白花刺續(xù)斷野生居群的葉綠體全基因組特征解析

張 倩， 張德全,2*

( 1.大理大學(xué) 藥學(xué)院， 云南 大理 671000； 2. 云南省滇西抗病原植物資源篩選研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 云南 大理671000 )

白花刺續(xù)斷(Acanthocalyxalba)，又名白花刺參，隸屬于川續(xù)斷科(Dipsacaceae)刺續(xù)斷屬(Acanthocalyx)。該屬在我國(guó)有4種2變種，主要分布在云南、四川、西藏等地(Hong et al., 2011)。白花刺續(xù)斷以全草入藥，為傳統(tǒng)藏藥，其藏藥名為“江才嘎?！保驾d于《四部醫(yī)典》(國(guó)家中醫(yī)藥管理局中華本草編委會(huì)，2002)。它是國(guó)家衛(wèi)生部藏藥藥品標(biāo)準(zhǔn)中收載的三種“刺參”之一(青海省藥品檢驗(yàn)所和青海省藏醫(yī)藥研究所，1996)，具有健胃、催吐之功效。內(nèi)服可用于關(guān)節(jié)疼痛、小便失禁、腰痛、眩暈及口眼歪斜，外用治療瘡、化膿性創(chuàng)傷，還具有抗腫瘤作用(國(guó)家中醫(yī)藥管理局中華本草編委會(huì)，2002；楊競(jìng)生，1989)。近年來，有關(guān)白花刺續(xù)斷的研究主要集中在其有效成分、含量測(cè)定及提取工藝等方面(吳春蕾等，2011；Zhang et al., 2013；楊圣賢等，2014；張志鋒等，2015)。如張志鋒等(2018)發(fā)現(xiàn)白花刺續(xù)斷中含有皂苷、生物堿、甾醇等類型化合物，其中皂苷類是其主要有效成分。而分子生物學(xué)方面的研究較少，僅有Wang等(2020)報(bào)道了該種的葉綠體基因組序列。那么，在白花刺續(xù)斷的種內(nèi)居群水平上，其葉綠體基因組序列有什么變化特征呢？

葉綠體基因組在被子植物中通常為母系遺傳。與核基因組和線粒體基因組相比，其基因進(jìn)化速率慢，且在基因組成及結(jié)構(gòu)方面比較保守(Smith, 2015；Szymon et al., 2016；Du et al., 2020)，這使得葉綠體基因組在植物物種鑒定和譜系進(jìn)化研究中具有重要作用。Cui等(2019)對(duì)比分析了32種豆蔻屬(Amomum)植物葉綠體基因組，結(jié)果表明葉綠體全基因組可準(zhǔn)確鑒定豆蔻屬物種；李依容等(2020)利用葉綠體基因組揭示了民族藥滇白珠(Gaultherialeucocarpavar.yunnanensis)復(fù)合群的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系；Zhang等(2021)基于葉綠體基因組重建了桃金娘目(Myrtiflorae)的物種分化時(shí)間和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。但葉綠體基因組在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中，結(jié)構(gòu)上會(huì)發(fā)生一些變異，如反向重復(fù)區(qū)收縮、倒位、基因和內(nèi)含子的丟失等(Zhang et al., 2014；Liao et al., 2020；姜汶君等，2020)，這些結(jié)構(gòu)變異為揭示物種系統(tǒng)發(fā)育和進(jìn)化關(guān)系等提供了遺傳信息。由此可見，植物葉綠體全基因組序列能提供豐富的遺傳信息，在分類鑒定、系統(tǒng)發(fā)育及進(jìn)化等方面具有重要意義。那么，植物葉綠體全基因組是否適用于種內(nèi)居群水平上的群體遺傳學(xué)研究？由于群體水平上測(cè)序成本較高，數(shù)據(jù)分析方法尚不成熟等，相關(guān)研究還較少。

本研究以白花刺續(xù)斷野生居群個(gè)體為研究材料，擬采用二代測(cè)序技術(shù)進(jìn)行高通量測(cè)序，并對(duì)其葉綠體全基因組進(jìn)行拼接、注釋及進(jìn)化分析。擬探討以下科學(xué)問題：(1)白花刺續(xù)斷的葉綠體全基因組序列有何特征；(2)葉綠體全基因組能否用于解析白花刺續(xù)斷種內(nèi)居群水平上的遺傳結(jié)構(gòu)。本研究將為刺續(xù)斷屬相關(guān)物種的分子遺傳學(xué)研究奠定基礎(chǔ)，也為葉綠體全基因組在群體遺傳研究方面開展初步嘗試。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)中，白花刺續(xù)斷分子材料采自于四川省甘孜州的5個(gè)野生居群(表1)，共10份實(shí)驗(yàn)材料。經(jīng)大理大學(xué)張德全教授鑒定為白花刺續(xù)斷(Acanthocalyxalba)，其憑證標(biāo)本保存于大理大學(xué)藥學(xué)院藥用植物與生藥標(biāo)本館。

表 1 白花刺續(xù)斷樣品采集信息Table 1 Collection information of Acanthocalyx alba samples

1.2 基因組DNA提取與測(cè)序

DNA提取采用改良的CTAB方法，從硅膠干燥的葉片材料中提取總基因組DNA。利用Covaris超聲波破碎儀將基因組DNA片段化，經(jīng)末端修復(fù)、加A尾、加測(cè)序接頭、純化及PCR擴(kuò)增等過程，構(gòu)建測(cè)序文庫。文庫經(jīng)質(zhì)量檢測(cè)合格后，使用帶有雙末端(pair-end) (2×300 bp) Illumina Hiseq 2 500平臺(tái)進(jìn)行二代測(cè)序，整個(gè)測(cè)序工作在北京諾禾致源生物科技有限公司完成。

1.3 葉綠體全基因組的組裝、注釋

經(jīng)二代測(cè)序，得到4 G左右原始數(shù)據(jù)(Raw Data)，經(jīng)Trimmomatic V.0.32過濾處理后，利用GetOrganelle.py進(jìn)行組裝，后續(xù)數(shù)據(jù)處理參考本課題組前期工作(胡海粟和張德全，2021)。以白花刺續(xù)斷(序列號(hào)：NC_045055)為參考基因組，使用Geneious 8.0.2軟件完成白花刺續(xù)斷葉綠體全基因組的注釋，并將其提交到NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，利用在線工具Organellar Genome Draw(https://chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/OGDraw.html)繪制葉綠體基因組物理圖譜。

1.4 IR/SC邊界收縮擴(kuò)張及SSR分析

將注釋好的10條基因組序列上傳至網(wǎng)站IRscope(https://irscope.shinyapps.io/irapp/)進(jìn)行IR邊界的收縮和擴(kuò)張分析，最后得到的圖片采用繪圖工具Adobe Illustrator CC 2015進(jìn)行人工調(diào)整。同時(shí)，利用MISA軟件搜索簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simple sequence repeats，SSR)位點(diǎn)并分析白花刺續(xù)斷葉綠體基因組的SSR特征。

1.5 序列差異比較分析

在采用MAFFT V.7.129軟件對(duì)10條白花刺續(xù)斷葉綠體基因組序列進(jìn)行比對(duì)后，使用BioEdit軟件手動(dòng)調(diào)整序列。使用DnaSP V.7.0.26對(duì)葉綠體基因組中的核苷酸變異性(Pi)進(jìn)行滑動(dòng)窗口分析。步長(zhǎng)設(shè)置為200 bp，窗口長(zhǎng)度為600 bp。P-distance使用MEGA v.7.0.26軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。此外，將葉綠體基因組序列的注釋進(jìn)行格式轉(zhuǎn)換，利用在線軟件mVISTA(http://genome.lbl.gov/vista/mvista/submit.shtml)的Shuffle-LAGAN模式對(duì)白花刺續(xù)斷葉綠體全基因組比較分析，選取Acanthocalyxalba(NC_045055)作為參考序列。

1.6 系統(tǒng)發(fā)育分析

根據(jù)白花刺續(xù)斷葉綠體基因組注釋信息，從NCBI數(shù)據(jù)庫下載已發(fā)表的川續(xù)斷科及忍冬科(Caprifoliaceae)的11種植物的葉綠體全基因組序列，用于系統(tǒng)發(fā)育分析。選擇小粒咖啡(Coffeaarabica)和中?？Х?C.arabica)為外類群，使用MAFFT V.7.1將白花刺續(xù)斷與下載的葉綠體全基因組序列進(jìn)行多序列比對(duì)。系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，采用了最大似然法(maximum likelihood, ML)、最大簡(jiǎn)約法(maximum parsimony, MP)和貝葉斯推論法(Bayesian inference, BI)3種方法。核苷酸替代模型經(jīng)jModelTest V 2.1.7軟件篩選定為GTR+G模型。利用RAxML V.8.2.4軟件構(gòu)建ML系統(tǒng)樹，采用快速靴帶算法，重復(fù)1 000次。利用MEGA V.7.0.26軟件構(gòu)建MP樹，重復(fù)1 000次。利用MrBayes V.3.2.6構(gòu)建BI樹，基于馬爾科夫鏈蒙特卡洛(MCMC)算法，計(jì)算100萬代，每隔1 000代取樣一次，舍棄前25%棵樹，根據(jù)剩余的樣本構(gòu)建一致樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組結(jié)構(gòu)與基本特征

白花刺續(xù)斷的葉綠體全基因組為常見的四分體結(jié)構(gòu)，由兩個(gè)反向重復(fù)區(qū)IRs(inverted repeats)、一個(gè)大單拷貝區(qū)LSC(large single copy)和一個(gè)小單拷貝區(qū)SSC(small single copy)組成(圖1，表2)。拼接后的白花刺續(xù)斷葉綠體基因組，全長(zhǎng)為155 335～156 266 bp，GC含量為38.1%～38.2%。各區(qū)段長(zhǎng)度分別為89 027～89 076 bp(LSC)、17 689～17 842 bp(SSC)、24 253～24 666 bp(IRs)。4個(gè)區(qū)段中GC含量最高的是IR區(qū)(42.8%～43.2%)，其次是LSC區(qū)(36.5%)和SSC區(qū)(32.9%)。經(jīng)注釋，得到113個(gè)基因，包括72個(gè)編碼蛋白基因、30個(gè)tRNA基因、4個(gè)rRNA基因和7個(gè)假基因(clpP、accD、ycf2、ycf1、rps18、rps3和ycf3)。此外，白花刺續(xù)斷葉綠體全基因組中有16個(gè)基因含有內(nèi)含子(intron)，且均只含有一個(gè)內(nèi)含子(表3)。

圓圈外的基因是順時(shí)針轉(zhuǎn)錄，圓圈內(nèi)的基因是逆時(shí)針。圖中顏色表示功能基因。內(nèi)部的深灰色對(duì)應(yīng)于GC含量，淺灰色對(duì)應(yīng)于AT含量。The genes outside the circle are transcribed clockwise, while the genes inside the circle are transcribed counterclockwise. The colors here represent functional genes. The inner dark gray corresponds to the GC content and the light gray corresponds to the AT content.圖 1 白花刺續(xù)斷葉綠體全基因組圖譜Fig. 1 Gene map of complete chloroplast genome in Acanthocalyx alba

表 3 白花刺續(xù)斷葉綠體全基因組基因組成Table 3 Composition of complete chloroplast genome of Acanthocalyx alba

2.2 IR/SC邊界收縮擴(kuò)張及SSR分析

葉綠體基因組由兩個(gè)反向重復(fù)的IR區(qū)、LSC區(qū)與SSC區(qū)構(gòu)成，因此存在LSC/IRb、IRb/SSC、SSC/IRa和IRa/LSC 4個(gè)邊界。在基因組進(jìn)化過程中，4個(gè)邊界會(huì)發(fā)生擴(kuò)張與收縮，使某些基因進(jìn)入IR區(qū)或單拷貝區(qū)。不同地點(diǎn)白花刺續(xù)斷的葉綠體基因組的4個(gè)邊界相對(duì)保守(圖2)。LSC/IRb邊界在白花刺續(xù)斷中位于rpl23基因內(nèi)部，且位于LSC區(qū)域的差異不大，為185～186 bp；SD01、YD01、YD02、LT01、LT02、KD01、KD02的IRb/SSC邊界基因完全相同，位于IRb區(qū)trnN-GUU基因138 bp處，而SD02、DF01、DF02的trnN-GUU基因擴(kuò)張到SSC內(nèi)部，距離IRb/SSC邊界48～223 bp；SSC/IRa的邊界在白花刺續(xù)斷基因組中都位于ycf1基因內(nèi)部；IRa/LSC邊界全部位于trnH-GUG基因附近。

圖 2 白花刺續(xù)斷葉綠體基因組LSC、SSC和IR邊緣區(qū)的比較Fig. 2 Comparison of LSC, SSC and IR border regions among ten chloroplast genomes in Acanthocalyx alba

利用MISA軟件對(duì)白花刺續(xù)斷葉綠體全基因組進(jìn)行分析，在白花刺續(xù)斷10條序列中分別檢測(cè)到70、68、70、70、74、74、70、70、71、71個(gè)SSR位點(diǎn)(圖3：B)。SSR最豐富的類型為單核苷酸重復(fù)，其次是二核苷酸重復(fù)、三核苷酸重復(fù)、五核苷酸重復(fù)、四核苷酸重復(fù)和六核苷酸重復(fù)。白花刺續(xù)斷葉綠體基因組中的SSR主要是由A和T組成，其中大部分是以A/T堿基構(gòu)成的單核苷酸重復(fù)，其次是由AT/TA構(gòu)成的二核苷酸重復(fù)(圖3：A)。進(jìn)一步分析表明，大部分SSR位于LSC區(qū)域，小部分位于SSC和IR區(qū)域(圖3：C)。同時(shí)，基因組中的SSR大部分分布于基因間區(qū)(intergenic spacer, IGS)中，其他少數(shù)SSR分布在內(nèi)含子和蛋白編碼區(qū)域(coding sequence，CDS)中(圖3：D)。

A. SD01葉綠體基因組中不同重復(fù)類型SSR出現(xiàn)頻率; B. 10個(gè)基因組中不同SSR類型的數(shù)目; C. 在LSC、SSC和IR區(qū)域中出現(xiàn)SSR的頻率; D. 在IGS、CDS和內(nèi)含子中出現(xiàn)SSR的頻率。A. Frequency of SSR motifs in different repeat types of SD01 chloroplast genome; B. Number of different SSRs type detected in ten genomes; C. Frequency of identified SSR in LSC, SSC and IR regions; D. Frequency of identified SSR in IGS, CDS and intron.圖 3 白花刺續(xù)斷10條葉綠體基因組的SSR分析Fig. 3 Analysis of simple sequence repeat (SSR) on ten chloroplast genomes in Acanthocalyx alba

2.3 序列差異比較分析

將比對(duì)好的5個(gè)地區(qū)白花刺續(xù)斷葉綠體基因組進(jìn)行Sliding window 分析(圖4)。結(jié)果顯示，SSC區(qū)域的變異水平最高，IR區(qū)域最低。同時(shí)，篩選到3條高變異序列，分別位于LSC區(qū)(rpoC1)和SSC區(qū)(ndhF和rpl32-trnL-UAG)。其中，rpl32-trnL-UAG的變異性最高，其次是ndhF，而rpoC1最低。此外，本研究中以SD01作為參考序列，與其余9條白花刺續(xù)斷葉綠體基因組進(jìn)行兩兩比較分析。結(jié)果顯示，葉綠體基因組序列中非編碼區(qū)變異高于蛋白編碼區(qū)域，單拷貝區(qū)(LSC & SSC)變異明顯大于反向重復(fù)區(qū)(IR)。5個(gè)地區(qū)白花刺續(xù)斷葉綠體基因組序列整體上高度相似，變異較大的基因有rpoC2、psbC、rrn23和ycf1，其他基因保守程度非常高?；蜷g區(qū)的變異大于基因區(qū)，如atpF-atpH、psaB-psaA、psaA-ycf3、trnM-CAU-atpE、psbF-psbE、psbE-petL、rrn5-trnN-ACG、trnR-ACG-trnN-GUU、trnL-UAG-ccsA(圖5)。從這些區(qū)域中，可開發(fā)特異性片段，用于該屬種間及種下水平的系統(tǒng)進(jìn)化與發(fā)育研究。

窗口長(zhǎng)度為600 bp， 步長(zhǎng)為200 bp。X軸. 窗口中點(diǎn)的位置； Y軸. 每個(gè)窗口的核苷酸多樣性。Window length is 600 bp, step size is 200 bp. X-axis. Position of the midpoint of a window; Y-axis. Nucleotide diversity of each window.圖 4 白花刺續(xù)斷10條葉綠體全基因組的滑動(dòng)窗口分析Fig. 4 Sliding window analysis of ten chloroplast genomes in Acanthocalyx alba

基于VISTA的標(biāo)識(shí)圖顯示以SD01為參照，對(duì)九個(gè)白花刺續(xù)斷進(jìn)行序列鑒定。VISTA-based identify plot showing sequence identify among nine Acanthocalyx alba using SD01 as a reference.圖 5 白花刺續(xù)斷10條葉綠體基因組的可視化比對(duì)Fig. 5 Visualization alignment of ten chloroplast genomes in Acanthocalyx alba

2.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

本研究利用P-distance種間遺傳變異及核苷酸替換比較了10條白花刺續(xù)斷的葉綠體全基因組進(jìn)化差異，研究結(jié)果表明，P-distance為 0～0.000 7，核苷酸差異值為0～1 515，且大部分序列間地理位置越遠(yuǎn)， 其相互間P-distance和核苷酸差異值越大(表4)。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示，3種方法構(gòu)建的進(jìn)化樹所反映的不同野生居群之間的進(jìn)化關(guān)系相似(圖6)，也與遺傳距離分析的結(jié)果相吻合。在系統(tǒng)發(fā)育樹中，康定(KD)和道孚(DF)的4個(gè)個(gè)體最早分化出來，其次是亞丁(YD)和桑堆(SD)，最后是理塘(LT)的2個(gè)個(gè)體。但亞丁(YD)和桑堆(SD)的4個(gè)個(gè)體不能明顯分開。

表 4 白花刺續(xù)斷個(gè)體間遺傳距離與核苷酸差異值Table 4 Genetic distances and nucleotide difference values among individuals of Acanthocalyx alba

上面的節(jié)點(diǎn)數(shù)是支持值，左邊是MP自展值，中間是ML自展值，右邊是貝葉斯后驗(yàn)概率(PP)值。圖中加黑部分為本文主要研究對(duì)象。Number above nodes are support values with MP bootstrap values on the left, ML bootstrap values in the middle, Bayesian posterior probabilities (PP) values on the right. The black part in the figure is the main research objects of this paper.圖 6 利用最大簡(jiǎn)約法(MP)、最大似然法(ML)和貝葉斯分析法(BI)研究了10個(gè)白花刺續(xù)斷葉綠體全基因組的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系Fig. 6 Phylogenetic relationship of ten Acanthocalyx alba based on complete chloroplast genome using maximum parsimony (MP), maximum likelihood (ML), and Bayesian analyses (BI) methods

3 討論與結(jié)論

本研究報(bào)道了白花刺續(xù)斷的葉綠體全基因組序列特征，并在居群水平上揭示了其地理遺傳結(jié)構(gòu)。不同野生居群的葉綠體基因組所編碼的基因類別、數(shù)量及排列順序高度一致。同時(shí)個(gè)體間具有高度相似的GC含量，單個(gè)序列中IRs區(qū)序列的GC含量最高。白花刺續(xù)斷葉綠體基因組中共含有7個(gè)假基因，其中5個(gè)假基因是川續(xù)斷科植物所共有的(clpP、accD、ycf2、ycf1、rps18)，故推測(cè)可能普遍存在川續(xù)斷科植物假基因現(xiàn)象(Wang et al., 2020)。葉綠體SSR位點(diǎn)是一種高效的分子標(biāo)記。本研究中，白花刺續(xù)斷葉綠體全基因組序列的SSRs主要以A/T堿基為主，這與其他被子植物中的情況相似(Guo et al., 2017；Na et al., 2018；Chen et al., 2019)。同時(shí)，這也進(jìn)一步證實(shí)了葉綠體SSRs 主要是由polyA和polyT重復(fù)所構(gòu)成，而較少含有C或G串聯(lián)重復(fù)的觀點(diǎn)(Kuang et al., 2011)。此外，這些SSRs主要分布在2個(gè)單拷貝區(qū)，故推測(cè)這些高A/T含量的SSRs和分布于IR區(qū)的rRNA序列可能是導(dǎo)致葉綠體基因組中GC含量偏低以及各區(qū)域堿基含量差異的潛在原因(張明英等，2020)。

IR區(qū)和SC區(qū)的擴(kuò)張和收縮被認(rèn)為是直接影響被子植物葉綠體基因組大小的重要因素(Wang et al., 2017；Song et al., 2019)。本研究表明，不同野生居群個(gè)體間葉綠體基因組4個(gè)邊界均未出現(xiàn)明顯的擴(kuò)張和收縮現(xiàn)象，說明白花刺續(xù)斷葉綠體基因組IRs區(qū)大小高度保守，這也與Wang等(2020)研究結(jié)果一致。從葉綠體基因組中發(fā)掘的高變片段，不僅可以在物種水平上用于系統(tǒng)發(fā)育和物種鑒定研究，也可以在居群水平上提供豐富的遺傳信息，從而揭示物種的居群動(dòng)態(tài)與進(jìn)化歷史等。Fatemeh等(2018)基于rpl32-trnL-UAG對(duì)滇紫草屬(Onosma)物種進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析和分化時(shí)間估計(jì)；Nahla等(2020)采用rpoC1對(duì)苜蓿屬(Medicago)植物進(jìn)行親緣關(guān)系分析；Chen等(2020)基于葉綠體基因組對(duì)貝母屬(Fritillaria)植物進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)篩選出的ycf1和psbM-psbD可作為特定條形碼用于貝母屬植物物種鑒定。這些研究工作也進(jìn)一步證實(shí)高變片段在物種進(jìn)化及鑒定等方面具有特殊作用。本研究中，篩選出3個(gè)高變片段(rpoC1、ndhF和rpl32-trnL-UAG)，可用于刺續(xù)斷屬內(nèi)種間系統(tǒng)發(fā)育及種內(nèi)群體遺傳學(xué)研究。

傳統(tǒng)上，常用葉綠體基因片段來研究物種的群體遺傳結(jié)構(gòu)和譜系進(jìn)化關(guān)系，但因葉綠體片段多態(tài)位點(diǎn)不足而作用有限(Zhang et al., 2019；Zhang et al., 2020；劉家奇等，2021)。與之相比，葉綠體全基因組具有極為豐富的遺傳變異，為復(fù)雜植物類群的遺傳進(jìn)化研究提供有效手段。Wang等(2020)基于美國(guó)山核桃(Caryaillinoinensis)兩個(gè)不同居群間葉綠體基因組核苷酸差異性，揭示了該物種居群水平的遺傳多樣性。本研究中，白花刺續(xù)斷5個(gè)野生居群間具有較為明顯的遺傳結(jié)構(gòu)，個(gè)體間的遺傳距離、核苷酸差異值與地理距離之間呈較好的相關(guān)性。這也與系統(tǒng)發(fā)育樹所揭示的進(jìn)化關(guān)系相吻合。值得注意的是，桑堆(SD)和亞丁(YD)的四個(gè)個(gè)體沒有形成獨(dú)立分支，這可能是兩個(gè)居群間地理距離較近引起相對(duì)頻繁的基因流所致。這一結(jié)果也說明，與核基因組相比，葉綠體基因組進(jìn)化較慢及單親遺傳的特性，其作用也有明顯的局限性。

綜上所述， 葉綠體全基因組序列具有極為豐富的遺傳信息，可為復(fù)雜植物類群及種下居群水平上的群體遺傳及譜系進(jìn)化研究提供有效手段。但由于二代測(cè)序的價(jià)格仍舊較為高昂，本文中居群樣本量較少，本研究結(jié)果的科學(xué)性尚有不足。因此，葉綠體基因組能否作為傳統(tǒng)的分子片段或標(biāo)記的技術(shù)補(bǔ)充，需要更多研究工作來驗(yàn)證。此外，將葉綠體全基因組用于群體遺傳學(xué)分析的數(shù)據(jù)分析方法也有待于進(jìn)一步完善。