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      轉(zhuǎn)cry30Fa1水稻對褐飛虱NlHRP基因表達(dá)模式的影響

      2022-11-18 08:26:10普琪雯焦慧宇區(qū)文韜劉健麗
      中國生物防治學(xué)報(bào) 2022年5期
      關(guān)鍵詞:雌蟲飛虱羽化

      普琪雯,焦慧宇,區(qū)文韜,劉健麗,林 勝

      (福建農(nóng)林大學(xué)閩臺作物有害生物生態(tài)防控國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/福建農(nóng)林大學(xué)海峽兩岸特色作物安全生產(chǎn)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心/福建省農(nóng)產(chǎn)品安全研究平臺/害蟲綠色防控福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福州 350002)

      水稻Oryza sativa是世界上分布最廣、人類食用最多的糧食作物之一。褐飛虱被認(rèn)為是對水稻最有威脅的害蟲之一[1],主要以水稻韌皮部汁液為食物來源。由于缺乏抵抗褐飛虱入侵的第一道“屏障”,我國褐飛虱出現(xiàn)了連年暴發(fā)的現(xiàn)象,造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。抗性水稻一直是防治稻飛虱研究中的焦點(diǎn),目前已成功育成了攜帶bph1和bph2基因的抗稻飛虱水稻[3],但很快就被稻飛虱適應(yīng)[4-6]。自20世紀(jì)80年代以來,沒有其他基因被廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代水稻品種中。盡管如此,即使針對從未廣泛應(yīng)用的基因,稻飛虱種群適應(yīng)轉(zhuǎn)基因水稻的能力也有所增加(如bph8、Bph9、BPH25、BPH26)[6,7]。

      cry30Fa1是由朱軍等[8]通過菌株分離,鑒定出的1種新型Bt殺蟲晶體蛋白基因。近期,王海鵬[9]通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將cry30Fa1轉(zhuǎn)入受體水稻蜀恢818(R818)中,通過對目的基因的表達(dá)水平檢測、苗期抗蟲性鑒定和田間抗蟲性鑒定等途徑實(shí)現(xiàn)了對抗褐飛虱cry30Fa1的優(yōu)化及成功轉(zhuǎn)化。福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)遺傳工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將cry30Fa1轉(zhuǎn)入明恢86水稻(MH86)的愈傷組織中,在進(jìn)一步誘導(dǎo)培育下得到新型轉(zhuǎn)cry30Fa1水稻(KF30-14)[10]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),KF30-14能有效抑制褐飛虱雌成蟲體質(zhì)量、卵巢發(fā)育及繁殖力[11,12],但相關(guān)影響機(jī)制尚不清楚。

      課題組通過相關(guān)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn),取食KF30-14水稻的褐飛虱雌蟲的NlHRP基因顯著表達(dá),其主要編碼富組氨酸蛋白。組氨酸(His)是褐飛虱的必需氨基酸之一,在其生長發(fā)育中起著關(guān)鍵作用[13-15]。因此,本研究克隆了NlHRP基因,并研究了轉(zhuǎn)cry30Fa1水稻(KF30-14)對其表達(dá)模式的影響,旨在為揭示轉(zhuǎn)cry30Fa1水稻抗褐飛虱的分子機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

      1 材料與方法

      1.1 試驗(yàn)材料

      1.1.1 供試水稻 轉(zhuǎn)cry30Fa1水稻(KF30-14)與其親本水稻明恢86(MH86)均由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)遺傳工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

      1.1.2 供試?yán)ハx 褐飛虱飼養(yǎng)于福建農(nóng)林大學(xué)應(yīng)用生態(tài)研究所人工氣候室,溫度(28±1)℃,光周期16L∶8D,相對濕度(80±1)%。已在KF30-14和MH86上連續(xù)飼養(yǎng)30代以上。

      1.1.3 主要試劑與試劑盒 如表1。

      表1 主要試劑與試劑盒Table 1 The mainly reagent and kits

      1.1.4 主要儀器與設(shè)備 如表2。

      表2 主要儀器Table 2 The mainly instrument

      1.2 目的基因篩選

      通過對比KF30-14實(shí)驗(yàn)種群與MH86實(shí)驗(yàn)種群中羽化3 d的褐飛虱雌雄成蟲和褐飛虱3齡若蟲的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),對顯著差異基因進(jìn)行分析。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與參考序列比對后,通過維恩圖進(jìn)行差異表達(dá)基因篩選。

      1.3 NlHRP的序列及其表達(dá)模式分析

      1.3.1 RNA提取及cDNA合成 用Trizol試劑提取褐飛虱組織與整蟲的總RNA。步驟如下:取收集好的褐飛虱整蟲或組織置于1.5 mL無酶離心管,再于每管加入2顆3 mm的鋼珠,使用組織破碎儀進(jìn)行30 s(30 Hz)破碎;取200 μL Trizol試劑,加入離心管中,使用組織破碎儀進(jìn)行30 s(30 Hz)破碎后常溫靜置10 min;再加40 μL氯仿于每個離心管中,振蕩5 s后常溫靜置10 min;4 ℃ 13000 r/min離心10 min;吸75 μL上清液,并轉(zhuǎn)移至新離心管;加75 μL同體積異丙醇后振蕩5 s混勻,將離心管置于-20 ℃冰箱中3 h以上;4 ℃ 13000 r/min離心20 min后棄上清;加600 μL無水乙醇,振蕩至沉淀懸浮,從而達(dá)到洗滌沉淀的目的;4 ℃ 13000 r/min 離心10 min后棄上清;加600 μL 無水乙醇,再次洗滌沉淀;4 ℃ 13000 r/min離心10 min后倒上清,用吸水紙吸取多余液體,側(cè)倒在通風(fēng)櫥里用吹風(fēng)機(jī)冷風(fēng)吹干;加適量DEPC水溶解RNA,劇烈振蕩1 min;1%的瓊脂糖凝膠檢測,并使用核酸檢測儀檢測RNA濃度及質(zhì)量。

      使用FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix(TIANGEN,KR118)試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄,合成第一鏈cDNA。根據(jù)試劑盒說明書在冰上配置反轉(zhuǎn)錄混合液,5×FastKing-RT SuperMix 4 μL,Total RNA定量到1 μL,RNase-Free ddH2O補(bǔ)足到20 μL,瞬離至沒有氣泡后放入PCR儀中進(jìn)行以下程序:42 ℃,15 min;95 ℃,3 min。將得到的cDNA放到-20 ℃冰箱保存。

      1.3.2NlHRPEST序列擴(kuò)增 以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板,以該基因在轉(zhuǎn)錄組測序中的預(yù)測序列設(shè)計(jì)引物NlHRP-F和NlHRP-R(表3),通過PCR擴(kuò)增獲得NlHRP的EST序列,PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃,3 min;5個循環(huán)(95 ℃,15 s;74 ℃,60 s);5個循環(huán)(95 ℃,15 s;72 ℃,60 s);5個循環(huán)(95 ℃,15 s;70 ℃,60 s);25個循環(huán)(95 ℃,15 s;68 ℃,60 s);68 ℃,5 min。

      表3 NlHRP序列擴(kuò)增PCR引物Table 3 PCR primer of NlHRP sequence amplification

      1.3.3NlHRP全長cDNA的擴(kuò)增 用HiScript-TS 5′/3′ RACE Kit試劑盒(Vazyme,China)進(jìn)行NlHRP的全長擴(kuò)增。根據(jù)NlHRP的EST序列設(shè)計(jì)RACE引物,NlHRP-R與試劑盒中的通用引物用于5′ cDNA末端的快速擴(kuò)增,NlHRP-F與試劑盒中的通用引物用于3′ cDNA末端的快速擴(kuò)增。擴(kuò)增程序:98 ℃,1 min;25個循環(huán)(98 ℃,10 s;68 ℃,15 s;72 ℃,3 min);72 ℃,5 min。

      取第1輪PCR產(chǎn)物,進(jìn)行巢式PCR。NlHRP-inner-R、NlHRP-inner-F(表3)與試劑盒中的通用巢式引物用于第2輪巢式擴(kuò)增。擴(kuò)增程序:95 ℃,3 min;5個循環(huán)(95 ℃,15 s;74 ℃,60 s);5個循環(huán)(95 ℃,15 s;72 ℃,60 s);5個循環(huán)(95 ℃,15 s;70 ℃,60 s);25個循環(huán)(95 ℃,15 s;68 ℃,60 s);68 ℃,5 min。最終得到的產(chǎn)物通過電泳切膠進(jìn)行回收純化,將回收純化產(chǎn)物連接到pESI-Blunt載體上,轉(zhuǎn)化到DH5ɑ感受態(tài)中,挑選陽性克隆進(jìn)行測序,菌株送往上海生工生物工程公司進(jìn)行測序。

      1.3.4NlHRP的序列分析NlHRP-2開放閱讀框預(yù)測:NCBI ORFFINDER(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/);NlHRP蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測:NCBI Conserved Domain Seach(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi);NlHRP蛋白的信號肽預(yù)測:SignalP-5.0(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0);NlHRP分子量、等電點(diǎn)預(yù)測:網(wǎng)站 Expasy(https://www.expasy.org/resources/protparam);NlHRP蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測:網(wǎng)站 Psipred(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/&psipred_uuid=ef7ef9dc-e415-11ec-a6b3-00163e100d53);NlHRP蛋白序列跨膜區(qū)域預(yù)測:網(wǎng)站DETTAIBIO(http://www.detaibio.com/tools/transmembrane.html)。

      1.3.5 褐飛虱不同組織和不同發(fā)育階段樣品收集 收集羽化24、72、96 h的褐飛虱雌蟲,每個樣品4個生物學(xué)重復(fù)、每個重復(fù)至少含10頭蟲,液氮處理后置于-80 ℃冰箱中保存。

      用醫(yī)學(xué)顯微解剖鑷(5.SA)解剖褐飛虱雌蟲的頭、胸、中腸、脂肪體、卵巢各組織,其中脂肪體放入RNA laterTMRNA Stabilization Reagent(Qiagen,Germany)中保存,其他組織放入液氮中保存。每個樣品4個生物學(xué)重復(fù),每個重復(fù)至少30個蟲體組織,液氮處理后放于-80 ℃冰箱中保存。

      1.3.6NlHRP在褐飛虱不同發(fā)育時期、不同組織中的表達(dá)分析 根據(jù)基因NlHRP預(yù)測的保守結(jié)構(gòu)域序列,通過NCBI Primer-BLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi)設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物。

      將保存在-80 ℃冰箱中不同發(fā)育時期的褐飛虱與褐飛虱組織提取RNA,反轉(zhuǎn)錄,稀釋至50 ng/μL。根據(jù)樣品收集情況,設(shè)計(jì)4個生物學(xué)重復(fù),3個技術(shù)學(xué)重復(fù),Actin作為內(nèi)參基因,使用qNlHRP-F/qNlHRP-R和Actin-F/Actin-R進(jìn)行熒光定量PCR實(shí)驗(yàn),引物序列見表4。根據(jù)試劑盒Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix(Vazyme,China)說明書,在冰上配置qPCR混合液(表4)。使用實(shí)時熒光定量PCR儀,擴(kuò)增程序如下:95 ℃,30 s;40個循環(huán)(95 ℃,10 s;60 ℃,30 s);95 ℃,15 s;60 ℃,1 min;95 ℃,1 s。

      表4 熒光定量PCR反應(yīng)體系Table 4 Reaction system of fluorescent quantitation PCR amplification

      兩個實(shí)驗(yàn)種群間NlHRP表達(dá)量的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 目的基因獲得

      Venn圖顯示,KF30-14影響褐飛虱雌蟲和3齡若蟲的基因中表達(dá)量差異顯著的共有基因31條,同時在雄蟲與雌蟲、若蟲中有表達(dá)量差異顯著的共有基因4條(圖1)。通過對表達(dá)量有顯著差異的基因進(jìn)行分析,為選取與雌蟲生殖相關(guān)的基因,在不含雄蟲的雌蟲與若蟲的表達(dá)量顯著差異的 27條基因中進(jìn)行研究,并在后續(xù)試驗(yàn)中成功克隆出了基因NlHRP。

      圖1 兩種水稻上的褐飛虱表達(dá)量差異顯著的基因Venn圖Fig.1 Venn diagram of genes with remarkably different expression between BPHs in the two rice

      2.2 NlHRP的序列及表達(dá)模式

      2.2.1NlHRP克隆及序列 經(jīng)過對NlHRP全長序列克隆、測序、拼接,獲得了基因NlHRP完整的CDS序列(圖2)。克隆的NlHRP基因全長905 bp,位于褐飛虱2號染色體上。使用NCBI ORFFINDER預(yù)測NlHRP的開放閱讀框,ORF長為837 bp,共編碼278個氨基酸。通過網(wǎng)站Psipred預(yù)測該基因編碼蛋白二級結(jié)構(gòu)(圖3),其中該蛋白包括ɑ-螺旋16.18%、β-折疊2.51%、無規(guī)則卷曲81.29%。用NCBI Conserved Domain Seach發(fā)現(xiàn)NlHRP編碼的蛋白無保守結(jié)構(gòu)域,用SignalP-5.0預(yù)測NlHRP蛋白的信號肽,預(yù)測氨基酸序列中1~19位氨基酸為該蛋白質(zhì)的N端信號肽序列。通過DETTAIBIO網(wǎng)站對蛋白序列中的跨膜區(qū)域進(jìn)行預(yù)測,結(jié)果顯示該蛋白無跨膜結(jié)構(gòu),說明該蛋白可能是一個外分泌蛋白,利用信號肽來引導(dǎo)該蛋白定位分泌到細(xì)胞特定區(qū)間從而行使該蛋白的功能。經(jīng)過網(wǎng)站 Expasy預(yù)測,該基因編碼的蛋白分子量為31.4 kD,等電點(diǎn)為5.02。

      圖2 NlHRP的核苷酸序列及其預(yù)測的氨基酸序列Fig.2 Nucleotide and deduced amino acid sequence of NlHRP

      圖3 NlHRP蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測圖Fig.3 Prediction diagram of secondary structure of NlHRP protein

      2.2.2NlHRP表達(dá)模式 在羽化24、72、96 h時,NlHRP在KF30-14實(shí)驗(yàn)種群的褐飛虱雌蟲的表達(dá)量均高于MH86種群,且在羽化72 h時KF30-14實(shí)驗(yàn)種群的NlHRP表達(dá)量顯著高于MH86實(shí)驗(yàn)種群(圖4)。不同組織的表達(dá)譜分析結(jié)果表明,NlHRP在頭部、中腸、胸部都有較高的表達(dá)豐度,其中頭部表達(dá)量最高(圖5),且NlHRP在KF30-14實(shí)驗(yàn)種群褐飛虱頭部的表達(dá)量顯著高于MH86實(shí)驗(yàn)種群褐飛虱。

      圖4 褐飛虱分別在羽化24、72、96 h時NlHRP的表達(dá)量Fig.4 Expression levels of NlHRP in N.lugens at 24, 72 and 96 h after eclosion

      圖5 NlHRP在褐飛虱不同組織中的表達(dá)量Fig.5 NlHRP expression in different tissues of N.lugens

      3 討論

      褐飛虱缺乏合成組氨酸等 10種必需氨基酸的能力,而褐飛虱的唯一食物來源——水稻韌皮部汁液,并不能提供這些必需的營養(yǎng)物質(zhì)[16]。研究人員對類酵母共生體(YLS)基因組序列分析發(fā)現(xiàn),YLS保留了與宿主高度互補(bǔ)的氨基酸合成途徑,其基因組中存在必需氨基酸生物合成所需的所有基因,因此,YLS作為額外的供應(yīng)源,可以提供褐飛虱無法合成的必需氨基酸[17]。本研究中,我們獲得了褐飛虱的一種編碼富組氨酸蛋白的基因序列——NlHRP。KF30-14種群中羽化72 h的褐飛虱雌蟲與MH86種群中羽化72 h的褐飛虱雌蟲相比,NlHRP表達(dá)量顯著升高,而在兩個種群中的褐飛虱在羽化24 h與96 h時NlHRP表達(dá)量未達(dá)到顯著差異水平,而褐飛虱體內(nèi)的組氨酸是由YLS獨(dú)立合成[18-20],Tang等[21]提出,細(xì)菌內(nèi)共生體也決定了稻飛虱種群對水稻品種的偏好。由于它們在稻飛虱營養(yǎng)中的作用,類酵母共生體(YLS)也被認(rèn)為在稻飛虱(褐飛虱)對抗性水稻品種的毒力適應(yīng)中發(fā)揮作用[22-24],有研究人員發(fā)現(xiàn)在對褐飛虱具有抗性的轉(zhuǎn)基因水稻上取食的褐飛虱YLS密度高于常規(guī)水稻,且研究結(jié)果表明YLS密度會隨著水稻品種的抗性提高而升高[25]。故推測NlHRP蛋白的合成受YLS密度影響,而KF30-14種群的褐飛虱在羽化72 h時,NlHRP表達(dá)量顯著升高現(xiàn)象可能與YLS有關(guān)。

      檢測NlHRP在羽化72 h的褐飛虱雌蟲各組織中的表達(dá)量,結(jié)果顯示KF30-14種群中的褐飛虱頭部中NlHRP表達(dá)量顯著高于MH86種群,且NlHRP在頭部與胸部均出現(xiàn)高表達(dá)現(xiàn)象,說明NlHRP可能與褐飛虱神經(jīng)和降低肌肉氧化損傷有關(guān)[26]。

      上述這些結(jié)果表明NlHRP與轉(zhuǎn)cry30Fa1水稻的抗蟲性有關(guān),而NlHRP蛋白的功能及NlHRP表達(dá)量的變化與轉(zhuǎn)cry30Fa1水稻的抗褐飛虱機(jī)理間的關(guān)系還需要進(jìn)一步的研究。

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