燧心膠囊對心力衰竭大鼠心肌纖維化的保護作用

郭丹丹 于思明 李佳卓 許文婷 董柏涵

(黑龍江中醫(yī)藥大學，哈爾濱，150040)

心力衰竭(Heart Failure，HF)是心血管疾病的終末期表現(xiàn)和最主要的死因，幾乎所有HF患者都有左心室迅速惡化的風險，但其具體機制尚不清楚[1]。研究表明，心肌纖維化參與了HF的進展，HF患者的左心室(Left Ventricular，LV)發(fā)現(xiàn)了心肌膠原纖維的顯著積累[2]。因此，闡明心肌纖維化的機制，尋找抗心肌纖維化的藥物對HF的治療具有重要意義。燧心膠囊為黑龍江中醫(yī)藥大學國家級名老中醫(yī)李延教授經(jīng)驗方，由真武湯與陳士鐸“引火湯”化裁而來，具有提高LV射血分數(shù)，改善HF患者的臨床癥狀的功效[3]。研究發(fā)現(xiàn)，心肌細胞凋亡在HF中發(fā)揮重要作用[4]。AMP活化蛋白激酶(AMP-activated Protein Kinase，AMPK)是細胞能量的感受器和代謝穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)器，其激活對改善線粒體生物發(fā)生有重要作用[5]。此外，心臟AMPK活性降低被認為會增強心臟對果糖脂肪喂養(yǎng)大鼠缺血再灌注損傷的程度[6]。最近的研究表明，AMPK可以通過刺激核轉(zhuǎn)錄因子紅系2相關因子(Nuclear Factor-erythroid 2-related Factor 2，Nrf2)依賴地血紅素加氧酶-1(Heme Oxygenase-1，HO-1)的上調(diào)來抑制氧化應激，并且在哺乳動物心肌能量代謝方面發(fā)揮著重要作用[7]。本研究建立了大鼠HF模型，探討燧心膠囊對HF大鼠心肌纖維化的保護作用及其潛在信號機制，特別關注了AMPK/Nrf2信號，為燧心膠囊治療HF提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 清潔級雄性SD大鼠180～200只，體質(zhì)量(200±20)g，購自黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(黑)2016-004，在黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心按無特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級操作規(guī)程適應性喂養(yǎng)1周后進行實驗。本研究符合國家醫(yī)學倫理相關規(guī)定。

1.1.2 藥物 燧心膠囊由紅參、制附子、熟地黃、麥冬、五味子、丹參、茯苓、白術(shù)、澤瀉組成，為黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院自制藥，掉膠囊皮，用蒸餾水溶解后進行2次煎煮(30 min/次)，合并水煎液后進行濃縮，進行醇沉，將醇沉物用蒸餾水進行溶解，配成生藥量為5.2 g/mL的溶液，分裝滅菌，4 ℃冷藏備用；阿霉素(深圳萬樂藥業(yè)有限公司，國藥準字H44024359)；纈沙坦膠囊(湖南千金湘江藥業(yè)股份有限公司，國藥準字H20103521)。

1.1.3 試劑與儀器 Masson染液(上海碧云天生物技術(shù)研究所，批號：954264)；活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)、谷胱甘肽(Glutathione，GSH)和超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號：954612、631154、687912)；RIPA裂解緩沖液(上海生工生物工程有限公司，批號：20052342)；AMPK、Nrf2、HO-1、β-肌動蛋白和辣根過氧化物酶HRP標記山羊抗鼠IgG(美國Santa Cruz公司，美國，貨號：8457516、7538219、8124337、6434719)；VM7型便攜式彩色多普勒超聲診斷儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司，型號：VM7型)；ASP300S型組織脫水機和Leica RM2255型全自動輪轉(zhuǎn)切片機等病理配套設備(Leica公司，德國，型號：ASP300S型和Leica RM2255型)；光學顯微鏡(Nikon公司，日本，型號：ECLIPSE MA200型)；HBS-1096B型酶標儀(南京德鐵實驗設備有限公司，型號：HBS-1096B型)；BIO-RAD垂直電泳儀(BIO-RAD公司，美國，Mini-Protean型)；凝膠成像儀(UVP公司，美國，型號：GelCam 310型)。

1.2 方法

1.2.1 分組及造模 選60只成年雄性SD大鼠均分為對照組、模型組、燧心膠囊低劑量組、燧心膠囊中劑量組、燧心膠囊高劑量組和纈沙坦組。對照組大鼠腹腔注射生理鹽水(2 mL/kg)，其余各組大鼠腹腔注射阿霉素溶液(2 mg/kg)，1次/周，連續(xù)6周，以多普勒超聲顯示左室射血分數(shù)(Left Ventricular Ejection fraction，LVEF)≤45%為HF模型成功標志[8]。

1.2.2 給藥方法 造模成功后次日，燧心膠囊低、中、高劑量組依次灌胃給予燧心膠囊(1.3 mg/kg、2.6 mg/kg、5.2 mg/kg)[9]，纈沙坦組灌胃給予纈沙坦(13.35 mg/kg)[10]，1次/d，假手術(shù)組和模型對照組給予等量生理鹽水，各組連續(xù)給藥8周。

1.2.3 檢測指標與方法 心功能檢測：末次給藥1 h后，對大鼠進行麻醉后平臥位固定，將探頭置于胸骨左緣，取左室長軸最大直徑處，標記室間隔與左室后壁收縮末和舒張末心內(nèi)膜位置，采用VM7型便攜式彩色多普勒超聲診斷儀分別測量LVEF、左室縮短分數(shù)(Left Ventricular Fractional Shortening，LVFS)、左室收縮期末內(nèi)徑(Left Ventricular End-systolic Dimension，LVSD)、左室舒張末內(nèi)徑(Left Ventricular End-Diastolic Dimension，LVDD)，取5個心動周期求平均值。

大鼠心臟組織形態(tài)學檢查：做完心功能檢測后處死大鼠，分離心臟，沿左心室中部橫軸切取0.5 cm厚的心肌組織，進行甲醛溶液固定，剩余心臟組織進行凍存。固定的組織經(jīng)脫水，包埋、切片(4 μm)后進行Masson染色，用顯微鏡觀察心臟纖維化變化。

心臟組織中ROS、GSH和SOD水平檢測：稱取100 mg心臟組織，用預冷生理鹽水沖洗3次，按1 mL/100 mg的比例加入生理鹽水，制成勻漿，離心半徑10 cm離心10 min取上清，根據(jù)試劑盒說明書檢測心臟組織中ROS、GSH和SOD水平。

蛋白質(zhì)印跡法檢測心臟組織中AMPK、Nrf2和HO-1水平：稱取100 mg心臟組織，制成勻漿，加入1 mL RIPA裂解緩沖液，離心后取上清，進行電泳(30 μg/孔)、轉(zhuǎn)膜，孵育AMPK(1∶200)、Nrf2(1∶500)、HO-1(1∶400)和β-肌動蛋白(1∶1 000)抗體，過夜(4 ℃)，用IgG抗體(1∶10 000)在室溫下孵育(30 min)，顯色，采集圖像進行分析。

2 結(jié)果

2.1 燧心膠囊對HF大鼠心功能的影響 與對照組比較，模型組大鼠LVEF和LVFS水平降低、LVSD和LVEDD水平升高(P<0.05)，模型組大鼠造模成功；與模型組比較，各燧心膠囊組和纈沙坦組大鼠LVEF和LVFS水平增高，LVSD和LVEDD水平降低，各燧心膠囊組大鼠LVEF、LVFS、LVSD和LVEDD水平隨燧心膠囊劑量增加而變化，但纈沙坦組作用最顯著(P<0.05)。見表1。

表1 燧心膠囊對HF大鼠心功能的影響

2.2 燧心膠囊對HF大鼠心肌纖維化的影響 在Masson染色中，心肌細胞染色為暗紅色，膠原蛋白被染色為藍色；對照組大鼠心肌細胞排列整齊、結(jié)構(gòu)清晰；模型組組大鼠心肌細胞排列不規(guī)則、細胞肥大、細胞間出現(xiàn)大量的纖維組織；各燧心膠囊劑量組和纈沙坦組大鼠心肌細胞排列尚整齊，細胞輕度肥大，伴有不同程度的纖維組織增生，較模型組明顯減輕，其中纈沙坦組大鼠改善最為顯著。見圖1。

圖1 燧心膠囊對HF大鼠心肌纖維化的影響(Masson染色，×400)

2.3 燧心膠囊對HF大鼠心臟組織中ROS、GSH和SOD水平的影響 與對照組比較，模型組大鼠ROS水平升高，GSH和SOD水平降低(P<0.05)；與模型組比較，各燧心膠囊組和纈沙坦組大鼠ROS水平降低，GSH和SOD水平升高，各燧心膠囊組大鼠ROS、GSH和SOD水平隨燧心膠囊劑量增加而變化，但纈沙坦組作用最顯著(P<0.05)。見表2。

表2 燧心膠囊對HF大鼠心臟組織中ROS、GSH和SOD水平的影響

2.4 燧心膠囊對HF大鼠心臟組織中AMPK、Nrf2和HO-1水平的影響 與對照組比較，模型組大鼠AMPK、Nrf2和HO-1水平降低(P<0.05)；與模型組比較，各燧心膠囊組和纈沙坦組大鼠AMPK、Nrf2和HO-1水平升高，各燧心膠囊組大鼠AMPK、Nrf2和HO-1水平隨燧心膠囊劑量增加而變化，但纈沙坦組作用最顯著(P<0.05)。見表3。

表3 燧心膠囊對HF大鼠心臟組織中AMPK、Nrf2和HO-1水平的影響

圖2 燧心膠囊對HF大鼠心臟組織中AMPK、Nrf2和HO-1水平的影響

3 討論

現(xiàn)代中醫(yī)認為HF的病機主要是本虛標實，其中本虛以心氣虛、心腎陽虛為主。溫陽法是HF的常用治法，中醫(yī)學的“引火歸元”理論具有較重要的指導意義，引火歸元在溫振心陽的同時，增強了腎臟對上炎之火的收納，使君火相火上下相濟，從而達到溫陽而不礙邪的理想狀態(tài)[11]。燧心膠囊以溫腎助陽、引火歸元、化氣行水為治則。方中以制附子為君，既補心火，又助腎陽；紅參大補元氣，復脈固脫，益氣安神；熟地黃補腎水，麥冬滋肺陰，金水相生，水火既濟，各安本位。再以茯苓、白術(shù)、澤瀉導水趨下，使“妄火”隨之下行，歸于腎水；又佐以丹參活血養(yǎng)血，化瘀通絡，祛除痰濁、瘀血等病理產(chǎn)物，且能調(diào)暢氣機，從而達到“陰平陽秘”的平衡狀態(tài)[12]。本研究結(jié)果顯示，燧心膠囊能改善HF大鼠心功能，證實了上述中醫(yī)理論。纖維化可能在舒張功能障礙和收縮泵功能方面發(fā)揮重要作用，是致死性心律失常的結(jié)構(gòu)基質(zhì)之一，從而在HF的進展和猝死中發(fā)揮重要作用[13]。研究證明，心肌纖維化的減少與高血壓患者接受不同抗高血壓藥物(如纈沙坦)長期治療時左室功能參數(shù)的改善有關[14]。本研究結(jié)果顯示，纈沙坦能抑制減少HF大鼠心肌纖維化的產(chǎn)生，燧心膠囊也有類似作用，雖然其作用不如纈沙坦，但纈沙坦只能維持HF的穩(wěn)態(tài)。因此，研究燧心膠囊治療HF具有重要意義。

HF可導致心肌組織氧化應激和能量代謝紊亂，誘導線粒體功能障礙，增加ROS的產(chǎn)生，進而導致心肌氧化應激損傷，凋亡或壞死[15]。ROS的生理濃度對于維持基礎細胞的活動至關重要，但過量產(chǎn)生的ROS可導致氧化應激的誘導。阿霉素會導致氧化應激和心臟結(jié)構(gòu)改變，最終導致心肌損害。阿霉素增加了心臟組織對ROS的敏感性，同時降低抗氧化劑如谷胱甘肽過氧化物酶、GSH和SOD活性[16]。具有抗氧化活性的各種天然產(chǎn)物已被證明可恢復HF大鼠中這些抗氧化劑的功能。燧心膠囊的配方中有多種物質(zhì)具有抗氧化活性，在心肌梗死引起的心肌損傷過程中發(fā)揮心臟保護作用，降低丙二醛含量和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶的表達，并增強SOD活性，從而抵抗氧化應激[17]。本研究結(jié)果顯示，燧心膠囊組能降低HF大鼠心臟中ROS水平，同時增加GSH和SOD水平，發(fā)揮一定的抗氧化活性。此外，燧心膠囊通過激活AMPK/Nrf2通路，發(fā)揮抗纖維化作用。然而，目前尚無直接的研究表明心肌系統(tǒng)中AMPK/Nrf2通路參與HF大鼠心肌纖維化調(diào)控，這正是本研究的創(chuàng)新性。

AMPK/Nrf2通路是一條公認的氧化應激途徑。AMPK刺激上調(diào)了線粒體的生物發(fā)生，增加ATP生成，從而調(diào)節(jié)細胞能量含量，這對于抑制阿霉素引發(fā)的氧化應激是必要的。AMPK抑制加重了壓力超載誘導的阿霉素喂養(yǎng)大鼠左心室肥厚[18]。在果糖飲食誘導的2型糖尿病中，氧化應激會觸發(fā)AMPK磷酸化，從而刺激Nrf2及其下游抗氧化酶(包括HO-1)，給予AMPK抑制劑可抑制AMPK磷酸化，而且可以降低糖尿病心肌中Nrf2和HO-1的表達[19]。此外，AMPK刺激通過調(diào)節(jié)線粒體貯存和Nrf2通路，對產(chǎn)前應激誘發(fā)的認知缺陷的神經(jīng)保護作用[20]。Nrf2也被認為與炎癥小體的刺激有關，通過誘導線粒體生物發(fā)生，Nrf2的激活保護心肌細胞免受阿霉素誘導的心肌病[21]。同時，Nrf2會激活HO-1信號來保持復合體Ⅰ，復合體Ⅳ活性和線粒體膜電位，從而減少腦缺血再灌注引起的線粒體氧化損傷[22]。此外，Nrf2還通過抑制炎癥介質(zhì)的轉(zhuǎn)錄來阻斷炎癥反應，核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體3炎癥小體的激活需要通過抑制Nrf2表達，本研究將在后續(xù)的研究中進行完善[23]。

綜上所述，燧心膠囊可通過降低心臟氧化應激水平及激活AMPK/Nrf2通路，抑制HF大鼠心肌纖維化，為燧心膠囊治療HF纖維化提供了理論依據(jù)。