NFC楊梅汁加工及貯藏環(huán)節(jié)微生物群落多樣性分析

宣曉婷，崔 燕，程 煥，鄧文藝，尚海濤，林旭東，張 鐵，凌建剛，

（1.寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，浙江寧波 315400；2.浙江大學(xué) 生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310058；3.湖南一品東方生物科技有限公司，湖南 長(zhǎng)沙 410000）

楊梅（Myrica rubra Sieb.etZucc.）主產(chǎn)于長(zhǎng)江中下游以南地區(qū)，因其風(fēng)味獨(dú)特濃郁、酸甜可口、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高（富含花色苷、類黃酮、酚酸類等活性成分）而深受消費(fèi)者喜愛。楊梅采收期主要集中在梅雨高溫季節(jié)，且易受到機(jī)械損傷、微生物侵染等問(wèn)題而導(dǎo)致品質(zhì)下降，甚至失去其商品價(jià)值。因此楊梅產(chǎn)業(yè)亟需尋找一種減少采后損失、提高產(chǎn)品市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力的技術(shù)手段。近年來(lái)，隨著大眾消費(fèi)者對(duì)健康和營(yíng)養(yǎng)的需求轉(zhuǎn)變，非濃縮還原果汁（Not-from-concentrate juice，NFC）逐漸受到廣大消費(fèi)者的喜愛。NFC果汁在加工過(guò)程中溫度低、時(shí)間短，所以較傳統(tǒng)的濃縮還原果汁能更好地保留新鮮水果中原有的營(yíng)養(yǎng)和風(fēng)味。將楊梅鮮果加工成高品質(zhì)的NFC楊梅汁可以有效地解決難運(yùn)輸、短銷售期、短貯藏期等難點(diǎn)[1]。

超高壓技術(shù)（High Hydrostatic Pressure，HHP）是NFC果汁加工過(guò)程中的重要環(huán)節(jié)，作為一種新型的食品非熱加工技術(shù)，它的作用機(jī)理是通過(guò)水為傳壓介質(zhì)，均勻地施壓于果汁物料，可以達(dá)到殺菌、鈍酶、改善品質(zhì)等效果，且很好地保留了果汁原有的色香味和營(yíng)養(yǎng)活性物質(zhì)，因此超高壓技術(shù)被廣泛應(yīng)用于單一型果汁[2-3]、復(fù)合型果汁[4]和果蔬復(fù)合汁[5]，目前關(guān)于超高壓控制果汁中微生物生長(zhǎng)、延長(zhǎng)貨架期等研究已有相關(guān)報(bào)道[3，6]，Stinco C M等人[6]研究發(fā)現(xiàn)超高壓（450，600 MPa）處理胡蘿卜濁汁5 min可延長(zhǎng)其貨架期至14周；Blaszczak W等人[3]也發(fā)現(xiàn)400～600 MPa使得黑莓汁的菌落總數(shù)降至檢測(cè)限值（1 CFU/mL）以下。關(guān)于加工環(huán)節(jié)、貯藏及超高壓處理對(duì)NFC果汁中微生物多樣性變化的研究極少，因此開展楊梅汁加工、貯藏及超高壓處理對(duì)其微生物組的研究非常必要。

早期的微生物群落多樣性的研究主要采用純培養(yǎng)、理化鑒定等技術(shù)手段，但對(duì)于自然環(huán)境中出現(xiàn)的不可培養(yǎng)或是無(wú)法鑒定的微生物則束手難測(cè)[7-8]。隨著研究技術(shù)手段的不斷更替，免培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，包括溫度梯度凝膠電泳、變性梯度凝膠電泳[9-10]、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性[11-12]、熒光原位雜交[13]等。免培養(yǎng)技術(shù)增加了可鑒定的微生物種類，但距離全面建立微生物種類的數(shù)據(jù)庫(kù)還存在很大的差距。因此，作為第二代測(cè)序技術(shù)的高通量測(cè)序技術(shù)有效克服了傳統(tǒng)純培養(yǎng)技術(shù)的局限性，同時(shí)因其能同時(shí)對(duì)數(shù)百萬(wàn)個(gè)DNA分子進(jìn)行測(cè)序，精度高、無(wú)偏性等優(yōu)勢(shì)被廣泛用于快速鑒定微生物多樣性和鑒別新微生物種群[14]。目前，基于16S rRNA基因的高通量測(cè)序技術(shù)以羅氏公司454測(cè)序技術(shù)、Illumina公司Solexa測(cè)序技術(shù)和ABI公司的Solid測(cè)序技術(shù)為代表，廣泛應(yīng)用于檢測(cè)各類食品中的微生物多樣性，如發(fā)酵乳品[14-15]、酒類[16-18]、調(diào)味料[19-20]、水產(chǎn)品[21]、蔬菜[22]等，但在果汁領(lǐng)域的應(yīng)用極少，僅在哈密瓜汁、櫻桃等有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[20-21]。

基于高通量測(cè)序方法對(duì)楊梅汁在加工環(huán)境、貯藏期、超高壓處理過(guò)程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較分析，更加全面地展現(xiàn)楊梅汁在全產(chǎn)業(yè)鏈中微生物多樣性及演替變化，為更好地控制楊梅汁中微生物奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

東魁楊梅，寧波寧海善福果蔬專業(yè)合作社提供，選擇新鮮無(wú)蟲蛀、無(wú)腐爛的成熟果實(shí)，清洗去除污垢雜質(zhì)，原料冷凍貯存。

PCR產(chǎn)物純化試劑盒，美國(guó)Thermo公司提供；PCR擴(kuò)增試劑及引物，TaKaRa公司提供；AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒，AXYGEN公司提供；Phusion R High-Fidelity PCR Master，美國(guó)New England Biolabs公司提供；其他試劑，均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

超高壓設(shè)備，北京速原中天有限公司產(chǎn)品；NovaSeq6000 DNA測(cè)序儀，德國(guó)Illumina公司產(chǎn)品；GeneAmp R 9700 PCR儀，美國(guó)ABI公司產(chǎn)品；QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)，美國(guó)Promega公司產(chǎn)品；PowerPacUniversal水平電泳儀、SUBCELL GT電泳槽，美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程楊梅→挑選→清洗→去核→榨汁→過(guò)濾→超高壓殺菌→楊梅汁。

1.2.2 操作要點(diǎn)

（1）原料選擇和清洗。選擇新鮮無(wú)蟲蛀、無(wú)腐爛的成熟果實(shí)，清洗去除污垢雜質(zhì)。

（2）去核。楊梅在榨汁前進(jìn)行人工去核，楊梅果肉備用。

（3）榨汁和過(guò)濾。為了最大限度地保留果蔬營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，將清洗后去核的楊梅在低溫下進(jìn)行榨汁，然后用紗布進(jìn)行過(guò)濾。

（4）超高壓處理。根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 7101—2015，并基于超高壓楊梅汁的菌落總數(shù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，確立超高壓參數(shù)為壓力500 MPa，保壓時(shí)間5 min，設(shè)備升壓時(shí)間為3 min，泄壓時(shí)間3～5 s。將樣品置于超高壓滅菌倉(cāng)中進(jìn)行處理，處理結(jié)束后，將樣品取出備用。

1.2.3 組別的設(shè)置

（1）加工環(huán)節(jié)試驗(yàn)組。試驗(yàn)組以楊梅原果為空白對(duì)照組（A1），選取重要加工環(huán)節(jié)（榨汁和殺菌）的楊梅樣品分別設(shè)為A2和A3組，對(duì)比3組加工環(huán)節(jié)試驗(yàn)組（Group 1）楊梅樣品中微生物菌群組成。

（2）貯藏期試驗(yàn)組。試驗(yàn)組以超高壓殺菌后的楊梅汁為對(duì)照組（A3），在4℃下貯藏1，2，3周的楊梅汁樣品，分別設(shè)為A4，A5，A6組，對(duì)比4組貯藏期試驗(yàn)組（Group 2）楊梅汁樣品中細(xì)菌群落組成。

（3）超高壓試驗(yàn)組。試驗(yàn)組以超高壓殺菌（500 MPa/5 min）后的楊梅汁為對(duì)照組（A3），設(shè)500 MPa/10 min超高壓試驗(yàn)組為A7，500 MPa/5 min+5 min超高壓試驗(yàn)組為A8（即反復(fù)升泄壓1次）。對(duì)比3組超高壓試驗(yàn)組（Group 3）楊梅汁樣品中細(xì)菌群落組成。

1.2.4 基因組DNA抽提

基于CTAB/SDS方法提取樣品中的總基因組DNA，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)抽提的基因組DNA濃度和純度。根據(jù)濃度，用無(wú)菌水將DNA稀釋至1 ng/μL。

1.2.5 PCR擴(kuò)增及測(cè)序

參考張敏等人[14]和楊勝平等人[21]的方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。全部樣品重復(fù)3次，將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，使用Axy-PrepDNA凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產(chǎn)物，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測(cè)，選擇400～450 bp亮主條的樣品進(jìn)行進(jìn)一步試驗(yàn)。

擴(kuò)增樣品混合后采用GeneJET Gel Extraction Kit純化，在超微量紫外分光光度計(jì)上精確定量后，等量混合在Illumina PE250測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，PCR擴(kuò)增及測(cè)序工作由上海元莘生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.3 數(shù)據(jù)分析

基于3次重復(fù)試驗(yàn)所得的原始數(shù)據(jù)，采用Trimmomatic、Usearch 10.0軟件處理進(jìn)行分類單元OTU（Operational taxonomic unit）聚類分析和物種分類學(xué)分析，基于OTU聚類分析結(jié)果，通過(guò)QIIME 1.9.1軟件對(duì)OTU進(jìn)行Chao1、ACE、Shannon和Simpson指數(shù)等多樣性指數(shù)分析，以及對(duì)測(cè)序深度the Good's coverage的檢測(cè)?；诜诸悓W(xué)信息，可以在門和屬分類水平上進(jìn)行菌群結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)分析。根據(jù)稀釋性曲線可得出測(cè)序深度情況。根據(jù)樣品間豐度相似性聚類，將聚類后數(shù)據(jù)表示在Heatmap圖中，通過(guò)顏色梯度及相似程度來(lái)可視化反映樣品間在各分類水平上群落組成的相似性和差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品序列數(shù)的特點(diǎn)

通過(guò)細(xì)菌的16S rDNA測(cè)序，加工環(huán)節(jié)試驗(yàn)組（Group 1）3個(gè)樣品共產(chǎn)生191 952個(gè)序列標(biāo)簽，平均長(zhǎng)度為382.45 bp，所有序列按97%的相似度進(jìn)行OTU分類，總共聚成296個(gè)OTU。貯藏試驗(yàn)組（Group 2）4個(gè)樣品共產(chǎn)生249 131個(gè)序列標(biāo)簽，平均長(zhǎng)度為383.75 bp，OTU分類共聚成497個(gè)OTU。超高壓試驗(yàn)組（Group3）3個(gè)樣品共產(chǎn)生184 246個(gè)序列標(biāo)簽，平均長(zhǎng)度為381.40 bp，OTU分類共聚成332個(gè)OTU。

2.2 樣品菌群多樣性分析

不同加工環(huán)節(jié)楊梅樣品的信息、序列豐度及微生物多樣性見表1，楊梅汁貯藏期樣品的信息、序列豐度及微生物多樣性見表2，不同超高壓處理?xiàng)蠲分瓨悠返男畔?、序列豐度及微生物多樣性見表3，細(xì)菌群落基于UniFrac的稀釋曲線見圖1。

表1 不同加工環(huán)節(jié)楊梅樣品的信息、序列豐度及微生物多樣性

表2 楊梅汁貯藏期樣品的信息、序列豐度及微生物多樣性

表3 不同超高壓處理?xiàng)蠲分瓨悠返男畔?、序列豐度及微生物多樣性

試驗(yàn)將不同樣品相似度為97%的OTU進(jìn)行聚類分析，評(píng)價(jià)3組試驗(yàn)組樣品間的微生物菌群相似性，通過(guò)稀釋曲線（Rarefaction curve）體現(xiàn)樣品的測(cè)序深度情況[22-25]。稀釋曲線使用97%相似度的OTU，用來(lái)比較測(cè)序數(shù)據(jù)量不同的樣品中物種的豐富度[26]。由圖1可知，稀釋曲線逐漸趨于平緩，表明測(cè)序結(jié)果合理，且能反映樣品中物種的豐富度和均勻度，其中曲線部分在橫軸上的范圍大，說(shuō)明樣品中物種豐度較高。

圖1 細(xì)菌群落基于UniFrac的稀釋曲線

細(xì)菌群落的多樣性分析（Alpha-diversity）可以反映微生物菌群的豐度和多樣性，包括Chao指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和覆蓋率。由表1可知，加工環(huán)節(jié)中殺菌后楊梅汁中細(xì)菌Shannon指數(shù)明顯高于其他組，說(shuō)明殺菌后楊梅汁中微生物群落種群差異性較大。從OTU數(shù)可知，殺菌后楊梅汁的數(shù)值最高，其次是楊梅原料組，榨汁組最少。樣品的Chao1指數(shù)有與OTU相類似的結(jié)果，這是由于Chao1算法通常是估算樣品中所含OTU數(shù)目的指數(shù)，在生態(tài)學(xué)中常用來(lái)估計(jì)物種總數(shù)。隨著加工環(huán)節(jié)的進(jìn)程，樣品的Simpson指數(shù)逐漸降低，Simpson指數(shù)是用于估算樣品中微生物多樣性指數(shù)，其數(shù)值越大，說(shuō)明隨著楊梅汁的加工，樣品的群落多樣性越低。有研究報(bào)道，超高壓處理會(huì)導(dǎo)致菌群相對(duì)豐度和多樣性降低，且對(duì)不同微生物的影響也不同[27-28]，研究結(jié)果與之相一致。此外，楊梅汁樣品的覆蓋率均大于99%，說(shuō)明測(cè)序結(jié)果可以代表樣品中微生物的真實(shí)情況。表2和表3顯示超高壓處理組和貯藏組樣品OTU沒有明顯變化規(guī)律，說(shuō)明在不同超高壓處理和貯藏期過(guò)程中樣品的微生物群落種群差異性較小。Toledo D A J等人[23]研究了超高壓對(duì)櫻桃貯藏期間微生物多樣性變化，發(fā)現(xiàn)其隨著貯藏期到第60天顯著下降，且600 MPa壓力下櫻桃中微生物多樣性明顯降低。試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)貯藏期過(guò)程中的樣品微生物群落種群差異性較小，猜測(cè)可能的原因是由于貯藏時(shí)間較短，其微生物多樣性未發(fā)現(xiàn)顯著變化。由表3結(jié)果顯示隨著增壓次數(shù)增加，楊梅汁微生物多樣性并未發(fā)生顯著降低，汪蘭等人[29]研究發(fā)現(xiàn)超高壓處理具有較好的滅菌效果且隨著增壓次數(shù)的增加，菌落總數(shù)也有不同程度的減少，但對(duì)于微生物多樣性的影響研究目前暫未報(bào)道。

2.3 樣品細(xì)菌群落門和屬水平分布

楊梅汁樣品門（A,C,D）和屬（B,E,F）水平菌群分布圖見圖2。

圖2 楊梅汁樣品門（a，c，d）和屬（b，e，f）水平菌群分布圖

3組試驗(yàn)中，楊梅汁的3個(gè)細(xì)菌門被鑒別，它們分別是變形菌門（Proteobacteria）、藍(lán)藻菌門（Cyanobacteria）、未分類菌群。對(duì)楊梅汁中主要組成的3個(gè)門進(jìn)行門水平菌群比例分布繪圖。由圖2（a）～（c）可知，所有楊梅汁樣品均以變形菌門為最占優(yōu)勢(shì)的菌群門，占細(xì)菌總序列比值均超過(guò)55%?；诓煌M試驗(yàn)進(jìn)一步分析表明，榨汁和殺菌工藝降低了樣品中變形菌門比例，而藍(lán)藻菌門比例上升（由5.53%分別上升至40.46%和28.80%）。隨著貯藏期的延長(zhǎng)，樣品中優(yōu)勢(shì)菌群門變形菌門占總序列比值有所上升，說(shuō)明貯藏過(guò)程中優(yōu)勢(shì)菌群門以變形菌門為主。此外，隨著超高壓處理時(shí)間的延長(zhǎng)，樣品中變形菌門占總序列的比例也在上升，且循環(huán)超高壓處理方式會(huì)提高其占比。研究結(jié)果表明超高壓處理會(huì)導(dǎo)致菌群相對(duì)豐度和多樣性改變，且對(duì)不同微生物的影響也不同，這與Perez Pulido R等人[27-28]的研究結(jié)果相一致。

由圖2（d）～（f）可知，3組試驗(yàn)組中的微生物菌群的主要種屬相差不大，但占比存在顯著差異。楊梅汁樣品中微生物菌群以葡糖桿菌屬（Gluconobacter）、醋酸桿菌屬（Acetobacter）、藍(lán)藻菌屬（Cyanobacteria_norank）、假單胞細(xì)菌屬（Pseudomonas）、Mitochondria-norank、伯克氏菌屬（Burkholderia-Paraburkholderia）為主要細(xì)菌種屬。從加工環(huán)節(jié)組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，榨汁環(huán)節(jié)降低了樣品中葡糖桿菌屬（53.44%降低至22.33%），而藍(lán)藻菌屬和醋酸桿菌屬顯著升高，分別升高至40.46%和19.85%；殺菌環(huán)節(jié)有相類似的變化規(guī)律，其中藍(lán)藻菌屬和醋酸桿菌屬顯著升高，分別升至28.80%和25.83%。從貯藏組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，楊梅汁樣品在貯藏第1周，原優(yōu)勢(shì)菌種屬由藍(lán)藻菌屬變?yōu)槠咸菞U菌屬和醋酸桿菌屬，其占總序列比分別為35.87%和30.28%；隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，藍(lán)藻菌屬占比降低至12.32%，而葡糖桿菌屬和醋酸桿菌屬占比分別升至36.48%和32.18%。從超高壓試驗(yàn)組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，500 MPa/5 min處理組樣品中細(xì)菌以藍(lán)藻菌屬（28.88%）、醋酸桿菌屬（27.01%）和葡糖桿菌屬（24.40%）為主要細(xì)菌種屬，總占比達(dá)80.29%；隨著超高壓處理時(shí)間延長(zhǎng)至10 min，樣品中細(xì)菌以醋酸桿菌屬（29.29%）、藍(lán)藻菌屬（27.08%）和葡糖桿菌屬（24.94%）為主要細(xì)菌種屬，總占比達(dá)81.31%；較直接泄壓的超高壓處理方式，反復(fù)泄壓的超高壓處理方式的樣品中細(xì)菌以葡糖桿菌屬（34.11%）、醋酸桿菌屬（28.64%）和藍(lán)藻菌屬（22.90%）為主要細(xì)菌種屬，總占比達(dá)85.65%。

應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)，檢測(cè)果蔬中微生物多樣性及相對(duì)豐度的研究相對(duì)較少。Wang L等人[30]研究了超高壓對(duì)蘆筍貯藏期微生物多樣性的影響，研究發(fā)現(xiàn)蘆筍中微生物以變形菌門（泛菌和假單胞菌屬）、厚壁菌門（乳球菌和腸球菌）等為優(yōu)勢(shì)菌群。在蘆筍貯藏期初期，超高壓處理降低了假單胞菌的相對(duì)豐度但同時(shí)腸桿菌屬顯著增加。后續(xù)Toledo D A J等人[31]又研究了超高壓對(duì)櫻桃中微生物多樣性的影響以及貯藏期間微生物的演替。微生物多樣性研究發(fā)現(xiàn)櫻桃中變形菌（Proteobacteria）的相對(duì)豐度最高，而葡糖桿菌屬（Gluconobacter）和腸桿菌屬（Enterobacteriaceae）是其中的優(yōu)勢(shì)菌屬。在60 d的貯藏過(guò)程中葡糖桿菌屬一直占有主導(dǎo)地位，這與研究的結(jié)果相類似。葡糖桿菌屬是一種好氧非發(fā)酵革蘭氏陰性桿菌，廣泛分布于鮮花、水果等高糖環(huán)境中，也能在蘋果酒、葡萄酒和啤酒等飲料環(huán)境中生長(zhǎng)。雖然這種菌對(duì)人類沒有致病性，但會(huì)導(dǎo)致水果腐爛和褐變[32]。葡糖桿菌和醋酸桿菌具有氧化代謝特性，可以氧化糖、有機(jī)酸和醇等部分有機(jī)小分子[33-34]。當(dāng)乙醇存在時(shí)，葡糖桿菌和醋酸桿菌會(huì)產(chǎn)生乙酸，造成乙酸腐敗。

2.4 樣品細(xì)菌群落相似性分析

基于UniFrac的聚類樹分析和主成分分析（Principal Component Analysis，PCA），試驗(yàn)將不同樣品相似度為97%的OTU進(jìn)行聚類分析3組試驗(yàn)組各自樣品間的微生物群落相似性，通過(guò)Heatmap圖可視化展現(xiàn)不同樣品在屬水平上群落組成的相似性和差異性[31]。

Group 1樣品中細(xì)菌群落熱圖分析（a）和層次聚類分析（b）見圖3，Group 2樣品中細(xì)菌群落熱圖分析（a）和層次聚類分析（b）見圖4，Group 3樣品中細(xì)菌群落熱圖分析（a）和層次聚類分析（b）見圖5，細(xì)菌群落基于UniFrac的主成分分析見圖6。

圖3 Group 1樣品中細(xì)菌群落熱圖分析（a）和層次聚類分析（b）

圖4 Group 2樣品中細(xì)菌群落熱圖分析（a）和層次聚類分析（b）

圖5 Group 3樣品中細(xì)菌群落熱圖分析（a）和層次聚類分析（b）

圖6 細(xì)菌群落基于UniFrac的主成分分析

圖3（a）、圖4（a）和圖5（a）分別為加工環(huán)節(jié)、貯藏期、超高壓處理對(duì)楊梅中微生物群落影響熱圖分析，熱圖通過(guò)顏色梯度及相似程度來(lái)反映樣品群落相似性，其中紅色代表高豐度的細(xì)菌群落，藍(lán)色代表低豐度的細(xì)菌群落。從圖中可以看出楊梅汁樣品中微生物菌群均以葡糖桿菌屬（Gluconobacter）、醋酸桿菌屬（Acetobacter）和藍(lán)藻菌屬（Cyanobacteria-norank）為排名前3的優(yōu)勢(shì)菌屬。由圖2（b）可知，加工環(huán)節(jié)試驗(yàn)組樣品共聚成兩類，第1類為空白對(duì)照組，第2類為榨汁和殺菌組樣品，這就說(shuō)明加工環(huán)節(jié)改變了楊梅樣品中的微生物群落結(jié)構(gòu)，增加了其差異性。圖3（b）為貯藏期楊梅汁樣品微生物群落動(dòng)態(tài)變化的層次聚類分析。由圖3（b）可知，樣品共聚成3類，第1類為對(duì)照組和貯藏1周后的楊梅汁樣品，第2類和第3類分別為貯藏2周和3周后的楊梅汁樣品，說(shuō)明貯藏中后期楊梅汁樣品中的微生物群落差異性增加。圖4（b）為樣品中細(xì)菌群落層次聚類分析，所有超高壓處理樣品共聚成2類，第1類是500 MPa/5 min處理組和500 MPa/5 min+5 min組，第2類是500 MPa/10 min試驗(yàn)組樣品，結(jié)果表明超高壓處理時(shí)間的延長(zhǎng)會(huì)改變楊梅汁樣品中微生物多樣性，而與單循環(huán)超高壓處理相比，反復(fù)循環(huán)超高壓處理后楊梅汁微生物菌群結(jié)構(gòu)更接近對(duì)照組試驗(yàn)。

PCA主成分分析是一種多元統(tǒng)計(jì)方法，通過(guò)正交變換將一組可能相關(guān)變量降維轉(zhuǎn)換為一組稱為主成分的線性不相關(guān)變量的值，當(dāng)累計(jì)貢獻(xiàn)率超過(guò)80%時(shí)，即代表基本包含樣品的信息。樣品組成越相似，反映在PCA圖中的距離越近。由圖6可知，較榨汁加工試驗(yàn)組，殺菌試驗(yàn)組與空白對(duì)照組距離更遠(yuǎn)，說(shuō)明殺菌后楊梅汁中的微生物差異性增加；貯藏3周試驗(yàn)組比貯藏1周試驗(yàn)組距離更遠(yuǎn)，說(shuō)明隨著貯藏期的延長(zhǎng)，楊梅汁中微生物群落差異性增加；超高壓試驗(yàn)組中，延長(zhǎng)處理時(shí)間和改變泄壓方式均增加了楊梅汁中的微生物差異性，且前者的影響較后者更大。

3 結(jié)論

綜上所述，楊梅汁中微生物多樣性在加工過(guò)程中呈逐步下降趨勢(shì)，但在不同超高壓處理和貯藏過(guò)程中楊梅汁的微生物群落種群差異性較小。在加工過(guò)程中，楊梅汁以變形菌門為主，其中榨汁和殺菌工藝降低了楊梅汁中變形菌門比例，而隨著貯藏期的延長(zhǎng)、超高壓處理時(shí)間的延長(zhǎng)或者循環(huán)超高壓處理方式會(huì)提高樣品中變形菌門比例。在屬水平上，楊梅汁中微生物以葡糖桿菌屬（Gluconobacter）、醋酸桿菌屬（Acetobacter）、藍(lán)藻菌屬（Cyanobacterianorank）等為優(yōu)勢(shì)菌屬。在加工環(huán)節(jié)試驗(yàn)組以藍(lán)藻菌屬為主；貯藏期試驗(yàn)組優(yōu)勢(shì)菌種屬由藍(lán)藻菌屬變?yōu)槠咸菞U菌屬和醋酸桿菌屬。通過(guò)探究楊梅汁在加工、貯藏和超高壓殺菌環(huán)節(jié)中微生物群落結(jié)構(gòu)與多樣性變化，為進(jìn)一步控制楊梅汁加工貯藏過(guò)程中關(guān)鍵環(huán)節(jié)的微生物安全性提供依據(jù)和參考。

此外，有研究證實(shí)超高壓會(huì)導(dǎo)致微生物進(jìn)入亞致死狀態(tài)，這是由于殺菌不徹底、微生物脅迫耐受性等因素導(dǎo)致食源性致病菌出現(xiàn)正常和死亡以外的第3種生理狀態(tài)——亞致死損傷狀態(tài)，在產(chǎn)品貯藏、運(yùn)輸?shù)冗^(guò)程中，一旦處于亞致死狀態(tài)的致病菌處于適宜的環(huán)境條件下，亞致死菌能夠自我修復(fù)并且恢復(fù)到正常的狀態(tài)，一旦進(jìn)入人體便會(huì)存在潛在危害，給食品安全保障帶來(lái)嚴(yán)重隱患，未來(lái)將針對(duì)存在亞致死菌的食品，對(duì)其在貯藏期間微生物多樣性變化的內(nèi)在規(guī)律開展更深入的研究。