戴 琴，高 威，史婷婷，陳姝含，王攀攀,2，賴曉芳,2，高 煥,2,3，閻斌倫,2

( 1.江蘇海洋大學(xué)，江蘇省海洋生物資源與生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實驗室，江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實驗室，江蘇 連云港，222005； 2.江蘇省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源保護(hù)與利用平臺，江蘇 南京 210014； 3.江蘇省海洋生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 連云港 222005 )

細(xì)胞周期蛋白(CCN)廣泛存在于從高等動物到酵母的各種生物中，因其在整個細(xì)胞周期中均表現(xiàn)出循環(huán)表達(dá)模式而得名[1]。在果蠅中，目前已發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期蛋白家族中包含A、B、C、D、E、G、H、J、K、L、T、Y這12類成員[2]。細(xì)胞周期蛋白與細(xì)胞周期蛋白依賴性絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(CDKs)結(jié)合，驅(qū)動細(xì)胞周期進(jìn)程[3]。除此之外，細(xì)胞周期蛋白及其CDK伴侶還具有許多功能，包括蛋白水解降解、程序性細(xì)胞死亡、DNA損傷修復(fù)、新陳代謝、干細(xì)胞自我更新和生精等[4]。細(xì)胞周期蛋白C(CCNC)是細(xì)胞周期蛋白家族中保守類蛋白，在人和酵母中的氨基酸序列的一致性達(dá)到了28%[5]。CCNC發(fā)現(xiàn)得較晚，與早先發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞周期蛋白不同，隨著細(xì)胞周期的進(jìn)行，CCNC在mRNA和蛋白質(zhì)層面上的濃度變化并不明顯，在G1期出現(xiàn)1個寬峰[5]。CCNC與CDK3結(jié)合，對細(xì)胞由G0期進(jìn)入G1期起關(guān)鍵調(diào)控作用[6]；除調(diào)控細(xì)胞周期，CCNC還可以與CDK8結(jié)合，調(diào)節(jié)RNA聚合酶Ⅱ的活性從而調(diào)控轉(zhuǎn)錄[7]。此外，CCNC還被發(fā)現(xiàn)在線粒體中有新型信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，氧化應(yīng)激后，CCNC被釋放到細(xì)胞質(zhì)中，指導(dǎo)線粒體片段化和細(xì)胞凋亡[8-9]。目前，CCNC基因在應(yīng)用層面的研究主要集中在醫(yī)療領(lǐng)域，CCNC被確定為潛在的抗癌靶標(biāo)候選物[10]，該基因的表達(dá)還可能與細(xì)胞分裂增殖有關(guān)，可加快細(xì)胞的增殖，加速創(chuàng)傷面的快速愈合[11]。

脊尾白蝦(Exopalaemoncarinicauda)具有生長較快、繁殖周期短、抗逆性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，養(yǎng)殖前景可期。然而，目前脊尾白蝦親蝦主要來源于海捕或池塘自繁，苗種的質(zhì)量和數(shù)量難以保障，嚴(yán)重制約規(guī)?；鏪12]。細(xì)胞周期蛋白家族基因與甲殼類性腺發(fā)育、幼體發(fā)育方面密切相關(guān)，但有關(guān)CCNC基因的研究較少[12]。筆者擬克隆脊尾白蝦CCNC(EcCCNC)基因cDNA，分析其組織特異性及在卵巢發(fā)育及幼體發(fā)育各階段的表達(dá)特征，并通過原核表達(dá)獲得重組蛋白，以期為探索其在脊尾白蝦發(fā)育中的分子機(jī)制提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

脊尾白蝦來源于江蘇省贛榆區(qū)養(yǎng)殖池塘，自樣品中挑選體型均等、體色正常、健康活潑的脊尾白蝦[體長(5.39±0.51) cm、體質(zhì)量(1.24±0.32) g]，試驗前暫養(yǎng)1周，暫養(yǎng)期間連續(xù)充氣，養(yǎng)殖水循環(huán)流動，保持水溫(25±2) ℃，鹽度27，pH 8.1，每日早晚各投喂蝦類專用配合飼料1次，及時清除殘餌及糞便，記錄脊尾白蝦的生長情況。

1.2 試驗樣品的收集

1.2.1 脊尾白蝦組織樣品

挑選健康成年脊尾白蝦3尾，分別取其眼柄、胃、肝胰腺、心臟、鰓、腸道、肌肉、卵巢、腹索神經(jīng)共9個組織放入Trizol中勻漿并置于-80 ℃保存，用于抽提總RNA。

1.2.2 脊尾白蝦卵巢發(fā)育時期樣品

根據(jù)文獻(xiàn)[13]的分期方式，分別取3尾脊尾白蝦卵巢發(fā)育增殖期(Ⅰ期)、小生長期(Ⅱ期)、大生長期(Ⅲ期)、成熟期(Ⅳ期)及產(chǎn)后恢復(fù)期(Ⅴ期)的卵巢放入Trizol中勻漿并置于-80 ℃保存，用于抽提總RNA。

1.2.3 脊尾白蝦幼體發(fā)育時期樣品

根據(jù)文獻(xiàn)[14]的分期方式，分別取3尾發(fā)育處于溞狀幼體Ⅰ期、溞狀幼體Ⅱ期、溞狀幼體Ⅲ期、溞狀幼體Ⅳ期、溞狀幼體Ⅴ期和仔蝦期的脊尾白蝦幼體，整尾放入Trizol中勻漿，置于-80 ℃保存，以備抽提總RNA。

1.3 總RNA提取與cDNA第1鏈的合成

Trizol法(生工)提取不同組織RNA。1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA完整性，紫外分光光度計測定總RNA濃度。以1 μg總RNA為模板，根據(jù)PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒(TAKARA)合成第1鏈cDNA。

1.4 EcCCNC基因cDNA全長的克隆

自實驗室已建立的脊尾白蝦鎘脅迫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)EcCCNC基因核心序列，設(shè)計用于5′RACE 的EcCCNC-GSP1和用于3′RACE的EcCCNC-GSP2(表1)。按照SMARTTMRACE合成試劑盒(Clontech，USA)使用說明對EcCCNC的cDNA末端進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物克隆轉(zhuǎn)化后進(jìn)行測序。

表1 EcCCNC基因克隆及表達(dá)分析引物序列

1.5 EcCCNC基因的生物信息學(xué)分析

使用DNAMAN軟件對測序片段進(jìn)行比對拼接；使用美國國家生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫在線的ORF Finder工具和BLAST工具查找基因的開放閱讀框；序列的同源性分析使用BLAST工具；利用 Compute pI/Mw在線軟件(http://web. expasy.org/compute_pi/)計算理論等電點(diǎn)和分子質(zhì)量；蛋白結(jié)構(gòu)域的分析使用SMART工具；信號肽預(yù)測使用 SignalP 在線軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)；多重序列比對使用ClustalX 2.0；進(jìn)化樹分析使用 MEGA 6.0軟件。

1.6 EcCCNC基因不同組織表達(dá)水平分析

根據(jù)EcCCNC基因cDNA序列設(shè)計熒光定量引物(表1)，選取脊尾白蝦GAPDH作為內(nèi)參基因[15]。qRT-PCR試劑盒為ChamQ SYBR qPCR Master Mix試劑盒(諾唯贊)。每個反應(yīng)設(shè)置3個技術(shù)重復(fù)，反應(yīng)體系和PCR程序參照說明書。熒光定量PCR儀為Step One Plus(ABI)，使用2-ΔΔCt法分析定量結(jié)果[16]。

1.7 數(shù)據(jù)分析

使用Origin 9軟件進(jìn)行單因素方差分析，最小顯著差異法比較不同數(shù)據(jù)組間的差異，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

1.8 EcCCNC的原核表達(dá)

根據(jù)EcCCNC基因cDNA序列設(shè)計原核表達(dá)引物EcCCNC-Exp-F和EcCCNC-Exp-R(表1)，上、下游引物的5′端分別引入BamHⅠ、XhoⅠ酶切位點(diǎn)及其各自的保護(hù)堿基。用BamH Ⅰ和XhoⅠ快切酶對EcCCNC基因和pET32a質(zhì)粒分別進(jìn)行雙酶切后通過T4連接酶連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化并測序。將測序正確的EcCCNC-pET32a重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，在30 ℃、IPTG終濃度為0.5 mmol/L的條件下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。在誘導(dǎo)前、誘導(dǎo)5、12 h時分別取1 mL菌液，4 ℃，8000 r/min離心(離心半徑87 mm，Hettich MIKRO 220R)10 min收集菌體，用100 μL 磷酸緩沖鹽溶液重懸，加入等體積的2×蛋白上樣緩沖液煮沸10 min。處理后的菌液進(jìn)行SDS-PAGE，凝膠經(jīng)考馬斯亮藍(lán)R-250染色、脫色后觀察結(jié)果。同時進(jìn)行Western Blot驗證，一抗為抗His標(biāo)簽鼠單克隆抗體(康為世紀(jì))，抗體稀釋倍數(shù)2000；二抗為羊抗小鼠IgG-HRP(金克隆)，抗體稀釋倍數(shù)2000。用DAB顯色試劑盒(金克隆)進(jìn)行顯色。

2 結(jié) 果

2.1 EcCCNC基因cDNA全長序列分析

EcCCNC基因的cDNA序列見圖1，全長1042 bp，其中5′非編碼區(qū)82 bp，3′非編碼區(qū)156 bp，開放閱讀框為804 bp，編碼267個氨基酸，預(yù)測蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量為31.34 ku，理論等電點(diǎn)為5.50。EcCCNC蛋白結(jié)構(gòu)域的預(yù)測結(jié)果顯示，在該蛋白中有2個周期蛋白框，分別位于46～143 aa和166～236 aa。該蛋白不含信號肽。

圖1 EcCCNC基因的全長cDNA及預(yù)測的氨基酸序列Fig.1 Full-length cDNA sequence and deduced amino acid sequences of EcCCNC gene起始密碼子；終止密碼子； AATAA多聚腺苷酸加尾信號；下劃線部分表示周期蛋白框. stop codon; AATAA polyadenylation signal; the cyclin box is shown in the underlined part.

2.2 EcCCNC基因系統(tǒng)進(jìn)化分析

根據(jù)美國國家生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫中不同物種的CCNC基因編碼的氨基酸序列，用MEGA 6.0以鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖2)。由圖2可見，系統(tǒng)進(jìn)化樹主要分為兩大支，脊尾白蝦首先與凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)(GenBank登錄號：XP_027228000.1)聚為一支，再與同屬軟甲綱的三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)(MPC59249.1)、方鼻卷甲蟲(Armadillidiumnasatum)(KAB7502677.1)以及昆蟲綱的德國小蠊(Blattellagermanica)(PSN54776.1)、濕木白蟻(Zootermopsisnevadensis)(XP_021936056.1)等無脊椎動物聚為一支，人(Homosapiens)(AAC50825.1)、蘇門答臘猩猩(Pongoabelii)(NP_001244144.1)、熱帶爪蟾(Xenopustropicalis)(NP_989157.2)、歐洲鰻(Anguillaanguilla)(XP_035279305.1)、斑馬魚(Daniorerio)(NP_956245.1)等脊椎動物聚為另一大支。聚類分析結(jié)果表明，EcCCNC基因編碼的氨基酸序列與凡納濱對蝦的相似性(92%)最高。

圖2 EcCCNC和其他物種CCNC的氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 The phylogenetic tree of EcCCNC and CCNC of other organisms based on amino acid sequences

2.3 EcCCNC基因在不同組織中的表達(dá)

EcCCNC基因在脊尾白蝦不同組織間的表達(dá)特征見圖3，其在肌肉、鰓、心臟、眼柄、肝胰腺、腹索神經(jīng)、卵巢、胃這8種組織中均有表達(dá)，在卵巢中的表達(dá)量最高(P<0.01)，在鰓中的表達(dá)量次之，在腸道中未見表達(dá)。

圖3 EcCCNC基因在不同組織中的相對表達(dá)量Fig.3 Relative expression level of EcCCNC gene in various tissuesM.肌肉; G.鰓; H.心臟; E.眼柄; I.腸道; HE.肝胰腺; V:腹索神經(jīng); O.卵巢; S:胃；柱形圖上方不同字母表示各時期差異極顯著(P<0.01)，下同.M.muscle; G.gill; H.heart; E.eyestalk; I.intestine; HE.hepatopancreas; V.ventricular nerve; O.ovary; S.stomach; different letters above vertical bars indicate significant difference between different tissues (P<0.01), et sequentia.

2.4 EcCCNC基因在卵巢不同發(fā)育時期的表達(dá)

EcCCNC基因mRNA在卵巢不同發(fā)育時期的表達(dá)量呈先升后降的趨勢，在大生長期表達(dá)量達(dá)到最高(P<0.05)(圖4)。

圖4 EcCCNC基因在卵巢不同發(fā)育時期中的相對表達(dá)量Fig.4 The relative expression level of EcCCNC gene in ovary with different development stages Ⅰ.增殖期; Ⅱ.小生長期; Ⅲ.大生長期; Ⅳ.成熟期; Ⅴ.產(chǎn)后恢復(fù)期. Ⅰ.proliferation period; Ⅱ.protoplasm growth period; Ⅲ.egg yolk growth period; Ⅳ.mature period; Ⅴ.recovery from spawning period.

2.5 cCNCC基因在幼體不同發(fā)育時期的表達(dá)

EcCCNC基因mRNA在脊尾白蝦幼體發(fā)育各時期的相對表達(dá)量呈先升后降再升的趨勢，在溞狀幼體Ⅱ期的表達(dá)量最高，發(fā)育到Ⅲ期時表達(dá)水平回落到Ⅰ期且在余下的溞狀幼體期均維持在這個水平，變態(tài)發(fā)育至仔蝦時表達(dá)量再次升高(圖5)。

圖5 EcCCNC基因在幼體發(fā)育不同時期中的相對表達(dá)量Fig.5 The relative expression level of EcCCNC gene in different stages during larval developmentZ1.溞狀幼體Ⅰ期；Z2.溞狀幼體Ⅱ期；Z3.溞狀幼體Ⅲ期；Z4.溞狀幼體Ⅳ期；Z5.溞狀幼體Ⅴ期；P.仔蝦.Z1.zoea stage Ⅰ; Z2.zoea stage Ⅱ; Z3.zoea stage Ⅲ; Z4.zoea stage Ⅳ; Z5.zoea stage Ⅴ; P.postlarva.

2.6 EcCCNC基因的原核表達(dá)

將未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)、誘導(dǎo)5 h、誘導(dǎo)12 h后的菌液經(jīng)處理后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，凝膠經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色后，在誘導(dǎo)5 h、誘導(dǎo)12 h組45 ku處可見一條帶(圖6a)，該條帶與預(yù)測的重組蛋白分子質(zhì)量一致；而未誘導(dǎo)組未發(fā)現(xiàn)相應(yīng)條帶。用抗His標(biāo)簽鼠單抗與HRP偶聯(lián)的二抗進(jìn)行Western Blot驗證，結(jié)果表明該蛋白帶有His標(biāo)簽，進(jìn)而確認(rèn)為EcCCNC-pET32a重組蛋白(圖6b)。

圖6 EcCCNC-pET32a重組表達(dá)Fig.6 Recombinant expression of EcCCNC-pET32aa.EcCCNC-pET32a誘導(dǎo)表達(dá)的SDS-PAGE； b.EcCCNC-pET32a免疫印跡； M.預(yù)染蛋白Marker； W.未誘導(dǎo)組； 5 h、12 h分別代表誘導(dǎo)時間.a.SDS-PAGE analysis of recombinant expression of EcCCNC-pET32a; b. Western blot of EcCCNC-pET32a; M.pre-stained protein marker; W.non-induced; 5 h and 12 h represent the induced time.

3 討 論

3.1 EcCCNC基因cDNA序列

周期蛋白框是普遍存在于細(xì)胞周期蛋白分子中的一個保守結(jié)構(gòu)，其與CDKs結(jié)合并調(diào)節(jié)它們的酶活性[4]。筆者首次克隆出EcCCNC基因的cDNA全長。蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測顯示，EcCCNC含有兩個周期蛋白框，C末端周期蛋白框幫助蛋白正確折疊，N末端則與CDK3或CDK8結(jié)合，形成復(fù)合體。CCNC-CDK3復(fù)合體在調(diào)控細(xì)胞周期由G0期轉(zhuǎn)入G1期的進(jìn)程中發(fā)揮重要作用[6]；CCNC-CDK8復(fù)合體通過磷酸化RNA聚合酶Ⅱ的碳末端結(jié)構(gòu)域來促進(jìn)或抑制其酶活性，從而調(diào)控基因特異性轉(zhuǎn)錄[17-18]。通過進(jìn)化樹分析和多序列比對，發(fā)現(xiàn)EcCCNC氨基酸序列與凡納濱對蝦的聚為一支且具有92%的相似性，確定其為CCNC基因。

3.2 EcCCNC基因的時空特異性

EcCCNC基因轉(zhuǎn)錄本在卵巢中的表達(dá)極顯著高于其他組織，與斑節(jié)對蝦(Penaeusmonodon)中CCNC基因的表達(dá)特征一致[19]。CCNC作為細(xì)胞增殖活動中的重要因子，可以預(yù)見在卵巢這類細(xì)胞分裂旺盛的組織中的表達(dá)更高。雖然CCNC基因的報道較少，僅見上述斑節(jié)對蝦1例，但細(xì)胞周期蛋白家族其他成員在蝦蟹類中的組織表達(dá)譜也可以佐證這一觀點(diǎn)，如刀額新對蝦(Metapenaeusensis)中的CCNB基因[20]、三疣梭子蟹中的CCNH基因[21]、斑節(jié)對蝦[22-23]中的CCNT和CCNY基因等，均顯示出在卵巢中的相對表達(dá)量顯著高于其他組織的特征。進(jìn)一步的研究結(jié)果顯示，EcCCNC基因mRNA在卵巢發(fā)育的各個時期普遍表達(dá)，隨著卵巢發(fā)育成熟，呈先升后降的趨勢，在大生長期表達(dá)量達(dá)到最高。這可能是因為在大生長期時卵巢內(nèi)細(xì)胞分裂最為旺盛、代謝最為活躍，結(jié)合脊尾白蝦卵巢發(fā)育的組織學(xué)特征，卵巢處于大生長期時，外源性卵黃合成期卵母細(xì)胞占大部分，內(nèi)源性卵黃合成期卵母細(xì)胞則很少；到Ⅳ期卵巢中主要為成熟期卵母細(xì)胞，此時EcCCNC基因mRNA的表達(dá)量有所下降，外源性卵母細(xì)胞較少，內(nèi)源性卵母細(xì)胞徹底消失[12,24]。隨著卵巢發(fā)育不同階段主要細(xì)胞類型的變化，EcCCNC基因mRNA的表達(dá)量也有所漲落，推測其與脊尾白蝦的卵子發(fā)生和卵黃發(fā)生有關(guān)[25]。EcCCNC在脊尾白蝦幼體發(fā)育各時期的表達(dá)量呈先升后降再升的趨勢，在溞狀幼體Ⅱ期的表達(dá)量最高。脊尾白蝦溞狀幼體Ⅰ期，此時靠卵黃營養(yǎng)，并不攝食；進(jìn)入Ⅱ期后，頭胸甲內(nèi)仍殘留少量卵黃，但已開始攝食；進(jìn)入Ⅲ期后卵黃消耗殆盡，此時完全靠攝食提供營養(yǎng)[15]。由此推測，EcCCNC可能參與了脊尾白蝦幼體營養(yǎng)方式轉(zhuǎn)變的過程，在分子機(jī)制層面上，溞狀幼體Ⅱ期是否發(fā)生特殊事件仍待進(jìn)一步探究。以上研究結(jié)果表明，EcCCNC在脊尾白蝦卵巢發(fā)育和幼體發(fā)育過程中可能發(fā)揮了重要作用，這為脊尾白蝦分子輔助育種提供了思路。

3.3 EcCCNC蛋白的原核表達(dá)

筆者構(gòu)建了EcCCNC-pET32a重組表達(dá)載體，在大腸桿菌(Escherichiacoli)中表達(dá)后成功獲得了1個重組蛋白，經(jīng)驗證后確認(rèn)該重組蛋白就是EcCCNC基因的表達(dá)產(chǎn)物。該結(jié)果不僅驗證了筆者克隆獲得了EcCCNC基因，還表明該基因比較容易經(jīng)由重組表達(dá)載體進(jìn)行表達(dá)，這為進(jìn)一步制備該EcCCNC蛋白的抗體奠定了基礎(chǔ)。通過EcCCNC蛋白抗體的制備，探討該基因在脊尾白蝦卵巢及幼體發(fā)育中的時空表達(dá)特征還有待于今后深入研究。

4 結(jié) 論

筆者獲得了脊尾白蝦CCNC(EcCCNC)基因cDNA序列，其中開放閱讀框為804 bp，編碼267個氨基酸；蛋白結(jié)構(gòu)域分析EcCCNC含有2個高度保守的周期蛋白框。qRT-PCR結(jié)果表明：EcCCNC基因mRNA在脊尾白蝦卵巢中的相對表達(dá)量最高；在卵巢不同發(fā)育時期中，處于大生長期時表達(dá)量最高；在幼體不同發(fā)育時期中，溞狀幼體Ⅱ期時表達(dá)量最高。通過原核表達(dá)獲得了EcCCNC重組蛋白，為進(jìn)一步探索EcCCNC基因在脊尾白蝦發(fā)育中的生物學(xué)功能提供了材料保障。