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      基于免疫相關(guān)細(xì)胞因子研究理沖湯對子宮肌瘤細(xì)胞凋亡和增殖的影響

      2022-11-16 08:19:52李冬華王文娜
      世界中醫(yī)藥 2022年12期
      關(guān)鍵詞:蛋白酶肌瘤子宮

      李冬華 劉 宇 王文娜

      (首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院,北京,100069)

      子宮肌瘤(Uterine Fibroid)是女性生殖系統(tǒng)最常見的良性腫瘤,育齡人群發(fā)病率高達(dá)70%[1-2]。因其可導(dǎo)致月經(jīng)量增多、痛經(jīng)甚至不孕等問題,嚴(yán)重影響女性的身心健康[3-4],故一直備受學(xué)界重視。目前子宮肌瘤的病因尚不完全明確。子宮肌瘤不僅病程較長,而且會伴隨諸多的臨床癥狀。對于體積較大的肌瘤,臨床上通常采用子宮切除術(shù)的終極治療手段,但對于要求保留子宮的肌瘤患者來說這樣的手術(shù)方法往往難以接受。雖然有肌瘤剔除術(shù)可供選擇,但其存在較高的術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)[5],也不是理想的解決方案?,F(xiàn)代醫(yī)學(xué)主要使用激素類藥物,如促性腺激素釋放激素(Gonadotropin-releasing Hormone,GnRH)激動劑、米非司酮等,雖然臨床療效明確,但嚴(yán)重的不良反應(yīng)及潛在的致癌風(fēng)險(xiǎn)限制了其長期使用,而且還存在著停藥后極易復(fù)發(fā)等問題[6-7]。目前子宮肌瘤尚缺少理想的治療藥物,因此臨床上仍存在部分患者的治療需求無法得到滿足的問題。

      理沖湯是治療子宮肌瘤的中醫(yī)經(jīng)典名方,大量臨床實(shí)踐證實(shí)該方可明顯縮小肌瘤體積,顯著改善臨床癥狀,對子宮肌瘤具有較為理想的療效。前期研究表明理沖湯可抑制腫瘤新生血管生成、阻礙細(xì)胞外基質(zhì)降解以及抑制腫瘤免疫逃逸[8-10],提示理沖湯對子宮肌瘤微環(huán)境具有改善作用。但是理沖湯調(diào)控免疫應(yīng)答抗子宮肌瘤的作用機(jī)制還不是十分清楚,目前仍存留著諸多科學(xué)問題值得被人們深入研究。因此,本研究通過透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu),采用免疫組織化學(xué)染色檢測胱天蛋白酶-3、Ki67的表達(dá)情況,以及使用MSD電化學(xué)發(fā)光技術(shù)檢測白細(xì)胞介素-12p70(Interleukin-12p70,IL-12p70)、IL-1β、IL-6、生長相關(guān)癌基因/角質(zhì)形成細(xì)胞趨化蛋白(Growth-related Oncogene/Keratinocyte Chemoattractant,GRO/KC)的表達(dá)水平,研究理沖湯調(diào)控免疫相關(guān)細(xì)胞因子,促進(jìn)子宮肌瘤細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞增殖的作用機(jī)制,為理沖湯的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

      1 材料與方法

      1.1 材料

      1.1.1 動物 CB-17 Scid小鼠[北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物科技有限公司,SCXK(京)2016-0001],雌性,未孕,6~9周齡,共24只,飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物部,溫度為25~27 ℃,恒濕為45%~50%,飼養(yǎng)環(huán)境為無特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級。本研究通過倫理委員會審批(倫理審批號:AEEI-2017-115)。

      1.1.2 藥物 理沖湯的藥物組成為生黃芪9 g、黨參6 g、白術(shù)6 g、生山藥15 g、天花粉12 g、知母12 g、三棱9 g、莪術(shù)9 g、生雞內(nèi)金9 g,上述藥物均購自北京同仁堂飲片有限責(zé)任公司。制備工藝如下,飲片水提2次,煎煮1 h/次,首次加入飲片的8倍量水,第2次加6倍量水,煎成之時(shí),加少許好醋。合并2次煎液,溫度為60 ℃,壓力為0.05 kPa的條件下過濾減壓,濃縮至浸膏(相對密度為1.3)。最終配置成含生藥1.7 g/mL的濃縮液,-4 ℃低溫保存。

      米非司酮(北京紫竹藥業(yè)有限公司,批號:43110911),用0.5%羧甲基纖維素鈉(Sigma公司,美國,批號:C5678)配制成懸液,濃度為0.7 mg/mL。黃體酮注射液(上海通用公司,批號:130905);苯甲酸雌二醇注射液(天津金耀氨基酸公司,批號:0703121);堿性成纖維細(xì)胞生長因子(Signalway Antibody公司,美國,批號:70402);表皮生長因子(Signalway Antibody公司,美國,批號:70504)。

      1.1.3 試劑與儀器 MSD試劑盒(上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司,批號:K15048D-1);光學(xué)顯微鏡(Olympus公司,日本,型號:CX31);MSD超敏因子電化學(xué)發(fā)光分析儀(MSD公司,美國,型號:Quick-Plex SQ120)。

      1.2 方法

      1.2.1 分組和異種移植小鼠子宮肌瘤模型的建立 將24只小鼠采用隨機(jī)數(shù)字法分為正常組、模型組、理沖湯組和陽性藥組,每組6只。人子宮肌瘤樣本來源于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院因患子宮肌瘤行全子宮切除術(shù)者,確?;颊咧辽僭谛g(shù)前3個(gè)月未接受過其他藥物治療,實(shí)驗(yàn)樣本通過組織病理學(xué)證實(shí)。取子宮肌瘤組織1 cm3左右,迅速置于磷酸鹽緩沖液(Phosphate-Buffered Saline,PBS)(含3%青鏈霉素)中,封閉冰浴轉(zhuǎn)移至細(xì)胞間。把組織塊盡可能切成糜狀,Ⅰ型膠原酶消化約2 h,使用70 μm細(xì)胞篩收集細(xì)胞。細(xì)胞在20%胎牛血清培養(yǎng)液中培養(yǎng),傳至2~3代時(shí)將細(xì)胞濃度調(diào)整為1.5×106個(gè)/mL用于細(xì)胞異種移植手術(shù)。除正常組外,其他小鼠腹腔注射雌、孕激素7 d以促進(jìn)子宮發(fā)育。使用戊巴比妥鈉麻醉小鼠,剖腹探查術(shù)剝離Y形子宮,在子宮左側(cè)分角處注入表皮生長因子(0.5 ng/mL)和堿性成纖維細(xì)胞生長因子(2 ng/mL)。注射器吸取100 μL子宮肌瘤細(xì)胞懸液,并與伊文思藍(lán)混合(使注射位點(diǎn)可視化)后注入小鼠子宮右側(cè)分角處,操作結(jié)束后逐層縫合腹膜切口。28 d后各組選取1只小鼠進(jìn)行子宮病理學(xué)鑒定,當(dāng)平滑肌有明顯紊亂或增厚,視為模型制備成功。

      1.2.2 藥物干預(yù) 理沖湯組每日灌服理沖湯濃縮液(30 g/kg)。陽性藥組每日灌服米非司酮懸液(2.9 mg/kg)。正常組和模型組每日灌以等量的0.9%氯化鈉溶液。連續(xù)藥物干預(yù)28 d。

      1.2.3 檢測方法 透射電子顯微鏡:切取子宮組織1 mm3,戊二醛固定液固定24 h。PBS沖洗3次,加入1%鋨酸,靜置處理1 h。4 ℃環(huán)境下進(jìn)行乙醇梯度脫水3次,之后按1∶1比例配制90%乙醇和90%丙酮混合溶液再次脫水,最后于室溫環(huán)境下100%丙酮中脫水。將組織樣品逐梯度滲透,使包埋劑浸入組織細(xì)胞內(nèi),之后烘箱進(jìn)行固化。采用超薄切片機(jī)將組織塊切片,切片面積控制在0.5 mm×0.3 mm之內(nèi),厚度為10~100 μm。檸檬酸鉛和醋酸雙氧鈾染色后,切片移至電鏡下進(jìn)行觀察。

      免疫組織化學(xué)染色:使用多聚甲醛固定子宮肌瘤組織,常規(guī)浸蠟、包埋,切成厚度約為5 μm的組織切片。切片常規(guī)脫蠟后進(jìn)行抗原修復(fù),再浸泡在3% H2O2溶液中,室溫避光25 min。10%正常兔血清封閉后,加入一抗,濕盒內(nèi)4 ℃孵育過夜。次日加入二抗室溫孵育50 min。DAB顯色和細(xì)胞核復(fù)染,中性樹膠封片。鏡下觀察拍照,ImageJ軟件對圖片進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。

      MSD電化學(xué)發(fā)光技術(shù):將配置完成的標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)溶室溫平衡15 min,渦旋震蕩,標(biāo)準(zhǔn)品原液4倍稀釋,樣本和質(zhì)控品稀釋2倍。用200 μL洗滌液反復(fù)清洗MSD板3次,每孔加入50 μL樣品,室溫下孵育2 h,每孔中25 μL檢測抗體,室溫孵育2 h,之后加入150 μL的讀板液,使用MSD設(shè)備讀板分析。

      2 結(jié)果

      2.1 采用透射電鏡觀察子宮平滑肌細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu) 正常組的子宮平滑肌細(xì)胞呈長梭形,排列整齊,相鄰細(xì)胞體積一致,細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整。細(xì)胞核明顯,核仁位于中央,無腫大或固縮。胞質(zhì)內(nèi)各細(xì)胞器數(shù)量、結(jié)構(gòu)均正常;模型組的子宮平滑肌細(xì)胞肥大,細(xì)胞間隙增寬,排列不規(guī)則,細(xì)胞周圍存在大量纖維結(jié)締組織。細(xì)胞膜增厚、缺損,界限不清。細(xì)胞核有明顯皺縮,核仁模糊不清甚至消失。細(xì)胞器均有不同程度的腫大變形,可見線粒體基質(zhì)變淺,嵴變短,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張,內(nèi)部形成空泡;理沖湯組的子宮平滑肌細(xì)胞形態(tài)正常,排列有序,細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整,僅有少量胞膜增厚。細(xì)胞核清晰,呈輕度固縮,核仁無異常。線粒體與粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量較模型組明顯減少,部分輕微腫大;陽性藥組的子宮平滑肌細(xì)胞排列紊亂程度較模型組顯著減輕,但細(xì)胞間隙寬窄不等,其間可見少量纖維結(jié)締組織。細(xì)胞膜大體完整,個(gè)別部位有破損,胞膜增厚不明顯。細(xì)胞核結(jié)構(gòu)清晰,核膜完整,核仁位于中央,略有皺縮。少量發(fā)達(dá)的線粒體圍繞于胞核周圍,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹不明顯。見圖1。

      圖1 子宮平滑肌細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)(×8 000)

      2.2 采用免疫組織化學(xué)染色檢測胱天蛋白酶-3、Ki67的表達(dá)情況 與正常組比較,模型組胱天蛋白酶-3表達(dá)明顯降低,Ki67的陽性率明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較,理沖湯組和陽性藥組的胱天蛋白酶-3的表達(dá)明顯升高,Ki67的陽性率明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

      表1 子宮組織中胱天蛋白酶-3、Ki67表達(dá)情況

      胱天蛋白酶-3主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中,表達(dá)胱天蛋白酶-3的細(xì)胞被染成棕黃色。Ki67主要表達(dá)于細(xì)胞核中,表達(dá)Ki67的細(xì)胞核被染成紅色。由此可看出較之于正常組,模型組中的平滑肌細(xì)胞和腺體細(xì)胞中Ki67的表達(dá)較為豐富,胱天蛋白酶-3的表達(dá)較少,而理沖湯組和陽性藥組中Ki67的表達(dá)較少,但胱天蛋白酶-3的表達(dá)增多。見圖2、3。

      圖2 4組胱天蛋白酶-3的表達(dá)情況(免疫組織化學(xué)染色,×200)

      圖3 4組Ki67的表達(dá)情況(免疫組織化學(xué)染色,×200)

      2.3 4組IL-12p70、IL-1β、IL-6、GRO/KC的表達(dá)情況 與正常組比較,模型組IL-12p70的表達(dá)水平明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與模型組比較,理沖湯組IL-12p70的表達(dá)量明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),陽性藥組IL-12p70表達(dá)升高,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

      與正常組比較,模型組IL-1β、IL-6、GRO/KC的表達(dá)水平明顯升高(P<0.05,P<0.01);與模型組比較,理沖湯組的IL-1β、IL-6、GRO/KC的表達(dá)明顯降低(P<0.05,P<0.01),陽性藥組僅IL-6表達(dá)明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),IL-1β、GRO/KC變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

      表2 子宮組織中IL-12p70、IL-1β、IL-6、GRO/KC表達(dá)情況

      3 討論

      腫瘤的發(fā)病和人體自身免疫應(yīng)答異常有著非常緊密的關(guān)系?,F(xiàn)代免疫編輯理論認(rèn)為,腫瘤的發(fā)生發(fā)展在患者體內(nèi)要經(jīng)歷3個(gè)階段:清除、平衡、逃逸[11]。早期新生腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的抗原性,易被免疫系統(tǒng)識別并清除。如果此時(shí)腫瘤細(xì)胞逃脫免疫系統(tǒng)的“清除”功能,即會進(jìn)入“平衡”狀態(tài),此階段腫瘤細(xì)胞的抗原性減弱,不易被免疫系統(tǒng)識別和清除。當(dāng)這種“積累效應(yīng)”達(dá)到一定程度時(shí),就會打破平衡,最終實(shí)現(xiàn)免疫逃逸,形成實(shí)體腫瘤[12]。腫瘤發(fā)生的實(shí)質(zhì)即是機(jī)體抗腫瘤免疫系統(tǒng)逐漸步入劣勢,腫瘤細(xì)胞逐漸趨于強(qiáng)勢的過程。

      在子宮肌瘤形成的過程中,免疫微環(huán)境內(nèi)的不同細(xì)胞因子發(fā)揮了不同作用。IL-12p70是抗腫瘤免疫應(yīng)答反應(yīng)中的重要細(xì)胞因子。目前有研究證實(shí),IL-12p70可以增強(qiáng)CD8+T淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、巨噬細(xì)胞對腫瘤的殺傷作用[13]。同時(shí),IL-12p70還可以誘導(dǎo)免疫淋巴細(xì)胞產(chǎn)生γ干擾素,進(jìn)而改變腫瘤細(xì)胞增殖周期,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡[14]。IL-1β與腫瘤的增殖、分化及侵襲過程密切相關(guān)。IL-1β在產(chǎn)生生物活性前,需要經(jīng)過胱天蛋白酶-1的剪切加工,IL-1β成為成熟體后可以介導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子(Vascular Endothelial Cell Growth Factor,VEGF)的生成,進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤新生血管的形成,促進(jìn)腫瘤生長[15]。IL-6主要通過JAK激酶2(Janus Kinase 2,JAK2)以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(Signal Transduction and Activator of Transcription 3,STAT3)信號通路促進(jìn)局部炎癥反應(yīng)的發(fā)生,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲。腫瘤細(xì)胞同樣通過STAT3信號通路促進(jìn)IL-6的分泌[16]。腫瘤生長相關(guān)基因(Growth Related Oncogene)GRO/KC是ELR-CXC趨化因子家族中的一員,GRO與受體CXCR2結(jié)合可誘發(fā)多種生理效應(yīng),如炎癥反應(yīng)、病毒感染等[17]。近年來發(fā)現(xiàn),GRO在肺癌、胃癌、膀胱癌等癌癥中呈高表達(dá)狀態(tài),后續(xù)研究也證實(shí)GRO與腫瘤的增殖、侵襲等過程具有一定相關(guān)性[18]。胱天蛋白酶-3是細(xì)胞凋亡通路下游的關(guān)鍵蛋白,其表達(dá)水平反映了細(xì)胞的凋亡程度。通常胱天蛋白酶-3在細(xì)胞質(zhì)中處于無活性狀態(tài),凋亡程序啟動時(shí)胱天蛋白酶-3被激活,并對局部結(jié)構(gòu)蛋白進(jìn)行切割,最終引起細(xì)胞凋亡[19]。抑制細(xì)胞增殖因子Ki67分布于細(xì)胞核內(nèi),其活性與細(xì)胞增殖過程密切相關(guān),是衡量細(xì)胞增殖水平的標(biāo)志物,也是評估腫瘤預(yù)后的重要指標(biāo)[20]。

      理沖湯是治療正虛血瘀型子宮肌瘤的中醫(yī)經(jīng)典名方,出自張錫純所著醫(yī)書《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》,用來治療“婦女閉經(jīng)不行或產(chǎn)后惡露不盡,……治一切臟腑癥瘕、積聚、氣郁、脾弱、滿悶、痞脹、不能飲食”。該方具有扶正祛瘀之功效,為消補(bǔ)兼施的良方。方中黃芪與黨參為君藥,用以扶正祛邪、益氣活血,使瘀血去,新血生;三棱與莪術(shù)為臣藥,以活血祛瘀;白術(shù)、山藥、知母、天花粉共為佐藥,其中白術(shù)、山藥補(bǔ)氣健脾,助參芪扶正,防化瘀太過傷氣,知母、天花粉涼潤解毒,可制參芪之熱,又可滋腎水之枯;生雞內(nèi)金為使藥,消積散結(jié)而不傷正。理沖湯配伍嚴(yán)謹(jǐn),用藥精當(dāng),攻補(bǔ)兼施,體現(xiàn)了扶正祛邪兼顧,消癥瘕而不傷正,益氣血而不留瘀的特點(diǎn)。因此,理沖湯被廣泛應(yīng)用于治療正虛血瘀之婦科癥瘕,十分契合子宮肌瘤的中醫(yī)病機(jī)。

      本研究結(jié)果顯示,理沖湯能夠改善子宮組織的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu),促進(jìn)細(xì)胞凋亡因子胱天蛋白酶-3的表達(dá),抑制細(xì)胞增殖因子Ki67的表達(dá),同時(shí)促進(jìn)IL-12p70,抑制IL-1β、IL-6、GRO/KC的表達(dá),說明理中湯可以通過調(diào)控免疫相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)水平進(jìn)而促進(jìn)子宮肌瘤細(xì)胞凋亡、抑制其細(xì)胞增殖,達(dá)到抑制子宮肌瘤的目的。

      中醫(yī)藥治療子宮肌瘤具有突出優(yōu)勢,但基礎(chǔ)研究較為薄弱,存在著物質(zhì)基礎(chǔ)及藥理作用機(jī)制不明確等問題,一定程度上阻礙了中醫(yī)藥進(jìn)一步邁向科學(xué)化和國際化的進(jìn)程。本研究闡釋了理沖湯在免疫調(diào)控方面的部分作用機(jī)制,旨在為理沖湯的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù),為中醫(yī)藥事業(yè)的發(fā)展做出積極貢獻(xiàn)。

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