高山雁，胡 園，羅 勤，楊世忠，楊發(fā)龍

（1.四川省會(huì)東縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，四川 會(huì)東 615200；2.西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610041；3.四川省珙縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，四川 珙縣 644500；4.四川省涼山州畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究所，四川 西昌 615000）

1 發(fā)病情況

某山羊養(yǎng)殖場存欄黑山羊500 只左右，羊以放牧為主，補(bǔ)飼為輔。因放牧?xí)r天氣乍雨乍晴，陸續(xù)有周歲以下的山羊出現(xiàn)精神萎靡，眼角有膿性分泌物，咳嗽，流清亮鼻液的臨床癥狀。羊發(fā)病早期用替米考星治療，效果較好，但病情隨后出現(xiàn)反復(fù)，后期治療效果較差。

2 實(shí)驗(yàn)室診斷

2.1 病原PCR檢測 無菌采集病山羊的鼻腔拭子送檢，用酚-氯仿法提取樣本總DNA，用于綿羊肺炎支原體、多殺性巴氏桿菌、絲狀支原體以及溶血性曼氏桿菌等常見的引起山羊呼吸道疾病病原的PCR 檢測。本次PCR 擴(kuò)增鑒定引物參照文獻(xiàn)，引物信息見表1。

表1 各引物信息

病原的PCR 擴(kuò)增鑒定采用25 μL 反應(yīng)體系，即Premix Taq 酶12.5 μL，上、下游引物各1 μL，DNA 模板2 μL，去離子水8.5 μL。PCR 反應(yīng)條件為：95 ℃5 min；94 ℃30 s，54～60 ℃30 s，72 ℃30 s，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min 終止反應(yīng)。PCR反應(yīng)結(jié)束后，采用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，于凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。結(jié)果顯示溶血性曼氏桿菌、多殺性巴氏桿菌擴(kuò)增條帶與目的條帶大小一致，分別為207 bp和460 bp，其余擴(kuò)增結(jié)果均為陰性。

2.2 細(xì)菌分離鑒定

2.2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng) 無菌采集40 只病山羊的鼻腔拭子，劃線接種于20 個(gè)綿羊血瓊脂平板上，將血平板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h。結(jié)果平板上長出大小不一且有溶血環(huán)的光滑、濕潤、露珠樣的菌落，從每個(gè)平板上挑取疑似的單個(gè)菌落接種到含5%新生牛血清的TSA 固體培養(yǎng)基上進(jìn)行純化，對純化后的單個(gè)菌落進(jìn)行染色、鏡檢，結(jié)果見革蘭氏陰性短桿菌。無菌挑取單個(gè)菌落接于新的TSB液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃的空氣浴水平搖床（160 r/min）進(jìn)行增菌，培養(yǎng)8 h。

2.2.2 菌落PCR 鑒定 取增菌菌液，用酚-氯仿法提取細(xì)菌總DNA，以溶血性曼氏桿菌、多殺性巴氏桿菌特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示擴(kuò)增片段長度與預(yù)期片段長度相符。將鑒定后的菌液外送測序，采用DNAStar 軟件對測序結(jié)果進(jìn)行序列分析，通過網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫NCBI進(jìn)行比對，結(jié)果顯示所獲得的序列與NCBI 已公布的溶血性曼氏桿菌、多殺性巴氏桿菌序列的相似性為100%，表明所分離到的菌株為溶血性曼氏桿菌和多殺性巴氏桿菌。

3 診斷

綜合流行病學(xué)、臨床癥狀以及實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果，確診山羊的呼吸道疾病是由溶血性曼氏桿菌、多殺性巴氏桿菌混合感染引起的。

4 防治

4.1 疫苗免疫

4.1.1 疫苗制備 復(fù)蘇細(xì)菌：蘸取甘油保種菌液（純化得到的菌株）進(jìn)行平板劃線，培養(yǎng)18 h；增菌：將培養(yǎng)基上的單個(gè)菌落擴(kuò)增到含2 mL培養(yǎng)液的無菌離心管中；擴(kuò)大培養(yǎng)：根據(jù)所需菌液量擴(kuò)大培養(yǎng)細(xì)菌；甲醛滅活：按菌液容量加入0.2%的甲醛，滅活8 h。取100 μL增菌液進(jìn)行平板涂布，觀察是否滅活完全；乳化：量取等量的菌液與佐劑加入勻漿機(jī)中，勻漿15 min，然后倒入燒杯中，采用小風(fēng)扇繼續(xù)乳化30 min至乳白色，乳化完成后，制備液裝入無菌容器內(nèi)常溫放置過夜，疫苗即制作完成。

4.1.2 疫苗接種 經(jīng)無菌檢驗(yàn)后的疫苗低溫冷藏保存并運(yùn)至接種場，先接種4～5 只山羊，其無異常反應(yīng)后，再開展全群免疫，每只羊于頸部皮下注射3～5 mL。

4.2 藥物治療

4.2.1 藥敏試驗(yàn) 采用紙片擴(kuò)散法對分離純化的溶血性曼氏桿菌菌株和多殺性巴氏桿菌菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果判定按照美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（CLSI）指導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)，以“敏感、中介、耐藥”記錄結(jié)果，其結(jié)果見表2、表3。

表2 分離溶血性曼氏桿菌菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果

表3 分離多殺性巴氏桿菌菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果

4.2.2 藥物治療 根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果，選用氟苯尼考對病羊進(jìn)行治療（劑量和用法遵照說明書使用），同時(shí)加強(qiáng)羊的營養(yǎng)，注意通風(fēng)和消毒。

5 小結(jié)

溶血性曼氏桿菌和多殺性巴氏桿菌是革蘭氏陰性菌，是山羊、綿羊、牛等反芻動(dòng)物呼吸道的常在菌，當(dāng)遇環(huán)境驟變、運(yùn)輸不當(dāng)?shù)炔涣家蛩貢r(shí)，可引起發(fā)病。PCR 檢測技術(shù)具有快速、靈敏、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，能夠?qū)@兩種病菌感染作出確定診斷。

規(guī)?；s化養(yǎng)殖中，除關(guān)注羊群的疾病防控外，還要注意加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，特別在環(huán)境突然改變的情況下，要盡量避免羊只因抵抗力減弱而發(fā)病。