照圖譜進(jìn)行相似度計算，結(jié)果相似度為0.841～0.979，見表2，表明至寶三鞭丸各批次樣品制劑的質(zhì)量一致性尚可。

表2 15 批次至寶三鞭丸指紋圖譜的相似度分析結(jié)果Tab 2 Similarity of fingerprint of Zhibao Sanbian pill

2.9 化學(xué)模式識別研究

至寶三鞭丸指紋圖譜中32 個共有峰的峰面積相差較大（相對峰面積范圍0.05～44.77），因此對各共有峰的峰面積進(jìn)行均一化處理，即用每批次各峰的峰面積值除以15 批次峰面積均值結(jié)果表示，進(jìn)行后續(xù)化學(xué)模式識別研究。

2.9.1 系統(tǒng)聚類分析（HCA） 以15 批次至寶三鞭丸指紋圖譜中32 個共有峰均一化后的峰面積為變量，輸入OriginPro 2019b 軟件進(jìn)行HCA 分析，采用平均聚合聚類方法，以平方歐氏距離為分類依據(jù)，繪制至寶三鞭丸聚類分析圖，結(jié)果見圖2B，可知當(dāng)歐氏距離為4 時，15 批次至寶三鞭丸制劑聚為一類；當(dāng)歐氏距離為3 時，15 批次至寶三鞭丸制劑聚為兩類：S14、S12、S11 聚為一類，其他聚為一類。

2.9.2 主成分分析（PCA） 以15 批次至寶三鞭丸指紋圖譜中32 個共有峰均一化后的峰面積為變量，輸入OriginPro 2019b 軟件進(jìn)行PCA 分析，得到PCA 得分圖。結(jié)果見圖2C，可知15 批至寶三鞭丸樣品基本歸為一類，其中S1、S12、S14和S15 相對中心距離較遠(yuǎn)，PCA 結(jié)果與HCA 結(jié)果具有一定相似性。另外，主成分因子載荷矩陣結(jié)果表明，14 號峰、28 號峰、15 號峰等對分類有重要貢獻(xiàn)。

圖2 至寶三鞭丸指紋圖譜及對照指紋圖譜（A）、系統(tǒng)聚類分析（B）和主成分分析（C）結(jié)果Fig 2 HPLC fingerprints（A），cluster analysis（B）and principal component analysis（C）of Zhibao Sanbian pill

3 討論

中藥丸劑的制備工藝大多以飲片原粉形式入藥，在2020年版《中國藥典》收錄的中藥丸劑中以原粉形式入藥的制劑約占68.93%[1-2]，所以在色譜分析前需要對丸劑的提取方法進(jìn)行考察。研究考察了熱水、25%甲醇、50%甲醇、75%甲醇和純甲醇作為提取溶劑，提取時間15、30、60 min 的提取效果，結(jié)果使用75%甲醇提取時樣品的色譜峰數(shù)目更多、峰高更高，30 min 后各峰基本不再變化。但使用75%甲醇提取后，指紋圖譜色譜圖前段有一定的溶劑效應(yīng)，出現(xiàn)色譜峰開裂等現(xiàn)象，所以續(xù)濾液進(jìn)一步用純水稀釋5 倍后再進(jìn)樣分析。并且在進(jìn)行人參、淫羊藿對照藥材與至寶三鞭丸制劑比對時，其供試品溶液的制備方法和上述一致，以更客觀分析兩味藥材對至寶三鞭丸指紋圖譜的貢獻(xiàn)。

至寶三鞭丸由40 多味中藥配伍而成，其化學(xué)組成極其復(fù)雜，每一類成分的最大吸收波長都不同，所以在指紋圖譜的分析中還考察了樣品在203、230、256 和280 nm 波長下檢測效果，結(jié)果在203 nm 檢測波長下樣品色譜峰信息最為豐富。這可能是至寶三鞭丸中萜類、苷類成分眾多的緣故[14-15]，因此本研究選擇人參、淫羊藿作為單味對照藥材進(jìn)行至寶三鞭丸指紋圖譜中各色譜峰的比對，歸屬主要色譜峰。通過優(yōu)化流動相的梯度洗脫方法，至寶三鞭丸和人參、淫羊藿等樣品中主要色譜峰可在60 min 內(nèi)分離完成。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，淫羊藿貢獻(xiàn)了共有峰總數(shù)的近33.3%。另外，通過至寶三鞭丸指紋圖譜與人參皂苷Re、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、淫羊藿苷等30 多種對照品的分析比對，在至寶三鞭丸指紋圖譜中指認(rèn)了芍藥苷、遠(yuǎn)志酮Ⅲ、丹皮酚、淫羊藿苷和蛇床子素等色譜峰，這些成分分別是白芍/芍藥、遠(yuǎn)志、牡丹皮、淫羊藿和蛇床子等藥材的特征性成分。研究表明，淫羊藿苷、芍藥苷、遠(yuǎn)志酮Ⅲ、丹皮酚和蛇床子素等均具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用[13，16-19]，與至寶三鞭丸的藥效相關(guān)，因此本研究建立的至寶三鞭丸的指紋圖譜具有一定的代表性。

本研究結(jié)果表明15 批次至寶三鞭丸制劑的質(zhì)量一致性尚可。但是，由于HPLC 指紋圖譜的局限性，“三鞭”中海狗鞭、狗鞭、鹿鞭等的成分可能無紫外吸收，本研究的分析方法尚不能全部表征至寶三鞭丸的化學(xué)組成，并且也未對主要色譜峰進(jìn)行鑒定和定量分析，如對聚類有重要影響的14 號、28 號和15 號峰，所以至寶三鞭丸的物質(zhì)基礎(chǔ)研究仍需進(jìn)一步深入。