劉偉 邊超 周楊 東麗

(內蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院 1.放射治療科；2.腫瘤內科，內蒙古 呼和浩特 010010)

結直腸癌是全球第三大常見惡性腫瘤，2018年診斷出約180萬新發(fā)病例，每年導致超過約5萬人死亡[1]。在這些病例中，近三分之一的腫瘤起源于大腸的遠端部分，即齒狀線和直腸-乙狀結腸交界處之間的直腸癌。目前結直腸癌，尤其是直腸癌的治療仍然具有挑戰(zhàn)性，缺乏分子靶向治療[2]。最近的研究表明，直腸癌的發(fā)病率仍然不斷上升，具有年輕化趨勢，生存率更差[3]。新輔助放療是縮小局部/晚期直腸癌體積和分期的首選方法[4]。研究表明腫瘤進展中差異表達的分子影響腫瘤細胞對放射治療的敏感性[5]。長鏈非編碼RNA 分化拮抗非蛋白質編碼RNA(Long noncoding RNA Differentiation antagonizing non-protein coding RNA, lncRNA DANCR)作為致癌基因促進包括增殖、侵襲、轉移和化學治療抗性等惡性生物學行為，正在成為惡性腫瘤治療的新靶點[6-7]。Lu等[8]報道DANCR 在結直腸癌組織和細胞系中表達升高，并與患者TNM分期增加和淋巴結轉移陽性顯著相關，DANCR過表達促進結直腸癌細胞增殖、遷移、侵襲和細胞周期進程，抑制細胞凋亡。同時Xiong等[9]發(fā)現(xiàn)DANCR的表達可以抑制多柔比星作用的腫瘤細胞凋亡，進而抑制結直腸癌細胞的惡性進展。本研究旨在探討DANCR是否在直腸癌放療抵抗中發(fā)揮重要作用，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本 選擇2012年1月～2015年3月在我院治療的直腸癌患者，入組要求：患者進行根治術前已進行新輔助放射治療；患者具有完整的病理分期和生存資料；手術標本包括癌組織和遠離癌組織3 cm的癌旁組織；患者及家屬均簽署知情同意書；具備放療前后的影像學資料，并根據CT掃描結果進行放療療效評定，根據實體瘤評價標準，放療抵抗為穩(wěn)定及疾病進展，放療敏感為完全緩解和部分緩解。所有患者均接受隨訪。最終收集90例直腸癌組織和配對的癌旁組織。本研究遵從赫爾辛基宣言進行，并獲得我院倫理委員會批準。

1.2 主要試劑材料 Trizol試劑購于日本TaKaRa公司；AMV One-step RT-PCR試劑盒，上海生物工程技術有限公司；DANCR和GAPDH引物，上海生工生物工程有限公司；直腸癌細胞系HT29購自美國ATCC細胞庫；胎牛血清、培養(yǎng)基和胰蛋白酶購自美國Gibco公司；MTS試劑購自美國Sigma公司；DANCR siRNA購自廣州奧博生物技術有限公司；吉姆薩染液和細胞周期檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物技術有限公司；RIPA蛋白裂解液和BCA檢測蛋白濃度試劑盒購自北京索萊寶試劑有限公司；PVDF膜購自美國millipore公司；ECL化學發(fā)光試劑盒購自上?；鄯f生物科技有限公司；cyclinD1、CDK4、CDK6和凋亡相關蛋白caspase 3、Bcl-2、Bax抗體購自英國Abcam公司。

1.3 qRT-PCR檢測 直腸癌組織和癌旁組織中加入Trizol試劑進行組織裂解，并采用氯仿提取RNA方法獲得總RNA。檢測RNA濃度及純度后采用one step RT-PCR 檢測試劑盒檢測DANCR的相對表達量。反應體系為10X One Step RT-PCR Buffer 5 μL、上游引物2 μL、下游引物2 μL、RNA 1 μg、Taq DNA polymerase 1 μL、AMV RT 0.5 μL、RNase inhibitor 0.5 μL、無RNA酶的雙蒸水補足50 μL。設置反應條件為：45℃逆轉錄30 min、94℃預變性5 min，94℃變性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸30 s，其中變性、退火和延伸進行40個循環(huán)，于7500PCR儀進行qRT-PCR擴增反應。按照2-ΔΔCt公式以GAPDH為內參計算DANCR的相對表達量。DANCR引物F：5′-GCCACAGGAGCTAGAGCAGT-3′，R：5′-GCAGAGTATTCAGGGTAAGGGT-3′；GAPDH引物F：5′-AACGGATTTGGTCGTATTGGG-3′，R：5′-CGCTCCTGGAAGATGGTGAT-3′。

1.4 細胞培養(yǎng)和HT29-R細胞的構建 于液氮取出直腸癌細胞系HT29后快速放入37℃水浴鍋中，細胞凍存液溶解后，于800 rpm離心3 min，棄掉細胞凍存液，采用含有10%胎牛血清的細胞培養(yǎng)基中重懸細胞，放置37℃、5%CO2的全濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)，及時更換新鮮培養(yǎng)基，并且采用胰酶消化進行細胞傳代。將生長狀態(tài)良好的HT29細胞進行放射線輻射，并進行分次遞增照射，首先1 Gy劑量的放射線輻射細胞，培養(yǎng)48 h后繼續(xù)輻射1次，然后2 Gy劑量輻射2次，4 Gy劑量輻射2次。將細胞克隆團胰酶消化后培養(yǎng)，最終細胞穩(wěn)定生長在4 Gy的輻射劑量中。

1.5 細胞轉染 取生長狀態(tài)較好的HT29-R細胞，以2×105個細胞接種至6孔板中，分為si-NC組和si-DANCR組，放置37℃、5%CO2的全濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。采用脂質體2000與siRNA混合后進行各組細胞的轉染，si-NC組轉染對照siRNA，si-DANCR組轉染DANCR siRNA，放置37℃、5%CO2的全濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后更換新鮮培養(yǎng)基。采用qRT-PCR 檢測各組細胞中DANCR的相對表達量。

1.6 MTS實驗檢測細胞增殖能力 取生長狀態(tài)較好的HT29細胞和HT29-R細胞，以3000個細胞接種至96孔板中，每組設置6個重復孔，放置37℃、5%CO2的全濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。分別采用0、1、2、4、8、16和32 Gy的放射劑量處理HT29細胞和HT29-R細胞。培養(yǎng)48 h后，每孔加入20 μL MTS試劑，繼續(xù)放置37℃、5%CO2的全濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，測得細胞490 nm處的吸光度(OD值)。細胞增殖率=(對應放射劑量組平均OD值/0組平均OD值)×100%。

1.7 平板克隆實驗檢測細胞克隆形成能力 取生長狀態(tài)較好的HT29-R細胞，以1000個細胞接種至6孔板中，分為si-NC組和si-DANCR組，每組設置3個重復孔，按上述轉染方法轉染各組細胞，并采用4 Gy放射劑量照射細胞，放置37℃、5%CO2的全濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)，及時更換細胞培養(yǎng)基。待細胞形成肉眼可見的克隆團時，終止細胞培養(yǎng)。PBS洗3次，加入甲醇溶液固定細胞10 min，棄掉甲醇，加入吉姆薩染液染色10 min，PBS洗3次后計數(shù)細胞克隆形成數(shù)目。

1.8 流式細胞儀檢測細胞周期 取生長狀態(tài)較好的HT29-R細胞，以2×105個細胞接種至6孔板中，分為si-NC組和si-DANCR組，每組設置3個重復孔，按上述轉染方法轉染各組細胞，并采用4 Gy放射劑量照射細胞，放置37℃、5%CO2的全濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。采用胰酶消化收集各組細胞，PBS洗3次后，加入細胞周期檢測緩沖液500 μL重懸細胞，同時加入碘化丙啶染色液(PI)25 μL和RNA酶10 μL，混勻后放置37℃中避光孵育30 min，采用流式細胞儀檢測各組細胞周期比率。

1.9 流式細胞儀檢測細胞凋亡 取生長狀態(tài)較好的HT29-R細胞，以2×105個細胞接種至6孔板中，分為si-NC組和si-DANCR組，每組設置3個重復孔，按上述轉染方法轉染各組細胞，并采用4 Gy放射劑量照射細胞，放置37℃、5%CO2的全濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。采用無EDTA的胰酶消化收集各組細胞，PBS洗3次后，加入細胞凋亡檢測染色緩沖液500 μL重懸細胞，加入Annexin V-FITC試劑5 μL和PI試劑5 μL，混勻后于常溫中避光孵育30 min，采用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。

1.10 Western blot檢測 胰酶消化收集待檢測的細胞，PBS洗3次后，加入RIPA蛋白裂解液，細胞完全裂解后于低溫高速離心去除細胞碎片，將蛋白上清液移至新的EP管中，并采用BCA試劑盒檢測各樣品蛋白濃度。蛋白經煮沸變性后進行凝膠電泳，采用10%的凝膠，蛋白樣品加入凝膠中，采用80 V進行樣品的蛋白分離。電泳完成后采用100 V濕轉進行PVDF膜蛋白轉移。蛋白膜經封閉液常溫孵育1 h、TBST洗3次后，與目的一抗(cyclinD1、CDK4、CDK6、caspase 3、Bcl-2、Bax)4℃孵育過夜，TBST洗3次后，與兔二抗或鼠二抗室溫孵育1 h，采用ECL試劑盒曝光蛋白條帶。

2 結果

2.1 qRT-PCR檢測DANCR在直腸癌組織中的表達及臨床意義 qRT-PCR檢測結果顯示，DANCR在直腸癌和癌旁組織中的表達水平分別為1.78±0.75和0.83±0.38；與癌旁組織相比，DANCR在直腸癌組織中的表達顯著上調(t=10.80，P<0.001)(圖1)。同時DANCR在TNM分期晚期和放療抵抗直腸癌組織中的表達分別高于其在TNM分期早期和放療敏感的直腸癌組織中的表達(P<0.05)，表明DANCR的表達與直腸癌患者TNM分期和放療抵抗性相關，見表1。

圖1 qRT-PCR檢測直腸癌組織中DANCR的表達

表1 DANCR表達與直腸癌患者臨床病理參數(shù)之間的關系

2.2 DANCR的表達對直腸癌患者預后影響 依據DANCR在直腸癌組織中的表達水平分為DANCR高表達組(n=52，>1.78)和DANCR低表達組(n=38，≤1.78)，采用Kaplan-Meier繪制生存曲線，LogRank分析顯示與DANCR低表達的直腸癌患者相比，DANCR高表達的直腸癌患者預后較差(P<0.05)，見圖2。

圖2 LogRank分析DANCR的表達對直腸癌患者預后影響

2.3 HT29-R細胞的構建 分次放射劑量遞增建立放射抵抗型細胞株HT29-R，qRT-PCR檢測結果顯示，DANCR在HT29細胞中的相對表達量為1.35±0.12，在HT29-R細胞中的相對表達量為3.97±0.20，與放射敏感性細胞HT29相比，DANCR在放射抵抗細胞HT29-R中的表達增加(t=19.46，P<0.001)(圖3)。采用不同放射劑量照射HT29和HT29-R細胞，MTS結果顯示在相同放射劑量照射下，HT29-R細胞的增殖率顯著高于HT29細胞的增殖率(P<0.05)，HT29-R細胞具有顯著放療抵抗性，見表2。

圖3 qRT-PCR檢測DANCR在HT29和HT29-R中的表達

2.4 DANCR siRNA的干擾效果 DANCR siRNA轉染HT29-R細胞，qRT-PCR檢測結果顯示，DAN-CR在si-NC組細胞中DANCR的表達量為0.99±0.04，在si-DANCR組細胞中的表達量為0.45±0.08，與si-NC組相比，si-DANCR組細胞中DANCR的表達降低(t=3.982,P=0.011)，見圖4。

表2 不同放射劑量對HT29和HT29-R細胞增殖率的影響

圖4 qRT-PCR檢測DANCR siRNA轉染HT29-R細胞的干擾效果

2.5 干擾DANCR對HT29-R細胞放療敏感性的影響 采用不同放射劑量照射si-NC組和si-DANCR組HT29-R細胞，MTS結果顯示，在相同放射劑量照射下，si-DANCR細胞的增殖率顯著低于si-NC組HT29-R細胞的增殖率(P<0.05)，干擾DANCR增強HT29-R細胞的放療敏感性，見表3。

2.6 干擾DANCR對HT29-R細胞平板克隆能力的影響 4 Gy放射劑量照射si-NC組和si-DANCR組HT29-R細胞，平板克隆實驗結果顯示，si-NC組細胞克隆形成數(shù)目為(68.67±6.33)個，si-DANCR組細胞克隆形成數(shù)目為(42.33±5.84)個，與si-NC組相比，si-DANCR組細胞的克隆形成能力顯著降低(t=5.297,P=0.003)，見圖5。

表3 干擾DANCR對HT29-R細胞放療敏感性的影響

圖5 平板克隆實驗檢測各組細胞克隆形成能力

2.7 干擾DANCR對HT29-R細胞周期的影響 4 Gy放射劑量照射si-NC組和si-DANCR組HT29-R細胞，流式細胞實驗結果顯示，與si-NC組相比，si-DANCR組細胞周期阻滯在G0/G1期(t=4.312,P=0.008)，見圖6。

圖6 流式細胞實驗檢測各組細胞周期

2.8 干擾DANCR對HT29-R細胞凋亡的影響 4 Gy放射劑量照射si-NC組和si-DANCR組HT29-R細胞，流式細胞實驗結果顯示，si-NC組細胞凋亡率為(6.12±2.53)%，si-DANCR組細胞凋亡率為(33.85±6.07)%，與si-NC組相比，si-DANCR組細胞的凋亡顯著增加(t=7.304,P=0.001)，見圖7。

圖7 流式細胞實驗檢測各組細胞凋亡

2.9 干擾DANCR對HT29-R細胞中周期和凋亡相關蛋白的影響 4 Gy放射劑量照射si-NC組和si-DANCR組HT29-R細胞，western blot結果顯示，與si-NC組相比，si-DANCR組細胞中周期相關蛋白cyclinD1、CDK4、CDK6表達降低和凋亡相關蛋白caspase 3、Bax表達增加，Bcl-2蛋白表達降低活化(P<0.05)。見圖8、表4。

圖8 western blot檢測各組細胞周期和凋亡相關蛋白的表達

表4 各組細胞中凋亡相關蛋白的相對表達量

3 討論

直腸癌是一種常見的致命疾病，治療的首選方法是手術切除，研究顯示直腸癌患者治愈率與腫瘤整體切除率密切相關。而大多數(shù)直腸癌患者是在晚期被診斷出來，失去手術機會，放療作為晚期患者的重要治療策略，但晚期患者的生存率仍較低[2]。直腸癌是一項復雜的臨床挑戰(zhàn)，需要多模式治療和手術才能提供最佳治愈機會。研究顯示在許多患者中，新輔助放化療是降低腫瘤分期、減少結腸造口術和減少局部復發(fā)的主要治療方法，新輔助放化療后進行手術可減少局部復發(fā)，被認為是局部晚期直腸癌的標準治療[4]。然而放射治療的抵抗是患者預后較差的主要障礙[10]。因此研究直腸癌放療抵抗的分子機制具有重要意義。

lncRNA是一類長度從200 nt到100 kb的非編碼RNA，由于其廣泛的作用而受到越來越多的關注。lncRNA的表達失調通過影響表觀遺傳學參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，lncRNA 的調控是抑制腫瘤進展和克服腫瘤耐藥性的重要策略，正在成為腫瘤診斷的新型生物標志物和腫瘤治療的靶點[11]。DANCR位于4號染色體上，長度為855個堿基對，具有抑制表皮祖細胞分化的功能。研究顯示DANCR表達異常導致包括人類腫瘤在內的疾病發(fā)生，在肺癌和卵巢癌等常見腫瘤中DANCR表達上調，促進腫瘤細胞增殖、侵襲和轉移[6-7]。同時DANCR密切參與胃癌和肝細胞肝癌等消化系統(tǒng)的化療耐藥[12-13]，提示DANCR可能與腫瘤放療抵抗相關。Shen等[14]報道結直腸癌組織和血清中DANCR水平顯著上調，術后患者血清DANCR表達較治療前和復發(fā)患者降低，DANCR的高表達是結直腸癌診斷的潛在生物標志物。本研究采用qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)DANCR在直腸癌組織中表達升高，高表達DANCR與患者TNM分期顯著相關，與Lu等[8]報道一致。Assani等[15]報道DANCR在結腸癌組織和細胞中表達較高，較高水平的DANCR與患者較差的預后和較短的生存時間相關，而本研究生存分析顯示DANCR高表達預示結直腸癌患者預后較差。同時本研究發(fā)現(xiàn)與直腸癌放療敏感性患者相比，直腸癌放療抵抗患者組織中DANCR的表達增加，表明DANCR可能促進直腸癌的放療抵抗。

既往研究表明DANCR促進結直腸癌細胞增殖、細胞周期、侵襲、轉移和耐藥，并抑制細胞凋亡[8]，本研究注重DANCR在直腸癌放療抵抗中發(fā)揮的作用，首先成功誘導直腸放療抵抗耐藥細胞株HT29-R，qRT-PCR檢測顯示與放療敏感性的細胞相比，DANCR在直腸放療抵抗耐藥細胞株HT29-R中的表達升高，干擾DANCR的表達后，MTS結果顯示HT29-R細胞的放射敏感性增加。同時在放射線輻射作用下干擾DANCR的表達后，HT29-R細胞的平板克隆形成能力降低，表明降低DANCR的表達增強直腸癌細胞放療敏感性。細胞周期調控失控及細胞凋亡是腫瘤細胞放療抵抗的重要機制[16]，本研究顯示干擾DANCR的表達后，HT29-R細胞周期阻滯在G0/G1期，細胞凋亡率增加。在胃癌細胞中干擾DANCR的表達誘導細胞阻滯在G0/G1期，促進細胞的凋亡，敲減DANCR的表達抑制細胞周期蛋白cyclinD1表達，及抗凋亡蛋白Bcl-2表達下調，促凋亡蛋白Bax表達上調[12]。cyclinD1蛋白和周期蛋白依賴性激酶CDK4、CDK6結合形成復合物促進細胞周期由G0/G1期至S期的轉變，以促進細胞周期進展[17-18]，本研究采用western blot檢測顯示敲減DANCR的表達，HT29-R細胞中cyclinD1、CDK4和CDK6蛋白表達降低。Caspase蛋白激活后促使細胞發(fā)生凋亡，caspase、Bcl-2和Bax蛋白是調控細胞線粒體凋亡途徑重要機制[19-20]。本研究結果顯示敲減DANCR的表達，HT29-R細胞中caspase 3、Bax表達增加，Bcl-2蛋白表達降低。表明DANCR通過調控細胞周期相關蛋白和凋亡相關蛋白促進直腸癌細胞放療抵抗。

4 結論

DANCR在直腸癌組織中表達上調，與患者TNM分期、放療抵抗和生存預后相關。干擾DANCR的表達顯著增強直腸癌細胞放療敏感性，其作用機制可能是通過調控細胞周期和凋亡相關蛋白。DANCR是直腸癌患者預后和治療潛在分子靶點。本研究的不足之處在于未能深入的研究DANCR具體的作用靶點及調控機制，仍需在后續(xù)研究中進一步探討。