鴨坦布蘇病毒感染對occludin和claudin－1基因mRNA表達(dá)的影響

逯璐，蘇興海，馬世寶，張琳

(1.山東管理學(xué)院新興業(yè)態(tài)發(fā)展研究所，山東 濟(jì)南 250357；2.招遠(yuǎn)市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，山東 招遠(yuǎn) 265400；3.德州市陵城區(qū)畜牧獸醫(yī)服務(wù)中心，山東 德州 253599；4.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/山東省畜禽疫病防治與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250100)

鴨坦布蘇病毒(Duck Tembusu virus，DTMUV)是引起蛋鴨產(chǎn)蛋率驟降、肉鴨和育成鴨死亡的主要病原之一，給養(yǎng)鴨業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1，2]。以該病毒為病原的鴨坦布蘇病毒病于2010年流行于我國東南沿海，近年來已成為水禽養(yǎng)殖業(yè)常見且頻繁流行的疫病之一，也是必須監(jiān)測和防控的疫病之一[3]。目前對于該病的預(yù)防主要依靠商品化疫苗，但疫病仍頻繁出現(xiàn)，且呈地方性流行趨勢，表明DTMUV已在不同區(qū)域定殖并在不同選擇壓力下突變產(chǎn)生地方流行株[4]。鑒于病毒突變的加速和相應(yīng)疫苗研發(fā)的滯后，對DTMUV的感染與致病機(jī)制進(jìn)行深入研究，從中挖掘更為有效的抗病毒策略成為該病毒的研究重點(diǎn)。

緊密連接(tight junctions，TJ)是一種膜內(nèi)多蛋白復(fù)合體，廣泛存在于上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞間，是封閉細(xì)胞間隙維持上皮屏障功能、調(diào)控細(xì)胞通透性控制內(nèi)外物質(zhì)進(jìn)出的重要成分[5，6]。緊密連接蛋白主要由咬合蛋白(occludin)、閉合蛋白(claudins)、閉合小環(huán)蛋白(zonula occludens，ZOs)和連接黏附分子(junctional adhesion molecules，JAMs)組成，它們與細(xì)胞骨架蛋白將相鄰細(xì)胞連接起來構(gòu)成上皮屏障，以阻擋病原微生物的入侵，維持生理環(huán)境的穩(wěn)定[7]。但TJ蛋白也能夠被病毒“劫持”，成為感染細(xì)胞的“利器”。已有多篇報(bào)道顯示，病毒能夠使用TJ蛋白作為細(xì)胞受體感染靶細(xì)胞:occludin、claudin－1是丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)入 侵 細(xì) 胞 的 共 受體[8，9]，而claudin－6和claudin－9不僅是該病毒的共受體，而且能夠介導(dǎo)病毒在細(xì)胞間的傳播[10，11]。claudin－1是登革熱病毒(Dengue virus，DENV)進(jìn)入細(xì)胞的關(guān)鍵分子[12]；occludin是西尼羅河病毒(West Nile virus，WNV)突破血腦屏障引起神經(jīng)癥狀的關(guān)鍵蛋白[13]。此外，claudin家族蛋白還是日本乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)[14]、人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)[15，16]等病毒感染與擴(kuò)散的重要分子。

DTMUV所在的黃病毒屬病毒具有高度相似的結(jié)構(gòu)組成，入侵細(xì)胞也采用類似的策略[17，18]，但功能性受體至今未能明確。HCV為黃病毒科丙肝病毒屬病毒，其細(xì)胞受體已明確，而與DTMUV進(jìn)化關(guān)系最為密切的DENV、WNV、JEV同為黃病毒屬病毒，但功能性受體始終未能鑒定出來。occludin或claudin－1在上述病毒侵入細(xì)胞與擴(kuò)散環(huán)節(jié)均起到了重要作用，但在DTMUV感染細(xì)胞過程中扮演怎樣的角色尚不清楚。本試驗(yàn)利用DTMUV感染非洲綠猴腎(vero)細(xì)胞，采用熒光定量方法對occludin和claudin－1基因mRNA的表達(dá)量進(jìn)行檢測和比較，以有助于明確兩蛋白分子在介導(dǎo)DTMUV入侵細(xì)胞中的作用，為后續(xù)功能受體的篩選、入侵機(jī)制以及抗病毒制劑的研究與開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

DTMUV(TCID50為10－6.5/0.1 mL)由山東省畜禽疫病防治與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保存，非洲綠猴腎(vero)細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。微量總RNA(病毒/細(xì)胞)提取試劑盒購自北京百邁客生物科技有限公司。One Step TB Green PrimeScript PLUS RT－PCR Kit(Perfect Real Time)、TB GreenPremix Ex Taq(Tli RNaseH Plus)熒光定量PCR試劑盒、M－MLV反轉(zhuǎn)錄酶購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)分組 試驗(yàn)開展時(shí)間為2021年6—12月。分別設(shè)置試驗(yàn)組和對照組，每組5瓶(25 cm2方瓶)細(xì)胞，置于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。待24 h細(xì)胞長成單層后，試驗(yàn)組加入100TCID50的病毒液1 mL，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1 h，期間每30 min輕晃混勻一次，對照組以營養(yǎng)液替代病毒液進(jìn)行相同操作。棄去細(xì)胞瓶中的液體，并用預(yù)冷的PBS輕輕洗2次，去除未吸附病毒。隨后在每個(gè)細(xì)胞瓶中加入9 mL含2%血清的MEM培養(yǎng)基，繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，分別于12、24、48、72 h收集試驗(yàn)組和對照組細(xì)胞及其上清，進(jìn)行病毒載量和緊密連接蛋白相關(guān)基因表達(dá)量的熒光定量檢測。

1.2.2 熒光定量PCR引物的設(shè)計(jì)與合成 病毒載量的測定采用絕對熒光定量PCR方法，緊密連接蛋白相關(guān)基因表達(dá)量的檢測使用相對定量的方式?；驍U(kuò)增引物經(jīng)oligo 6.0設(shè)計(jì)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，序列見表1。

表1 熒光定量PCR引物

1.2.3 RNA的提取和cDNA的合成 采用微量總RNA(病毒/細(xì)胞)提取試劑盒分別提取細(xì)胞與培養(yǎng)液上清總RNA，RNA樣品經(jīng)DNaseⅠ消化后，使用隨機(jī)引物和M－MLV反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行cDNA鏈的合成。RNA與cDNA產(chǎn)物置于－80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 熒光定量PCR 測定DTMUV含量的絕對熒光定量PCR體系參照李海燕等[19]的方法。occludin、claudin－1和β－actin的引物首先進(jìn)行特異性和有效性驗(yàn)證，表達(dá)量的檢測反應(yīng)總體系(20 μL):2×SYBRPremix Ex TaqⅡ10 μL，cDNA模板1 μL，上下游引物各1 μL(10 μmol/L)，雙蒸水補(bǔ)足20 μL。反應(yīng)條件:95℃1 min；95℃15 s，63℃25 s，72℃30 s，共40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)收集熒光信號；95℃5 s，60℃1 min，進(jìn)行溶解曲線分析。所有樣品的檢測均設(shè)置3個(gè)重復(fù)。為了證實(shí)擴(kuò)增序列的準(zhǔn)確性，將PCR產(chǎn)物純化后連接pMD18－T，并進(jìn)行測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有基因檢測均重復(fù)3次，取平均值。病毒含量根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算獲得，兩緊密連接基因相對表達(dá)量用2－△△Ct法計(jì)算，β－actin為內(nèi)參，結(jié)果以變化倍數(shù)進(jìn)行表示。應(yīng)用GraphPad Prism 5的student’st－test分析原始數(shù)據(jù)，并進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 occludin和claudin－1熒光定量引物的驗(yàn)證

利用反轉(zhuǎn)錄cDNA進(jìn)行新設(shè)計(jì)熒光定量引物的驗(yàn)證。結(jié)果如圖1所示，引物可以有效擴(kuò)增目的基因，溶解曲線單一，表明引物的有效性和特異性良好，可以滿足定量檢測occludin、claudin－1和β－actinmRNA的要求。同時(shí)，回收擴(kuò)增片段經(jīng)測序和比對證實(shí)了片段的準(zhǔn)確性。

圖1 occludin(A)、claudin－1(B)和β－actin(C)熒光定量PCR的擴(kuò)增及溶解曲線

2.2 vero細(xì)胞中的病毒含量

以100TCID50的DTMUV感染vero細(xì)胞，60 h左右細(xì)胞開始出現(xiàn)病變，而對照細(xì)胞正常。對感染后細(xì)胞上清中的病毒含量進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)病毒可在細(xì)胞中有效復(fù)制，并在48 h達(dá)到峰值，之后開始緩慢下降，而對照組始終未檢測到病毒(圖2)。

圖2 細(xì)胞中的病毒含量

2.3 occludin基因的表達(dá)量

與對照組相比，occludin基因的表達(dá)量先上調(diào)后下調(diào)，12 h為表達(dá)峰值，而后逐漸降低，72 h僅為對照組的59%(圖3)。

圖3 occludin基因的表達(dá)量

2.4 claudin－1基因的表達(dá)量

與對照組相比，claudin－1基因的表達(dá)量也呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(圖4)。在感染前期，claudin－1claudin－1的表達(dá)量上調(diào)，至24 h達(dá)到峰值，而后開始下降，至72 h表達(dá)量下調(diào)，為對照組的76%。

圖4 claudin－1基因的表達(dá)量

3 討論與結(jié)論

病毒侵入宿主細(xì)胞是整個(gè)復(fù)制周期的首要環(huán)節(jié)，而受體是介導(dǎo)病毒吸附、內(nèi)吞以及膜融合等侵入過程的關(guān)鍵宿主因子[20，21]，它決定了易感宿主的范圍、組織嗜性和致病性。所以，對受體的研究成為了解病毒入侵機(jī)制以及開發(fā)抗病毒制劑的突破口。

DTMUV具有較為廣泛的宿主范圍，除了感染鴨、鵝等水禽和雞、麻雀等其他禽類外[22，23]，也可以感染哺乳動(dòng)物[24]，亦有感染人類的報(bào)道，但并不表現(xiàn)出致病性[25]。病毒還具有廣泛的組織嗜性，除肝臟、脾臟、心臟等多臟器會(huì)發(fā)生較為明顯的病變外，還會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的生殖系統(tǒng)病癥和典型的神經(jīng)癥狀[26，27]。在病毒的體外培養(yǎng)時(shí)，DTMUV在多種來源的細(xì)胞和禽胚均可增殖[28]。這些現(xiàn)象表明，DTMUV的細(xì)胞受體應(yīng)該是多物種、多組織器官普遍存在且功能高度保守的蛋白分子。

前期通過細(xì)胞膜蛋白質(zhì)組的測定，發(fā)現(xiàn)了多種在DTMUV感染后表達(dá)量發(fā)生明顯變化的蛋白分子(結(jié)果另文發(fā)表)，occludin、claudin－1就是其中的兩個(gè)。兩者是緊密連接蛋白重要的組成部分，廣泛分布于各組織中，但含量存在差異，在免疫細(xì)胞豐富的組織中含量較少，而在免疫細(xì)胞較少的組織中含量較高，體現(xiàn)了它們在組織防御功能中的補(bǔ)償作用[6]。特別要指出的是，在正常情況下，緊密連接蛋白還是構(gòu)成血腦屏障的重要組分[29]。DTMUV感染病例多有神經(jīng)癥狀，病毒是如何突破血腦屏障的，一直未見報(bào)道。相關(guān)研究表明，在腦病發(fā)生時(shí)，occludin的表達(dá)量會(huì)發(fā)生顯著變化，已成為診斷腦病的重要生物指標(biāo)[29]。occludin是否也被DTMUV作為細(xì)胞受體利用或者起到利于傳播的作用以突破血腦屏障，在后續(xù)研究中需要進(jìn)行深入探討。

DENV－2感染人真皮微血管內(nèi)皮細(xì)胞后會(huì)激活整合素β3的上調(diào)表達(dá)，從而利于病毒的入胞[30]；感染的小腸上皮細(xì)胞和vero細(xì)胞中，隨著PEDV的復(fù)制，occludinmRNA的表達(dá)量顯著上調(diào)，兩者的結(jié)合及內(nèi)化是病毒進(jìn)入細(xì)胞的關(guān)鍵[31]，類似的結(jié)果也出現(xiàn)在PRRSV與感染細(xì)胞(Mark145)的claudin－4相互作用中[32]。在本試驗(yàn)中，DTMUV感染后的12～48 h，病毒含量明顯上升，而occludin和claudin－1也均為上調(diào)表達(dá)，表明病毒的感染激活了兩個(gè)基因的表達(dá)，提示在病毒感染細(xì)胞的過程中可能以受體或關(guān)鍵因子的身份參與了病毒入侵細(xì)胞的過程。而隨著病毒的進(jìn)一步增殖，72 h細(xì)胞已出現(xiàn)明顯病變，occludin和claudin－1mRNA的表達(dá)量變?yōu)橄抡{(diào)表達(dá)，這應(yīng)該與細(xì)胞發(fā)生損傷導(dǎo)致通透性改變以及隨病毒內(nèi)化的緊密連接蛋白被降解有關(guān)。至于兩分子與病毒粒子的結(jié)合機(jī)制及其在感染中的作用也是我們下一步的研究重點(diǎn)。