溫和灸足三里穴對自然衰老大鼠的腎臟保護(hù)作用及腎組織纖連蛋白、轉(zhuǎn)化生長因子-β1表達(dá)的影響

趙舒羽 劉文博 吳煥淦, 崔云華 張紓研 殷之光 戚 莉 劉世敏 林亞瑩 趙 琛 黃 艷,

(1 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，上海，200437；2 上海市針灸經(jīng)絡(luò)研究所，上海，200030；3 上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海，201203)

隨著年齡增長，人體器官的結(jié)構(gòu)和功能都會發(fā)生相應(yīng)的改變，器官衰老是各種老年疾病發(fā)生發(fā)展的生物學(xué)基礎(chǔ)，腎臟是衰老相關(guān)組織損傷的典型靶器官[1]。研究發(fā)現(xiàn)，在沒有高血壓、糖尿病、動脈粥樣硬化等衰老相關(guān)疾病的衰老人群中，腎臟也會發(fā)生多種結(jié)構(gòu)及功能變化，可以認(rèn)為這些變化是單純衰老所引起的腎臟改變[2]。

臨床研究表明，艾灸具有良好的延緩衰老作用。足三里穴是重要的保健要穴，已有實驗研究證實，艾灸足三里穴可增加超氧化物歧化酶等酶類抗氧化劑的含量，降低丙二醛等代謝產(chǎn)物的含量，具有良好的抗衰老作用[3-5]。課題組前期臨床研究發(fā)現(xiàn)，艾灸足三里、腎俞、關(guān)元等穴可改善老年人衰老相關(guān)癥狀[6-7]。本研究基于自然衰老大鼠模型，率先對衰老典型器官-腎組織進(jìn)行靶向研究，以經(jīng)典的小鼠衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)作為腎臟衰老的生物學(xué)指標(biāo)，通過觀察溫和灸足三里穴對自然衰老大鼠腎組織結(jié)構(gòu)與功能的影響，并進(jìn)一步觀察大鼠腎組織纖連蛋白(Fibronectin，F(xiàn)N)表達(dá)及轉(zhuǎn)化生長因子-β1(Transforming Growth Factor-beta l，TGF-β1)基因轉(zhuǎn)錄情況，研究溫和灸足三里穴對腎臟衰老的保護(hù)效應(yīng)及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物 雄性清潔級SD大鼠(56周齡、36周齡)，采購于上海西普爾-必凱實驗動物有限公司[動物許可證號：SCXK(滬)2012-0002]，本研究得到上海中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物福利與倫理委員會的批準(zhǔn)，并在此批準(zhǔn)下進(jìn)行(倫理審批號：PZSHUTCM190524004)。動物實驗觀察室明暗各12 h，室內(nèi)溫度為20～22 ℃，相對濕度為50%～70%，自由攝食與飲水。實驗動物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。未發(fā)現(xiàn)不良反應(yīng)，飲食和飲水均正常的動物方可用于實驗。實驗過程中對實驗動物的操作均符合動物福利的基本原則、3R原則等相關(guān)要求。

1.2 試劑與儀器 戊巴比妥鈉(Sigma公司，美國，貨號：P3761)；無水乙醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，貨號：10009218)；多聚甲醛(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，貨號：80096618)；二甲苯(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，貨號：10023418)；中性樹膠(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，貨號：10004160)；十二水合磷酸氫二鈉(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，貨號：200040618)；磷酸二氫鈉(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，貨號：200407008)；氯化鈉(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，貨號：10019308)；鹽酸(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，貨號：80070560)；細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒(碧云天公司，貨號：C0602)；無毒環(huán)保蘇木素-伊紅染液(南京建成科技有限公司，貨號：D006)；Masson染色試劑盒(博士德生物公司，貨號：GP1032)；大鼠Albumin定量ELISA試劑盒(司鼎生物科技有限公司，貨號：SDR005196T)；即用型SABC三步法試劑盒(博士德生物公司，貨號：SA1054)；抗纖連蛋白抗體(Anti-Fibronectin antibody)(上海艾博抗有限公司，貨號：ab23751)特制細(xì)艾條(南陽漢醫(yī)艾絨廠，直徑0.5 cm，長度12 cm)；光學(xué)顯微鏡及分析軟件(OLYMPUS公司，日本，BX53)；臺式高速離心機(jī)(Eppendorf公司，德國，5810R)。

1.3 分組與模型制備 56周齡SD大鼠常規(guī)喂養(yǎng)至80周齡，建立自然衰老大鼠模型。56周齡大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為自然衰老組、艾灸足三里組，每組10只。另購36周齡對照組大鼠10只。自然衰老組大鼠飼養(yǎng)至80周齡，單純抓取，不進(jìn)行治療。艾灸足三里組大鼠14月齡開始進(jìn)行溫和灸干預(yù)，穴位定位方法參考《實驗針灸學(xué)》(余曙光等主編，上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2014年出版)中常用動物穴位定位及相關(guān)文獻(xiàn)，采用直徑0.5 cm特制細(xì)艾條，溫和灸單側(cè)“足三里”穴，依據(jù)大鼠皮膚受熱程度調(diào)整高度，距離穴位皮膚2～4 cm，1次/d，20 min/次，左右兩側(cè)穴位交替進(jìn)行，共干預(yù)6個月。

1.4 標(biāo)本采集與處理 全部干預(yù)結(jié)束后，大鼠禁食24 h(不禁水)，放入大鼠代謝籠，編號收集尿液，離心(400×g，5 min)取得上清液，待檢。2%戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉(0.2 mL/100 g)，剖開大鼠腹腔，干棉球鈍性分離腹膜及腸道組織，腹主動脈取血，離心(1 200×g，10 min)取上清，-80 ℃保存；于冰浴環(huán)境取大鼠雙側(cè)腎組織，將兩側(cè)腎臟分別十字剖開，分為8等份，左側(cè)迅速放入凍存管，-80 ℃保存；右側(cè)置于4%多聚甲醛，待測。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 一般狀況觀察 大鼠的精神狀態(tài)、皮毛狀況、活動情況、體質(zhì)量變化。

1.5.2 SA-β-gal表達(dá)檢測 腎組織冰凍切片中加入適當(dāng)體積的SA-β-gal染色固定液，以充分蓋住組織為宜，室溫固定15 min；用1×磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Saline,PBS)浸泡洗滌腎組織3次，每次5 min；吸除PBS，組織切片上加入適當(dāng)量的染色工作液；37 ℃孵育過夜；封片，4 ℃保存，光鏡下觀察并拍照。應(yīng)用Image-pro-pius圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析。每張切片隨機(jī)選取3個視野檢測積分光密度(Intergal Optical Density，IOD)取均值進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.5.3 組織病理學(xué)觀察

1.5.3.1 蘇木精-伊紅(Hematoxylin Eosin，HE)染色 采用HE染色法對大鼠腎組織進(jìn)行病理學(xué)觀察。石蠟切片脫蠟至水；浸于蘇木精缸中90 s；流水沖洗10 min；浸于1%鹽酸乙醇中分化3 s；流水沖洗5 min；浸于伊紅缸中2 min，蒸餾水中泡去多余染色，中性樹膠封片，光鏡下觀察并拍照。

1.5.3.2 Masson染色 采用Masson染色法對大鼠腎組織進(jìn)行病理學(xué)觀察。石蠟切片脫蠟至水；40 ℃溫?zé)崴床Ｆ?次，60 s/次，蒸餾水濕潤玻片30 s；R1核染液染色30 s，倒掉，沖洗液沖洗30 s；R2漿染液染色30 s，倒掉，沖洗液沖洗30 s；R3分色液分色8 min，棄去分色液；R4復(fù)染液復(fù)染5 min，倒掉，無水乙醇沖洗干凈；中性樹膠封片，光鏡下觀察并拍照。

1.5.4 24 h尿蛋白含量檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗法檢測各組大鼠24 h尿蛋白含量。將大鼠尿液與標(biāo)本稀釋液作1∶100稀釋，配制標(biāo)準(zhǔn)品液，用雙蒸水1∶20稀釋；每孔各添加100 μL標(biāo)準(zhǔn)品液，充分混勻反應(yīng)板，37 ℃靜置30 min，洗板；每孔加酶標(biāo)抗體工作液100 μL，37 ℃靜置30 min，洗板；每孔加入底物工作液100 μL，置37 ℃暗處反應(yīng)15 min；每孔加入100 μL終止液混勻，30 min內(nèi)用酶標(biāo)儀在450 nm處測吸光度。

1.5.5 腎組織FN表達(dá)檢測 采用免疫組織化學(xué)法檢測各組大鼠腎組織FN表達(dá)，烤片，依次置于二甲苯、梯度乙醇、0.01 mol/LPBS、3%過氧化氫溶液，正常山羊血清封閉液，室溫下孵育，添加一抗，4 ℃孵育過夜，加二抗，DAB顯色液，浸于蘇木精中復(fù)染、梯度乙醇、二甲苯、中性樹膠封片，待鏡下觀察。應(yīng)用Image-pro-pius圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析。每張切片隨機(jī)選取3個視野檢測IOD，取均值進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.5.6 腎組織TGF-β1mRNA表達(dá)檢測 腎組織研磨，裂解，檢測總RNA濃度和純度。引物設(shè)計參照Gene Bank數(shù)據(jù)庫中各目的基因的序列，引物由ABI公司的Primer Express Software v2.0設(shè)計，由華大基因公司合成。見表1。ABI ViiA 7 Real Time PCR System進(jìn)行Real-time Quantitative PCR圖像和數(shù)據(jù)采集，基因表達(dá)倍數(shù)采用2-△△Ct進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

表1 基因引物信息

2 結(jié)果

2.1 溫和灸對自然衰老大鼠一般情況的影響 36周齡對照組大鼠活動敏捷，毛色潔白，反應(yīng)靈敏，飲食飲水無異常。自然衰老組大鼠隨著月齡的增長，活動欠靈活，毛發(fā)逐漸枯黃，精神不振，飲食飲水量減少。艾灸足三里組大鼠活動較靈活，毛發(fā)潤澤，色澤微黃，精力尚可，飲食飲水無異常，日?；顒泳胁煌潭雀纳?。

2.2 各組大鼠腎組織SA-β-gal染色比較 鏡下觀察，大鼠腎組織各層內(nèi)均可看到SA-β-gal陽性表達(dá)。36周齡對照組腎組織中陽性表達(dá)染色較淡，出現(xiàn)陰性或弱陽性反應(yīng)；自然衰老組腎組織中藍(lán)染面積較大，染色較深；艾灸足三里組腎組織中陽性表達(dá)較衰老組弱，藍(lán)染面積小，染色普遍偏淡。與36周齡對照組比較，自然衰老組、艾灸足三里組腎組織中SA-β-gal陽性表達(dá)顯著增加(P<0.05)；與自然衰老組比較，艾灸足三里組腎組織中SA-β-gal陽性表達(dá)顯著降低(P<0.05)。結(jié)果提示：80周齡自然衰老大鼠出現(xiàn)明顯的腎臟組織衰老，艾灸足三里穴可以改善腎臟衰老。見圖1、表2。

表2 各組大鼠腎組織中SA-β-gal陽性表達(dá)

圖1 各組大鼠腎組織SA-β-gal陽性表達(dá)(SA-β-gal染色，×200)

2.3 溫和灸對自然衰老腎組織病理學(xué)的影響

2.3.1 各組大鼠腎組織HE染色 36周齡對照組腎小球呈圓形或橢圓形，外周規(guī)整，分布密集，壁層上皮分布均勻，腎小球囊腔狹小，腎小管管腔規(guī)整；自然衰老組腎小球明顯膨大，可見積液，腎小球系膜細(xì)胞細(xì)胞密度增高，腎小球囊腔明顯擴(kuò)大，腎間質(zhì)出現(xiàn)少量炎細(xì)胞浸潤；艾灸足三里組腎小球輕度膨大，腎小球系膜細(xì)胞細(xì)胞密度輕度增高。見圖2。

圖2 大鼠腎臟組織病理學(xué)觀察(HE染色，×200)

2.3.2 各組大鼠腎組織Masson染色 膠原纖維染色呈藍(lán)色，36周齡對照組大鼠未見明顯膠原陽性染色；自然衰老組腎間質(zhì)中可見大量藍(lán)色膠原纖維；艾灸足三里組僅見血管周圍少許膠原組織。見圖3。

圖3 大鼠腎臟組織Masson染色(Masson染色，×200)

腎組織HE染色結(jié)果提示：自然衰老大鼠腎組織結(jié)構(gòu)損傷，腎間質(zhì)出現(xiàn)纖維化。艾灸足三里穴組能夠減輕自然衰老大鼠腎組織病理學(xué)改變，改善腎纖維化狀態(tài)。

2.4 溫和灸對自然衰老大鼠24 h尿蛋白含量影響 與36周齡對照組比較，自然衰老組、艾灸足三里組24 h尿蛋白含量明顯增加(P<0.05)；與自然衰老組比較，艾灸足三里組24 h尿蛋白含量明顯降低(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠24 h尿蛋白含量比較[M(P25,P75)，mmol/L，n=10]

2.5 溫和灸對自然衰老大鼠腎組織FN表達(dá)的影響 FN陽性表達(dá)染色呈棕黃色，在腎組織各層內(nèi)均可看到FN表達(dá)。36周齡對照組腎組織中FN陽性表達(dá)主要分布在腎小球系膜內(nèi)，染色較淡，呈陰性或弱陽性反應(yīng)；自然衰老組腎組織中FN表達(dá)較36周齡對照組增多，呈陽性反應(yīng)；艾灸足三里組腎組織中FN蛋白陽性呈弱陽性反應(yīng)，表達(dá)較衰老組明顯減弱。與36周齡對照組比較，自然衰老組、艾灸足三里組腎組織FN表達(dá)均顯著增加(P<0.01)；與自然衰老組比較，艾灸足三里組腎組織FN表達(dá)顯著降低(P<0.01)。見圖4，表4。

圖4 各組大鼠腎組織中FN表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色，×200)

表4 各組大鼠腎組織中FN表達(dá)

2.6 溫和灸對自然衰老大鼠腎組織中TGF-β1mRNA水平的影響 與36周齡對照組比較，自然衰老組、艾灸足三里組腎組織中TGF-β1mRNA表達(dá)明顯增加(P<0.05)；與自然衰老組比較，艾灸足三里組腎組織中TGF-β1mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.05)。見表5。

表5 各組大鼠腎組織中TGF-β1 mRNA表達(dá)[M(P25,P75)，n=10]

3 討論

器官衰老是指個體生命進(jìn)程中，因體內(nèi)、體外因素引發(fā)的器官組成細(xì)胞的丟失和細(xì)胞外基質(zhì)聚集，導(dǎo)致器官整體功能下降、對損傷因素易感性增強和應(yīng)激反應(yīng)能力的下降[8]。隨著年齡的增長，腎臟的宏觀和微觀結(jié)構(gòu)均會相應(yīng)地發(fā)生變化。在微觀結(jié)構(gòu)水平上，腎臟的衰老主要表現(xiàn)在出現(xiàn)腎間質(zhì)纖維化、腎小球硬化、基底膜增厚、腎小管萎縮和動脈硬化等病變[9]。本研究采用的自然衰老大鼠模型是抗衰老研究的理想動物模型，它能較精確且完整地反映機(jī)體衰老狀態(tài)，符合人類衰老的特點。SA-β-gal是衰老研究的經(jīng)典指標(biāo)，表達(dá)SA-β-gal被認(rèn)為是衰老細(xì)胞的特異性的標(biāo)志?；诖四Ｐ?，我們以經(jīng)典的SA-β-gal作為腎臟衰老的生物學(xué)指標(biāo)，觀察36周齡(青年)大鼠和80周齡(老年)大鼠腎組織SA-β-gal的表達(dá)，鏡下發(fā)現(xiàn)，在大鼠腎組織各層內(nèi)均可看到SA-β-gal表達(dá)，36周齡對照組大鼠腎組織中陽性表達(dá)染色較淡，呈陰性或弱陽性反應(yīng)；自然衰老組大鼠腎組織中藍(lán)染面積較大，染色較深，提示80周齡組大鼠已經(jīng)出現(xiàn)了明顯的腎臟衰老表型。HE染色顯示，36周齡對照組大鼠腎小球呈圓形或橢圓形，外周規(guī)整，分布密集，壁層上皮分布均勻，腎小球囊腔狹小，腎小管管腔規(guī)整；自然衰老組大鼠腎小球明顯膨大，可見積液，腎小球系膜細(xì)胞細(xì)胞密度增高，腎小球囊腔明顯擴(kuò)大，腎間質(zhì)出現(xiàn)少量炎癥細(xì)胞浸潤。Masson染色鏡下觀察結(jié)果顯示，36周齡對照組大鼠腎組織未見明顯膠原纖維增生改變；自然衰老組腎間質(zhì)中可見大量藍(lán)色膠原纖維。2組大鼠腎組織病理染色及纖維化染色表現(xiàn)符合腎臟衰老的病理改變及既往研究[10-11]。隨著年齡增長，腎臟功能隨之改變，腎臟衰老與腎損傷之間存在線性關(guān)系。本實驗研究結(jié)果顯示，與36周齡對照組比較，自然衰老組大鼠24 h尿蛋白水平升高，提示衰老大鼠發(fā)生增齡性腎功能減退和腎纖維化病理學(xué)改變。

腎纖維化是腎臟衰老過程中的重要病理變化，是導(dǎo)致增齡性腎功能減退的主要原因[12-13]。FN是一種重要的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，具有結(jié)合纖維蛋白原和膠原的能力，在正常情況下呈現(xiàn)低表達(dá)，在病理狀態(tài)下表達(dá)增多，其改變主要反映腎組織細(xì)胞外基質(zhì)的變化。同時，F(xiàn)N是腎纖維化的效應(yīng)因子，在纖維化的早期即可形成并廣泛沉積，是反映腎纖維化的直觀指標(biāo)之一[14-15]。轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)，屬于轉(zhuǎn)化生長因子超家族的多功能細(xì)胞因子，包括3個不同的哺乳動物同工型(TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3)。TGF-β1在腎臟的表達(dá)最多，活性最強。已證實，TGF-β1是一種強效的致纖維化因子[16]，也是腎小管上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的重要的誘導(dǎo)劑，在腎纖維化時表達(dá)增加，是目前抗纖維化治療的主要靶標(biāo)。本研究中，我們采用免疫組織化學(xué)法、實時定量PCR法分別檢測腎組織中FN表達(dá)、TGF-β1mRNA表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與青年對照組大鼠比較，自然衰老組大鼠的腎間質(zhì)中可見大量藍(lán)色膠原纖維，腎組織中FN表達(dá)增加，TGF-β1基因轉(zhuǎn)錄增強，TGF-β1mRNA表達(dá)增加。有報道，無論是原癌基因、應(yīng)激誘導(dǎo)衰老以及復(fù)制性衰老的人成纖維細(xì)胞中都發(fā)現(xiàn)TGF-β1分泌增加[17-18]，衰老大鼠腎組織中也發(fā)現(xiàn)TGF-β1升高[19]。我們推測衰老過程中FN、TGF-β1分泌增多是衰老相關(guān)腎纖維化及腎功能減退的潛在原因。

艾灸療法用于延緩衰老歷史悠久，古今醫(yī)家均證實了艾灸延緩衰老的有效性?！夺樉恼嫠琛吩唬骸叭镳B(yǎng)后天之氣，灸三里可使元氣不衰，故稱長壽之灸。”有研究對溫針灸關(guān)元、足三里穴延緩衰老的作用進(jìn)行觀察，結(jié)果顯示，溫針灸提高老年人血液的超氧化物歧化酶含量，具有明確的抗衰老作用[20]。廖運新等[21]為120例老年患者施灸，發(fā)現(xiàn)老年患者免疫功能得到明顯加強，各衰老指標(biāo)與灸前比較有顯著性差異。大鼠的動物實驗結(jié)果也支持了溫和灸干預(yù)衰老的有效性[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，溫和灸足三里穴有效降低模型大鼠腎組織衰老標(biāo)志物SA-β-gal的表達(dá)，改善腎臟衰老。我們進(jìn)一步從腎組織結(jié)構(gòu)和功能觀察艾灸對腎臟衰老的影響，HE染色和Masson染色結(jié)果提示，溫和灸足三里穴改善了自然衰老大鼠的腎小球結(jié)構(gòu)，減輕腎組織炎癥，明顯抑制了腎間質(zhì)纖維化。研究結(jié)果顯示，溫和灸足三里穴降低了衰老大鼠24 h尿蛋白含量，提示溫和灸足三里穴改善大鼠增齡性腎損傷。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，溫和灸足三里穴有效降低了衰老大鼠腎組織FN表達(dá)。實時定量PCR結(jié)果顯示，溫和灸足三里穴有效降低了衰老大鼠腎組織TGF-β1mRNA表達(dá)，提示抑制FN表達(dá)、TGF-β1基因轉(zhuǎn)錄可能是溫和灸足三里穴發(fā)揮保護(hù)腎臟的作用機(jī)制之一。

中醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為衰老是人體各項功能整體性下降的過程，這一過程可以理解為虛證，臟腑虛損是機(jī)體增齡性變化中的核心部分，不僅是衰老的特征表現(xiàn)，也是衰老的重要原因。五臟虛損日久則因虛致實，產(chǎn)生痰、瘀等病理產(chǎn)物，以致虛實夾雜，加速機(jī)體衰老。盡管各種老年慢性疾病的表現(xiàn)各異，但均以其器官衰老及功能減退作為疾病發(fā)生的生物學(xué)基礎(chǔ)。因此，研究器官衰老及保護(hù)衰老器官功能是減少老年慢性疾病發(fā)生的前提條件。足三里穴是足陽明胃經(jīng)之合穴，胃之下合穴，具有調(diào)理脾胃，補中益氣的作用?！毒霸廊珪吩疲骸拔笧樗戎?，得后天之氣也，人之始生，本乎精血之原，人之既生，由于水谷之養(yǎng)，非精血無以立形體之基，非水谷無以成形體之壯?！笨梢姲淖闳镅ㄊ茄泳徦ダ系闹匾侄沃?。

本實驗聚焦器官衰老角度探討艾灸延緩衰老的可能機(jī)制，發(fā)現(xiàn)溫和灸足三里穴能夠改善自然衰老大鼠腎結(jié)構(gòu)和減輕腎損傷，抑制腎組織FN表達(dá)、TGF-β1基因轉(zhuǎn)錄，延緩腎臟衰老，實驗結(jié)果為艾灸延緩腎臟衰老的機(jī)制研究提供了初步證據(jù)。