不同醋酸棉酚添加量對綿羊體外發(fā)酵參數(shù)的影響

李運杰， 關 鵬， 任建剛， 賈夢可， 錢文熙*

（1.塔里木大學動物科學學院，新疆 阿拉爾 843300；2.塔里木畜牧科技兵團重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300）

隨著我國畜牧業(yè)和飼料業(yè)的快速發(fā)展，蛋白飼料資源日益短缺（尹杰，2019），供求矛盾日益突出，價格也越來越高。棉籽粕飼料富含蛋白質，成本低廉，新疆擁有豐富的棉花資源，是我國乃至全世界最大的產棉區(qū)，資源量全球第一（朱曉芳，2020）。合理利用棉籽餅粕可為新疆地區(qū)生產發(fā)展提供有益幫助，但受多種因素制約，棉籽餅粕飼料綜合利用率極低，其中最主要的原因是棉籽餅粕中含有抗營養(yǎng)因子棉酚，影響動物生長和健康（毛林峰，2014）。呂云峰（2010）按飼料衛(wèi)生標準游離棉酚最大量1200 mg/kg為依據(jù)，對牛羊不同生長階段推薦了10%~20%不等的棉籽粕安全限量。因此，本試驗中棉酚添加量在0~1000 mg/kg。使用未脫毒的棉籽餅飼喂畜禽會導致畜禽中毒（朱曉春，2012），單胃動物棉酚中毒報道居多，少有反芻動物棉酚中毒報道，但長期飼喂棉副產品飼料也會導致中毒。

棉酚存在于棉籽中而各種加工方法都難以將其徹底清除。游離棉酚主要由活性醛基和活性羥基產生毒性而引起多種危害（Garry，2007），Chung（2000）研究結果表明，棉酚可以通過對膜基質和蛋白質分子的結合，以及通過負離子自由基機制對膜相結構的破壞和對電子傳遞體系的干擾，從多個方面干擾細胞的代謝，尤其是與鈣離子依賴性蛋白激酶有關的代謝的干擾最強。劉軍（2008）指出隨著棉酚濃度的提高，組氨酸、半骯氨酸以及甘氨酸能有效降低棉酚對乳酸脫氫酶的抑制作用。瘤胃對游離棉酚具有解毒能力，在瘤胃內，游離棉酚與可溶性蛋白結合形成結合棉酚。Radominska-Pandya（2010）認為，反芻動物對棉酚的脫毒主要依靠瘤胃微生物，其原理可能是通過游離棉酚與微生物所分泌的酶、氨基酸或活性蛋白中的游離氨基結合，將游離棉酚轉化為結合棉酚，從而達到脫毒效果。目前研究表明反芻動物對棉酚有一定耐受性，但能夠承受的棉酚最大添加量還未確定，本試驗通過體外產氣法研究不同棉酚添加量對綿羊瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響，并建議綿羊飼料中棉產品中的棉酚安全含量。

1 材料與方法

1.1 試驗動物飼養(yǎng)管理 選擇健康狀況良好、雌性、品種內體重差異不顯著的綿羊[3歲，（40±2.0）kg]3只單圈飼養(yǎng)，自由采食和自由飲水，每日8：00和20：00各飼喂一次。

1.2 日糧設計 按照等能等氮的原則配制基礎日糧，參考《動物營養(yǎng)參數(shù)與飼養(yǎng)》（張宏福，1998）中營養(yǎng)需要進行配方設計，具體日糧組成如表1所示。

表1 試驗日糧組成及營養(yǎng)水平（風干基礎）

1.3 試驗設計 試驗設6個處理組，分別為對照組、Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組和Ⅴ組，每組12個重復培養(yǎng)體系。棉酚，由北京邁瑞達科技有限公司提供，純度≥98%，占底物的添加含量分別為125、250、500、750 mg/kg和1000 mg/kg，對照組不添加棉酚，其他培養(yǎng)液和底物均相同，通過體外產氣測定綿羊體外發(fā)酵參數(shù)。

1.4 瘤胃液的獲取及人工瘤胃液的制備 瘤胃液采集：于晨飼前，通過瘺管取瘤胃上中下左右不同位點的瘤胃液，4層紗布過濾后放于提前預熱（39℃）的保溫壺中，迅速帶回實驗室。

人工瘤胃液制備：人工唾液根據(jù)MENKE（1988）等的方法制備。備齊所需培養(yǎng)液，并按1：2的比例向瘤胃液中加入提前通入二氧化碳并預熱的人工唾液均勻混合，此發(fā)酵過程培養(yǎng)及樣品持續(xù)通入二氧化碳處理。

1.5 體外發(fā)酵培養(yǎng)及樣品的處理 精確稱取標準棉酚0.0050 g，用1%醋酸的無水乙醇溶液溶解并定容至100 mL容量瓶，即得到0.05 mg/mL的醋酸棉酚溶液。精確稱取發(fā)酵底物0.2000 g于注射器底部，將0.5 mL醋酸棉酚加入注射器底部的0.2000 g發(fā)酵底物上即得到125 mg/kg棉酚含量的發(fā)酵底物，250 mg/kg組添加1 mL、500 mg/kg組添加2 mL、750 mg/kg組添加3 mL、1000 mg/kg組添加4 mL醋酸棉酚溶液，對照組不添加醋酸棉酚，每組12個重復。注射芯在插入注射器前在其表面均勻涂抹凡士林，并小心插入注射器，注射器頂部套上三通閥。將配制完的人工瘤胃液吸至注射器內，此過程持續(xù)通入二氧化碳，每支30 mL，關閉注射器三通閥閥門，置于39℃恒溫水浴搖床中振蕩發(fā)酵，記錄不同發(fā)酵時間點的產氣量，48 h發(fā)酵后的發(fā)酵液立即進行pH測定，隨后將發(fā)酵液3500 r/min離心10 min。取發(fā)酵液上清液于40 mL離心管-20℃保存，用于測定氨態(tài)氮和揮發(fā)性脂肪酸濃度。

1.6 測定指標 產氣量：讀取注射器上的刻度測定不同時間點（3、6、12、24、48 h）的產氣量。

瘤胃pH：取樣之后，立即利用pH計（FE22）快速測定pH。

氨態(tài)氮濃度：根據(jù)馮宗慈（2010）的比色法測定氨態(tài)氮含量。

揮發(fā)性脂肪酸測定：取出10 mL發(fā)酵液，10000 r/min離心15 min，取上清液1 mL，加入0.2 mL 25%偏磷酸溶液，用渦旋振蕩器混合均勻，再以10000 r/min離心15 min，過0.22 μL微孔膜參照曹慶云等（2006）方法測定揮發(fā)性脂肪酸。

48 h干物質降解率和蛋白降解率：將48 h發(fā)酵后注射器中的殘渣倒入尼龍袋，按照《動物營養(yǎng)與飼料科學實踐教程》（錢文熙，2012）測定日糧干物質含量和蛋白質含量并根據(jù)公式計算降解率：

干物質降解率/%=（B－C）/B×100；

式中：B為待測樣品中干物質的含量，%；C為待測樣品尼龍袋殘渣中干物質含量，%。

1.7 統(tǒng)計分析 用Excel對數(shù)據(jù)進行初步整理，SPSS 17.0處理軟件中單因素方差分析進行顯著性檢驗，LSD法多重比較其差異性，試驗數(shù)據(jù)用“平均值±標準差”表示。P＜0.05為差異顯著，P＞0.05為差異不顯著。

2 結果

2.1 不同棉酚添加量對綿羊瘤胃產氣量的影響由表2可見，隨發(fā)酵時間的增長，各組的產氣量逐漸增加，隨棉酚添加量的增加各時間點的產氣量逐漸下降，第Ⅰ組各時間點的產氣量均低于對照組差異不顯著（P＞0.05），第Ⅱ組、第Ⅲ組、第Ⅳ組和第Ⅴ組各時間點產氣量均低于對照組差異顯著（P＜0.05），即超過250 mg/kg棉酚添加量的發(fā)酵組產氣量顯著低于未添加棉酚的發(fā)酵組（P＜0.05），48 h時第Ⅱ組產氣量比對照組降低了24.46%。

表2 不同棉酚添加量對綿羊產氣量的影響

2.2 不同棉酚添加量對綿羊瘤胃pH的影響由表3可見，隨棉酚添加量的增加，各發(fā)酵組瘤胃液在48 h時的pH呈下降趨勢。對照組的pH最高與第Ⅰ組差異不顯著（P＞0.05），第Ⅱ組、第Ⅲ組、第Ⅳ組和第Ⅴ組的pH顯著低于對照組（P＜0.05），第Ⅱ組pH比對照組降低了0.62%。第Ⅱ組pH低于第Ⅰ組差異不顯著（P＞0.05），第Ⅲ組pH顯著低于第Ⅱ組（P＜0.05），第Ⅳ組pH低于第Ⅲ組差異不顯著（P＞0.05），第Ⅴ組pH低于第Ⅳ組差異不顯著（P＞0.05）。

表3 不同棉酚添加量對綿羊瘤胃pH的影響

2.3 不同棉酚添加量對綿羊瘤胃48 h干物質降解率的影響 由表4可見，隨棉酚添加量的增加，各發(fā)酵組的48 h干物質降解率逐漸減少，對照組48 h干物質降解率最高，第Ⅰ組48 h干物質降解率低于對照組差異不顯著（P＞0.05），第Ⅱ組、第Ⅲ組、第Ⅳ組和第Ⅴ組48 h干物質降解率呈下降趨勢，且均低于對照組差異顯著（P＜0.05），第Ⅱ組48 h干物質降解低于第Ⅰ組差異顯著（P＜0.05）降低了7.07%，第Ⅲ組48 h干物質降解率低于第Ⅱ組差異不顯著（P＞0.05），第Ⅳ組48 h干物質降解低于第Ⅲ組差異顯著（P＜0.05），第Ⅴ組48 h干物質降解低于第Ⅳ組差異顯著（P＜0.05）。

表4 不同棉酚添加量對綿羊瘤胃48 h干物質降解率的影響

2.4 不同棉酚添加量對綿羊粗蛋白降解率的影響 由表5可見，隨棉酚添加量的增加，各發(fā)酵組的蛋白質干物質降解率逐漸減少，對照組粗蛋白質降解率最高，第Ⅰ組粗蛋白質降解率低于對照組差異不顯著（P＞0.05），第Ⅱ組、第Ⅲ組、第Ⅳ組和第Ⅴ組粗蛋白質降解率呈下降趨勢均低于對照組差異顯著（P＜0.05），第Ⅱ組粗蛋白質降解率比對照組降低了3.85%，第Ⅱ組粗蛋白質降解率低于第Ⅰ組差異不顯著（P＞0.05），第Ⅲ組粗蛋白質降解率低于第Ⅱ組差異不顯著（P＞0.05），第Ⅳ組粗蛋白質降解率低于第Ⅲ組差異顯著（P＜0.05），第Ⅴ組粗蛋白質降解率低于第Ⅳ組差異不顯著（P＞0.05）。

表5 不同棉酚添加量對綿羊粗蛋白質降解率的影響

2.5 不同棉酚添加量對綿羊瘤胃氨態(tài)氮的影響由表6可見，隨棉酚添加量的增加，各發(fā)酵組的氨態(tài)氮含量呈上升趨勢，對照組的氨態(tài)氮含量低于第Ⅰ組差異不顯著（P＞0.05），第Ⅱ組、第Ⅲ組、第Ⅳ組和第Ⅴ組氨態(tài)氮含量呈上升趨勢均高于對照組差異顯著（P＜0.05），第Ⅱ組氨態(tài)氮含量比對照組升高了13.73%，第Ⅱ組氨態(tài)氮含量顯著高于第Ⅰ組（P＜0.05），第Ⅲ組氨態(tài)氮含量高于第Ⅱ組差異不顯著（P＞0.05），第Ⅳ組氨態(tài)氮含量顯著高于第Ⅲ組（P＜0.05），第Ⅴ組氨態(tài)氮含量顯著高于第Ⅳ組（P＜0.05）。

表6 不同棉酚添加量對綿羊瘤胃氨態(tài)氮的影響

2.6 不同棉酚添加量對綿羊瘤胃揮發(fā)性脂肪酸的影響 由表7可見，隨棉酚含量的增加，各發(fā)酵組的乙酸、丙酸、丁酸、乙酸比丙酸和總揮發(fā)性脂肪酸含量均呈下降趨勢。對照組的乙酸、丙酸、丁酸和總揮發(fā)性脂肪酸含量均最高，均與第Ⅰ組差異不顯著（P＞0.05），第Ⅱ組、第Ⅲ組、第Ⅳ組和第Ⅴ組的乙酸、丁酸和總揮發(fā)性脂肪酸含量呈下降趨勢，與對照組差異顯著（P＜0.05）。第Ⅱ組的乙酸、丁酸和總揮發(fā)性脂肪酸含量比對照組分別降低了16.19%、11.60%、20.84%。第Ⅱ組乙酸含量低于第Ⅰ組差異不顯著（P＞0.05），第Ⅲ組、第Ⅳ組和第Ⅴ組乙酸含量差異不顯著（P＞0.05）。第Ⅱ組丙酸含量低于第Ⅰ組和對照組差異不顯著（P＞0.05），第Ⅲ組、第Ⅳ組和第Ⅴ組的丙酸含量呈下降趨勢，與對照組差異顯著（P＜0.05），第Ⅲ組丙酸含量比對照組降低了16.64%，第Ⅲ組丙酸含量顯著低于第Ⅱ組（P＜0.05），第Ⅳ組丙酸含量顯著低于第Ⅲ組（P＜0.05），第Ⅴ組丙酸含量低于第Ⅳ組差異不顯著（P＞0.05）。第Ⅱ組丁酸含量低于第Ⅰ組差異不顯著（P＞0.05），第Ⅲ組丁酸含量顯著低于第Ⅱ組（P＜0.05），第Ⅳ組丁酸含量低于第Ⅲ組差異不顯著（P＞0.05），第Ⅴ組丁酸含量低于第Ⅳ組差異不顯著（P＞0.05）。對照組乙酸比丙酸含量最高，顯著高于其他組（P＜0.05），第Ⅰ組、第Ⅱ組和第Ⅲ組乙酸比丙酸含量差異不顯著（P＞0.05），第Ⅳ組乙酸比丙酸含量顯著低于第Ⅲ組（P＜0.05），第Ⅴ組乙酸比丙酸含量低于第Ⅳ組差異不顯著（P＞0.05）。第Ⅱ組總揮發(fā)性脂肪酸含量顯著低于第Ⅰ組（P＜0.05），第Ⅲ組總揮發(fā)性脂肪酸含量低于第Ⅱ組差異不顯著（P＞0.05），第Ⅳ組總揮發(fā)性脂肪酸含量低于第Ⅲ組差異不顯著（P＞0.05），第Ⅴ組總揮發(fā)性脂肪酸含量低于第Ⅳ組差異不顯著（P＞0.05）。

表7 不同棉酚添加量對綿羊瘤胃揮發(fā)性脂肪酸的影響 mmol/L

3 討論

3.1 不同棉酚添加量對綿羊瘤胃產氣量的影響瘤胃微生物可消耗飼料中的碳水化合物和粗蛋白質，產生二氧化碳、甲烷、氫氣和低級脂肪酸等，當產氣量越高，表明瘤胃微生物活性越高（雷冬至，2009）。產氣量反映了瘤胃微生物的生長情況和飼料底物的降解程度，可發(fā)酵的營養(yǎng)物質越多微生物活性越強，產氣量越大（徐子萱，2021）。本試驗中，各發(fā)酵組的產氣量隨著時間的增加而增加，添加棉酚組的產氣量均低于對照組，且隨棉酚添加量的增多產氣量呈下降趨勢，添加250 mg/kg顯著低于對照組，說明當棉酚添加量超過250 mg/kg時對綿羊瘤胃微生物產生影響，降低了微生物活性。王彩蝶（2019）研究發(fā)現(xiàn)，用棉酚含量為361 mg/kg和722 mg/kg的飼料飼養(yǎng)綿羊時，瘤胃液中的原蟲數(shù)量逐漸降低，棉酚添加量的增加使原蟲數(shù)量下降，抑制了瘤胃發(fā)酵，使產氣量呈下降趨勢。

3.2 不同棉酚添加量對綿羊瘤胃pH的影響瘤胃pH是評價瘤胃發(fā)酵的綜合指標（馮帆，2020），反芻動物通過唾液分泌合成、吸收和排出瘤胃內揮發(fā)性脂肪酸和有機酸，反映了瘤胃微生物代謝產物的酸堿平衡狀況（馮帆，2019）。瘤胃液的正常pH在5.5~7.5，過酸或過堿不利于瘤胃微生物發(fā)酵（郝建祥，2011）。本試驗各發(fā)酵組48 h發(fā)酵后的pH均在正常范圍內，說明緩沖液配制合理達到了穩(wěn)定發(fā)酵環(huán)境的條件。本試驗發(fā)酵48 h時對照組與添加250、500 mg/kg和750 mg/kg棉酚組的pH差異不顯著，添加1000 mg/kg棉酚組與對照組差異顯著。王海榮（2012）研究表明添加0、50、100 mg/kg和500 mg/kg棉酚對綿羊體外發(fā)酵48 h時的pH影響不顯著，本試驗結果與其一致。

3.3 不同棉酚添加量對綿羊瘤胃氨態(tài)氮和揮發(fā)性脂肪酸的影響 氨態(tài)氮是瘤胃氮代謝過程中外源蛋白質和內源含氮物質降解的重要產物，同時也是瘤胃微生物合成菌體蛋白的原料（王志敬，2017）。氨態(tài)氮含量越高說明合成的蛋白質越多。本試驗中隨棉酚添加量的增加瘤胃氨態(tài)氮含量呈下降趨勢，瘤胃氨態(tài)氮濃度主要受瘤胃微生物合成蛋白的影響（孫國強，2013）。侯彩云（2012）研究表明添加棉酚發(fā)酵后瘤胃氨態(tài)氮含量高于未添加棉酚發(fā)酵組，本試驗結果與其一致。Mena（2011）認為游離棉酚與瘤胃中的游離氨基酸結合。隨游離棉酚含量的增加生成的結合蛋白增多，可能使瘤胃中的氨氮含量增多從而增加了氨態(tài)氮含量。飼料中的碳水化合物通過瘤胃微生物的代謝作用最終形成揮發(fā)性脂肪酸，揮發(fā)性脂肪酸的產量可顯著影響反芻動物對營養(yǎng)物質的吸收、利用和生產能力的發(fā)揮（張華，2018）。本試驗隨棉酚添加量的增加乙酸、丙酸和丁酸含量呈下降趨勢，250 mg/kg棉酚添加組顯著低于對照組，與產氣量的變化規(guī)律一致，進一步說明棉酚添加量超過250 mg/kg時，對瘤胃發(fā)酵有抑制作用。

3.4 不同棉酚添加量對綿羊干物質降解率和粗蛋白質降解率的影響 干物質降解率可反映反芻動物機體對飼料的消化能力，是評價不同飼料飼用價值高低的重要指標，越高說明瘤胃微生物活性越強、發(fā)酵效果越好（Zhang，2016）。導致粗蛋白質降解率差異的主要是飼料本身的蛋白質降解性和飼料中蛋白質結構、來源等因素的影響（Devant，2001）。張力莉（2014）通過體外產氣法研究游離棉酚對瘤胃發(fā)酵的影響表明，隨棉酚添加量的增加，干物質降解率呈下降趨勢，本試驗結果與其一致。干物質降解率和粗蛋白降解率是都是隨棉酚添加量的增加呈下降趨勢，通過上述結果表明，棉酚添加量超過250 mg/kg時飼料不易消化吸收，降低了反芻動物對粗蛋白質的利用。

4 結論

本試驗結果表明：（1）隨棉酚添加量的增加，產氣量、pH、干物質降解率、蛋白質降解率和揮發(fā)性脂肪酸含量均呈現(xiàn)下降趨勢，氨態(tài)氮呈現(xiàn)上升趨勢。（2）125 mg/kg的棉酚添加量對瘤胃發(fā)酵無顯著影響，超過250 mg/kg的棉酚添加量后對瘤胃發(fā)酵有抑制作用，因此建議綿羊飼料中棉產品中的棉酚含量不超過250 mg/kg。