轉(zhuǎn)基因檢測標(biāo)準物質(zhì)研制關(guān)鍵環(huán)節(jié)質(zhì)量控制研究

高芳瑞，王顥潛，李瑞環(huán)，劉 娜，王 永，武玉花，李 亮，趙 新，梁晉剛*

（1.天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院種質(zhì)資源與生物技術(shù)研究所，天津 300381；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部科技發(fā)展中心，北京 100176；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所，武漢 430062；4.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準與檢測技術(shù)研究所，北京 100098）

隨著生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展，其安全性備受社會關(guān)注，對轉(zhuǎn)基因生物安全監(jiān)管工作，也越來越引起重視。轉(zhuǎn)基因檢測標(biāo)準的制定是解決轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測結(jié)果不可比的根本，轉(zhuǎn)基因檢測標(biāo)準包括標(biāo)準檢測方法和標(biāo)準物質(zhì)。標(biāo)準物質(zhì)是具有高度均勻性、良好穩(wěn)定性和量值準確性的一種測量標(biāo)準。因此，轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)準的使用可以保證轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測結(jié)果的有效性和可比性[1]。轉(zhuǎn)基因標(biāo)準物質(zhì)包括基體標(biāo)準物質(zhì)、基因組DNA標(biāo)準物質(zhì)、質(zhì)粒DNA標(biāo)準物質(zhì)?；w標(biāo)準物質(zhì)由純合的轉(zhuǎn)基因植物材料和非轉(zhuǎn)基因植物材料按特定的質(zhì)量比例混合配置而成，是一類最早被廣泛應(yīng)用的標(biāo)準物質(zhì)。基體標(biāo)準物質(zhì)的優(yōu)勢具有與測試樣品相似的物理和化學(xué)性質(zhì)，減少了由基質(zhì)效應(yīng)引起的誤差，使檢測結(jié)果更可靠、穩(wěn)定[2]。轉(zhuǎn)基因生物 DNA標(biāo)準物質(zhì)是以葉片提取的DNA制備形成的標(biāo)準物質(zhì)?；蚪MDNA標(biāo)準物質(zhì)最大的優(yōu)點是結(jié)構(gòu)穩(wěn)定耐儲存，熒光定量PCR法使用時操作簡便，缺點是需要大規(guī)模的提取和基因組DNA的質(zhì)量評價，研制過程繁瑣，只能用于核酸檢測，不能用于蛋白質(zhì)檢測[3]。質(zhì)粒DNA標(biāo)準物質(zhì)是由重組質(zhì)粒DNA制備的，該重組質(zhì)粒DNA包含某些轉(zhuǎn)基因植物的外源基因片段和內(nèi)源標(biāo)準基因片段，用于檢測轉(zhuǎn)基因成分。比利時科學(xué)家Isabel Taverniers 最早提出質(zhì)粒 DNA 標(biāo)準物質(zhì)的想法[4]。質(zhì)粒DNA標(biāo)準物質(zhì)的主要優(yōu)點是可以通過微生物培養(yǎng)進行大量繁殖并且本身不易被降解，操作過程所需的設(shè)備成本比較低廉、簡單易控制[5]。單個質(zhì)粒 DNA 標(biāo)準物質(zhì)上所具有的多靶位點可以同時檢測多個轉(zhuǎn)基因?qū)ο?，只要確定轉(zhuǎn)基因成分的目標(biāo)序列（無需轉(zhuǎn)基因植物原料）就能夠快速便捷地構(gòu)建檢測轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的質(zhì)粒標(biāo)準物質(zhì)。然而隨著研究的推進，質(zhì)粒 DNA 標(biāo)準物質(zhì)檢測的缺點也不斷增多，如容易污染和檢測誤差較大（因為待測樣與質(zhì)粒標(biāo)準物大小差異懸殊，相比基體標(biāo)準物的檢測結(jié)果兩者并不吻合）等[6]。

轉(zhuǎn)基因檢測標(biāo)準物質(zhì)的研制關(guān)鍵環(huán)節(jié)尤為重要，技術(shù)要求較高。國外尤其是歐美國家自從20世紀開始，就不斷地更新和完善轉(zhuǎn)基因檢測標(biāo)準和標(biāo)準物質(zhì)。國際上研制轉(zhuǎn)基因檢測標(biāo)準物質(zhì)的單位較少，主要的研制單位有歐盟委員會聯(lián)合研究中心標(biāo)準物質(zhì)與測量研究院（IRMM）和美國的 AOCS（美國油脂化學(xué)家學(xué)會）[7]。自 2008年以來，國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項立項《轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測標(biāo)準物質(zhì)研制》課題，已研制了93種標(biāo)準物質(zhì)，獲得國家級標(biāo)準物質(zhì)證書21項。目前，已經(jīng)積累了一定的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測標(biāo)準物質(zhì)研制經(jīng)驗。

轉(zhuǎn)基因標(biāo)準物質(zhì)證書的申報是一直以來的疑難點，急需進一步加快申報的進度。綜上可知，轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)準物質(zhì)的缺乏，已成為制約我國轉(zhuǎn)基因生物檢測技術(shù)應(yīng)用與發(fā)展的主要技術(shù)瓶頸。本文將對國內(nèi)外轉(zhuǎn)基因植物標(biāo)準物質(zhì)的研究現(xiàn)狀及不同種類的標(biāo)準物質(zhì)申報關(guān)鍵點進行闡述，以期為我國轉(zhuǎn)基因標(biāo)準物質(zhì)進一步的研制應(yīng)用提供技術(shù)支撐。

1 國內(nèi)外轉(zhuǎn)基因標(biāo)準物質(zhì)的種類及特點

1.1 國外轉(zhuǎn)基因標(biāo)準物質(zhì)研發(fā)概況

歐盟標(biāo)準物質(zhì)主要指以歐盟IRMM為核心，在歐盟資金支持下研發(fā)的標(biāo)準物質(zhì)，具有以BCR、ERM或 IRMM 開頭的標(biāo)準物質(zhì)編號。歐盟研發(fā)的標(biāo)準物質(zhì)有基體和質(zhì)粒這兩種形態(tài)的標(biāo)準物質(zhì)。目前在售的ERM標(biāo)準物質(zhì)有146種，涵蓋了大豆、玉米、棉花、馬鈴薯、甜菜等42個轉(zhuǎn)化體（表1）。

表1 以轉(zhuǎn)化體計不同國家/地區(qū)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)準物質(zhì)情況Table 1 Production of gmos standard materials in different countries/regions by transformants

美國的AOCS主要研制純品形式的標(biāo)準物質(zhì)，有純陰性和純陽性兩種類型。他們認為這種策略最精確、最實用，完全可以滿足監(jiān)管需要。研發(fā)商生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)準物質(zhì)在認證后可以向外出售，目前在售的標(biāo)準物質(zhì)有53種，涵蓋了37個轉(zhuǎn)化體，純品粉末50歐元/g，純品DNA100歐元/μg。

日本的轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)準物質(zhì)的管理評價體系和我國不同，其研制的標(biāo)準物質(zhì)不需要通過專門的管理機構(gòu)進行評定和審批，研制的標(biāo)準物質(zhì)機構(gòu)必須具備標(biāo)準物質(zhì)制備和生產(chǎn)的資質(zhì)。目前，共制備了3個基體標(biāo)準物質(zhì)和2個質(zhì)粒標(biāo)準物質(zhì)。

1.2 我國轉(zhuǎn)基因檢測標(biāo)準物質(zhì)研制概況

早在2006年，大連出入境檢驗檢疫局制備了轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2種子粉末兩種二級有證標(biāo)準物質(zhì)，現(xiàn)已停產(chǎn)。隨著我國轉(zhuǎn)基因作物研發(fā)和監(jiān)管工作的開展，特別是 2008年轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項啟動后，對轉(zhuǎn)基因標(biāo)準物質(zhì)的需求更加迫切。因此，國家啟動了轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測標(biāo)準物質(zhì)研制工作。目前，已建立了成熟的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標(biāo)準物質(zhì)研制技術(shù)體系，獲得了國家級標(biāo)準物質(zhì)證書21項（表2），涵蓋候選物鑒定、制備、聯(lián)合定值、不確定度評估、試用性評價等關(guān)鍵環(huán)節(jié)，發(fā)布了一系列技術(shù)標(biāo)準[8-16]。我國研制了4種類型的標(biāo)準物質(zhì)（表3），為轉(zhuǎn)基因生物安全性評價和監(jiān)測提供了有利的技術(shù)支撐。

表2 我國轉(zhuǎn)基因標(biāo)準物質(zhì)有證一覽表Table 2 List of certified gmo standard substances in China

表3 不同類型標(biāo)準物質(zhì)的研制過程差異Table 3 Comparison of the development process of different types of reference materials

2 轉(zhuǎn)基因標(biāo)準物質(zhì)申報關(guān)鍵控制點

2.1 轉(zhuǎn)基因標(biāo)準物質(zhì)申報要求

標(biāo)準物質(zhì)申報的技術(shù)文件和樣品的要求主要包括九個方面（表4），其中對標(biāo)準物質(zhì)研制機構(gòu)具有嚴格的要求。主要體現(xiàn)在組織管理、文件控制等管理要求及人、機、料、法、環(huán)等技術(shù)要求。

表4 標(biāo)準物質(zhì)申報的技術(shù)文件和樣品的要求Table 4 Technical documents and sample requirements for reference substance declaration

2.2 不同種類標(biāo)準物質(zhì)研制過程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)

2.2.1 原材料繁殖鑒定

2.2.1.1 基體標(biāo)準物質(zhì)原材料繁殖鑒定 為了保證基體標(biāo)準物質(zhì)的質(zhì)量，要求候選物應(yīng)選用可繁殖的材料，如種子的重量應(yīng)不少于2.5 kg；選擇同一物種同一組織器官；典型性、轉(zhuǎn)化體純度和轉(zhuǎn)化體純合度應(yīng)滿足待定特性量的量值范圍要求。轉(zhuǎn)基因植物原材料的轉(zhuǎn)化體特異性結(jié)果為陽性，其他轉(zhuǎn)化體特異性檢測結(jié)果為陰性，對應(yīng)的非轉(zhuǎn)基因原材料的轉(zhuǎn)化體檢測結(jié)果和其他轉(zhuǎn)化體檢測結(jié)果為陰性，表明原材料的典型性符合要求。選擇具有資質(zhì)的檢測機構(gòu)進行繁殖鑒定，按照NY/T673的規(guī)定抽取轉(zhuǎn)基因植物基體標(biāo)準物質(zhì)候選物鑒定的樣品，典型性鑒定取樣個體數(shù)不少于3000，混合均勻，充分研磨；轉(zhuǎn)化體純度和純合度鑒定取樣個體數(shù)不少于300，進行單粒研磨或取單株葉片研磨。按照特定的轉(zhuǎn)化體特異性檢測方法，對轉(zhuǎn)基因植物候選物進行轉(zhuǎn)化體特異性檢測，記錄含特定轉(zhuǎn)化體個體數(shù)，計算轉(zhuǎn)化體純度，達到95%以上表明原材料符合要求。利用適用于轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)化體純合度檢測的方法，公式計算如：

其中a代表含特定轉(zhuǎn)化體個體數(shù)，b代表純合體個體數(shù)?；w原材料的轉(zhuǎn)基因成分含量估算值不低于待定特性量值，表明該原材料的轉(zhuǎn)化體純度和轉(zhuǎn)化體純合度符合要求。

2.2.1.2 基因組DNA標(biāo)準物質(zhì)原材料繁殖鑒定 對于基因組標(biāo)準物質(zhì)的侯選物鑒定，選用基因組DNA含量高，易于大量提取DNA的組織作為原材料，如葉片；對采集葉片的轉(zhuǎn)基因單株，逐一進行典型性鑒定和基因型鑒定，采集純合單株的葉片作為原材料；侯選物要完整性好，純度高，濃度大于100 ng/μL，無PCR反應(yīng)抑制物。

2.2.1.3 質(zhì)粒標(biāo)準物質(zhì)原材料繁殖鑒定 與基體、基因組DNA、種子形態(tài)標(biāo)準物質(zhì)相比，質(zhì)粒DNA具有不受原材料限制的特點，可以通過微生物進行大量培養(yǎng)，DNA易于擴增，生產(chǎn)制備容易，穩(wěn)定性好。將檢測靶標(biāo)通過人工合成或PCR擴增等技術(shù)構(gòu)建到質(zhì)粒分子上。通過測序、酶切、擴增等方法篩選陽性質(zhì)粒分子，并對陽性質(zhì)粒分子進行特異性、靈敏度和可替代性測試，均符合要求的重組質(zhì)粒，可作為質(zhì)粒DNA標(biāo)準物質(zhì)的侯選物。

2.2.2 標(biāo)準物質(zhì)樣品制備

2.2.2.1 基體標(biāo)準物質(zhì)樣品制備 標(biāo)準物質(zhì)原材料經(jīng)過鑒定合格之后，開始標(biāo)準物質(zhì)的制備過程，基體標(biāo)準物質(zhì)參照《農(nóng)業(yè)部1782號公告-8-2012轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測基體標(biāo)準物質(zhì)制備技術(shù)規(guī)范》中的相關(guān)要求進行研制，技術(shù)路線見圖1所示。關(guān)鍵點包括以下幾項：

圖1 基體標(biāo)準物質(zhì)候選物研制技術(shù)路線Fig.1 Technical route of preparation of matrix reference material candidate

（1）含水量測定

原材料經(jīng)冷凍研磨，90%以上粉末小于180 μm，在冷凍真空干燥后，對粉末進行含水量的測定，取樣量不少于3個點，要求水分含量不高于10%。

（2）配比混勻和均勻性初檢

轉(zhuǎn)基因基體標(biāo)準物質(zhì)設(shè)置不同的質(zhì)量濃度，在進行質(zhì)量配比時，需要將含水量和原材料純度等因素考慮在內(nèi)。要求環(huán)境溫度不超過30 ℃、相對濕度不超過40%，利用固體粉末混合儀充分混合均勻。由于基體標(biāo)準物質(zhì)候選物不易混勻，所以在分裝之前需要進行均勻性初檢?；w標(biāo)準物質(zhì)在混勻過程中每隔 6 h取樣一次，共取樣4次，每次選不同的部位取樣，共取樣9份，每份取樣100 mg。提取樣品基因組DNA，采用熒光定量PCR方法測試9份樣品中轉(zhuǎn)化體特異性序列拷貝數(shù)與內(nèi)標(biāo)基因拷貝數(shù)的比值，利用F檢驗法考察每個時間點上9份樣品的差異。樣品是否混勻，以基體標(biāo)準物質(zhì)含量是否均勻來進行考察。均勻性初檢合格后方可分裝成最小包裝單元。

2.2.2.2 基因組標(biāo)準物質(zhì)樣品制備 經(jīng)過典型性和基因型鑒定之后，對鑒定的純合單株掛牌標(biāo)記，當(dāng)植株進入營養(yǎng)生長的旺盛期，采集葉片，用于基因組DNA的大量提取?；蚪M標(biāo)準物質(zhì)參照《農(nóng)業(yè)部111號公告-1-2018轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測基因組DNA標(biāo)準物質(zhì)制備技術(shù)規(guī)范》中的相關(guān)要求進行研制。關(guān)鍵點包括以下幾項：

（1）基因組DNA的提取

采用經(jīng)驗證的CTAB法或基因組大量提取試劑盒，提取的DNA充分溶解在0.1X TE 稀釋緩沖液中。

（2）基因組質(zhì)量評估

采用凝膠電泳法進行DNA分子質(zhì)量的檢測，要求基因組DNA主帶清晰、無明顯彌散、無RNA雜帶；用紫外分光光度法評價提取的基因組DNA純度，要求OD260/OD280在1.8～2.0，OD260/OD230大于等于2.0；用熒光染料法測定提取的DNA濃度，基因組DNA濃度值要大于100 ng/μL。將提取的基因組DNA梯度稀釋，繪制檢測靶標(biāo)的標(biāo)準曲線，計算PCR擴增效率，擴增效率在90%～110%，證明DNA溶液中沒有PCR反應(yīng)抑制物。

2.2.2.3 質(zhì)粒DNA標(biāo)準物質(zhì)樣品制備 質(zhì)粒DNA標(biāo)準物質(zhì)參照《農(nóng)業(yè)部公告號第323號-8-2020轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測質(zhì)粒DNA標(biāo)準物質(zhì)制備技術(shù)規(guī)范》中的相關(guān)要求進行研制。關(guān)鍵點包括以下幾項：

（1）重組質(zhì)粒構(gòu)建和驗證

首先獲得轉(zhuǎn)基因植物外源基因序列和物種內(nèi)標(biāo)準基因序列，根據(jù)序列設(shè)計帶有酶切位點的引物，利用PCR擴增，將目的片段酶切、連接、重組整合進入基礎(chǔ)質(zhì)粒載體。

（2）重組質(zhì)粒DNA擴繁與DNA純化

圖2 基因組DNA標(biāo)準物質(zhì)制備技術(shù)路線圖Fig.2 Genomic DNA standard material preparation technology roadmap

圖3 質(zhì)粒DNA標(biāo)準物質(zhì)制備技術(shù)路線圖Fig.3 Technical roadmap for preparation of plasmid DNA standard materials

將重組質(zhì)粒菌種接種于對應(yīng)的1～5 L選擇培養(yǎng)液，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，收獲菌體；利用堿裂解法或試劑盒法提取和純化重組DNA；將質(zhì)粒DNA用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶純化獲得線性質(zhì)粒DNA；將純化獲得的重組質(zhì)粒DNA進行Sanger測序序列分析，獲得完整的質(zhì)粒序列；確認和預(yù)期構(gòu)建的重組質(zhì)粒DNA序列的正確性。

（3）質(zhì)粒DNA質(zhì)量評價與濃度測定

質(zhì)粒DNA質(zhì)量評價與基因組DNA相同，采用紫外光吸收法。利用熒光定量PCR法評價質(zhì)粒DNA質(zhì)量，將純化的質(zhì)粒DNA溶液用水或TE緩沖液稀釋5個濃度梯度。以梯度稀釋的質(zhì)粒DNA溶液為模板，進行內(nèi)標(biāo)準基因定量 PCR擴增，繪制標(biāo)準曲線，考察檢測靶標(biāo)的擴增效率。利用熒光染料標(biāo)記定量法PicoGreen測定重組質(zhì)粒DNA的濃度。純化的質(zhì)粒濃度不低于100 ng/μL，均符合要求后，用于標(biāo)準物質(zhì)的分裝。

2.2.3 標(biāo)準物質(zhì)的均勻性評估 抽取的單元分布對同一批的樣品具有足夠的代表性，抽取單元數(shù)取決于總體樣品的單元數(shù)和對樣品均勻程度的了解，抽取單元數(shù)與總體單元數(shù)[17]的對應(yīng)關(guān)系見表5。

表5 抽取單元數(shù)與總體單元數(shù)的對應(yīng)關(guān)系Table 5 Extract the corresponding relationship between the number of units and the total number of units

采用具有足夠靈敏度的測量方法進行均勻性檢驗，均勻性檢驗應(yīng)在重復(fù)性條件下（同一操作者，同一臺儀器，同一測量方法，在短期內(nèi)）完成。每一最小包裝單元內(nèi)稱取不少于3份試樣進行測定，測量次序應(yīng)隨機化，避免測量系統(tǒng)在不同時間的變差干擾對試樣均勻性的評價。

測定抽取的每個樣品中轉(zhuǎn)化體特異性序列拷貝數(shù)、內(nèi)標(biāo)基因拷貝數(shù)的比值，對均勻性檢驗中的試驗結(jié)果進行方差分析（F檢驗），計算單元內(nèi)方差和單元間方差，根據(jù)二者的比值計算F值。根據(jù)自由度（v1，v2）及給定的顯著性水平α（取0.05），查F分布表，得臨界Fα值。比較F值和Fa的大小，若F≤Fα，單元間方差與單元內(nèi)方差無顯著性差異，樣品均勻；若F≥Fα，單元間方差與單元內(nèi)方差有顯著性差異，樣品不均勻。對不均勻的樣品查找原因并解決問題后進行再處理，分裝成最小單元，按上述要求和方法再次進行均勻性檢驗。

通常將均勻性評估中使用的樣品量規(guī)定為該標(biāo)準物質(zhì)使用時的最小取樣量，基體標(biāo)準物質(zhì)的最小取樣量為100 mg，基因組DNA標(biāo)準物質(zhì)和質(zhì)粒標(biāo)準物質(zhì)的最小取樣量不低于2 μL。

2.2.4 穩(wěn)定性評估 穩(wěn)定性是標(biāo)準物質(zhì)的基本屬性，用于描述標(biāo)準物質(zhì)的特性值隨時間變化的性質(zhì)，即描述標(biāo)準物質(zhì)特性的時間分布特征。在標(biāo)準物質(zhì)的研制過程中必須進行穩(wěn)定性評估，穩(wěn)定性檢驗應(yīng)在均勻性檢驗證明樣品充分均勻后進行。申報國家二級標(biāo)準物質(zhì)，穩(wěn)定性應(yīng)在6個月以上；申報國家一級標(biāo)準物質(zhì)，穩(wěn)定性應(yīng)在 12個月以上。標(biāo)準物質(zhì)應(yīng)在規(guī)定的保存或使用條件下，定期進行特性量值的穩(wěn)定性檢驗，采用符合精密度要求的定量PCR方法進行測定。

2.2.5 定值 轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品檢測基體標(biāo)準物質(zhì)有兩個特性量值，分別為轉(zhuǎn)基因粉末和粉末總量的質(zhì)量分數(shù)，以及單倍體基因組中外源插入基因拷貝數(shù)與內(nèi)標(biāo)基因的比值?；蚪MDNA標(biāo)準物質(zhì)和質(zhì)粒標(biāo)準物質(zhì)也有兩個特性量值，分別是DNA分子或質(zhì)粒分子的拷貝數(shù)濃度、外源基因拷貝數(shù)和內(nèi)標(biāo)基因拷貝數(shù)的比值。拷貝數(shù)比值和拷貝數(shù)濃度由多家實驗室采用微滴數(shù)字PCR技術(shù)，分別獲得單倍體基因組中外源插入基因與內(nèi)標(biāo)基因的拷貝數(shù)濃度，計算拷貝數(shù)比值?；w標(biāo)準物質(zhì)的質(zhì)量分數(shù)通過天平稱量獲得，可作為標(biāo)準物質(zhì)的參考值。

2.2.5.1 計量學(xué)溯源性描述 轉(zhuǎn)基因基體標(biāo)準物質(zhì)所采用的重量法是將干燥后的轉(zhuǎn)基因種子粉末和非轉(zhuǎn)基因種子粉末按照一定質(zhì)量配比得到質(zhì)量分數(shù)作為該基體標(biāo)準物質(zhì)的標(biāo)準值，該標(biāo)準值通過使用校準后的天平通過溯源鏈溯源到國際SI單位千克?？截悢?shù)濃度測量值通過計量或校準后的移液器及數(shù)字PCR等儀器測量，通過溯源鏈溯源到自然數(shù)“1”。

2.2.5.2 定值方法的選擇 基體標(biāo)準物質(zhì)的質(zhì)量分數(shù)通過天平稱量法確定，天平稱量法是一種基準方法，可由一家實驗室進行多次稱量定值。數(shù)字PCR是一種不依賴于標(biāo)準物質(zhì)和標(biāo)準曲線的DNA拷貝數(shù)的絕對定量技術(shù)，在標(biāo)準物質(zhì)制備方面，數(shù)字PCR已成功應(yīng)用于白血病診斷基因組DNA標(biāo)準物質(zhì)（SRM2373）的定值，并得到了可靠的鑒定結(jié)果。轉(zhuǎn)基因基體標(biāo)準物質(zhì)的定值采用數(shù)字 PCR方法進行定值。JJG 1006中要求采用多家實驗室合作定值時，當(dāng)采用同一種方法時，獨立定值組數(shù)一般不少于8家，當(dāng)采用多種方法定值測量時，一般不少于6家。對于轉(zhuǎn)基因基體標(biāo)準物質(zhì)，采用數(shù)字PCR方法進行定值，參加定值的實驗室應(yīng)不少于8家。

2.2.5.3 參加數(shù)字PCR聯(lián)合定值單位的要求 a）參加定值實驗室配備了數(shù)字PCR設(shè)備，有熟練操作數(shù)字PCR設(shè)備的技術(shù)人員，能夠?qū)?shù)字PCR的檢測過程進行有效的質(zhì)量控制；b）對參加定值實驗室組織數(shù)字PCR定值能力評估，證明實驗室具備利用數(shù)字PCR進行測量的能力；c）對定值方法進行確認，采用熒光定量PCR考察轉(zhuǎn)化體特異性和內(nèi)標(biāo)準基因檢測方法的擴增效率，保證二者的擴增效率接近；d）考察數(shù)字PCR系統(tǒng)的適用性，在數(shù)字PCR平臺上用確認的定量方法檢測純品DNA樣品的拷貝數(shù)比值，測量結(jié)果接近理論值；e）確定數(shù)字PCR的有效動力學(xué)范圍，微流體芯片數(shù)字PCR的有效線性范圍是200～700個陽性孔，對應(yīng)約240～1800個拷貝的初始模版數(shù)，確定將初始模版稀釋到300～1200 copies/μL，加1.8 μL到反應(yīng)體系中；微滴式數(shù)字PCR的有效線性范圍是1～65000個拷貝，20 μL反應(yīng)液在微滴生成器中只能生產(chǎn)12000～16000個有效微滴，只有微滴數(shù)大于10000時才具有統(tǒng)計學(xué)意義，Quality score值需低于0.85。

2.2.5.4 測量數(shù)據(jù)評估及標(biāo)準值的確定 轉(zhuǎn)基因基體標(biāo)準物質(zhì)測量數(shù)據(jù)的處理參考JJF1342-2012標(biāo)準物質(zhì)定值的通用原則及統(tǒng)計學(xué)原理的要求。

（1）實驗室內(nèi)數(shù)據(jù)可疑值檢驗

獲得數(shù)據(jù)后，先進行實驗室內(nèi)數(shù)據(jù)可疑值檢驗。推薦采用狄克遜法和格拉布斯法兩種方法判斷可疑值并剔除。

（2）實驗室間數(shù)據(jù)可疑值檢驗

計算各實驗室的測量平均值，采用狄克遜法和格拉布斯法兩種方法對實驗室測量平均值進行檢驗，判斷各實驗室平均值是否有可疑值。

（3）正態(tài)性分布檢驗

對測定數(shù)據(jù)進行正態(tài)性分布檢驗，采用夏皮洛-威爾克（Shapiro-Wilk）法或達戈斯提諾法（D’Agostoon）進行正態(tài)分布檢驗。

（4）實驗室間數(shù)據(jù)等精度檢驗

采用科克倫法檢驗各家實驗室實驗數(shù)據(jù)平均值是否等精度，若數(shù)據(jù)等精度，則可計算所有數(shù)據(jù)的平均值，作為標(biāo)準物質(zhì)的標(biāo)準值。

（5）標(biāo)準值的確定

試驗數(shù)據(jù)結(jié)果通過了以上檢驗后，計算總平均值和總標(biāo)準差，總平均值作為基體標(biāo)準物質(zhì)的標(biāo)準值，總標(biāo)準差作為聯(lián)合定值的不確定度。

2.2.6 不確定度的評定

2.2.6.1 均勻性引入的不確定度評定 由標(biāo)準物質(zhì)均勻性產(chǎn)生的標(biāo)準偏差用下式進行計算：

2.2.6.2 穩(wěn)定性引入的不確定度評定 采用趨勢分析法進行穩(wěn)定性檢驗時，將標(biāo)準物質(zhì)穩(wěn)定性引入的不確定度us按照下式進行計算：us＝s（β1）·X

2.2.6.3 定值引入的不確定度評定 定值不確定度包括A類不確定度和B類不確定度。不確定度的A類評定通過測量數(shù)據(jù)的標(biāo)準偏差、測量次數(shù)及所要求的置信水平按照統(tǒng)計學(xué)計算方法進行，標(biāo)準不確定度B類評定是通過借助可利用的相關(guān)信息，進行科學(xué)的分析判斷而得到的標(biāo)準偏差。

2.2.6.4 合成標(biāo)準不確定度 基體標(biāo)準物質(zhì)定值結(jié)果的總不確定度由3部分組成，分別為：標(biāo)準物質(zhì)定值過程中帶來的A類和B類不確定度的合成不確定度uc；標(biāo)準物質(zhì)不均勻性引起的標(biāo)準不確定度ubb；有效期內(nèi)不穩(wěn)定性引起的標(biāo)準不確定度us。合成標(biāo)準不確定度為：

2.3 標(biāo)準物質(zhì)研制報告的編寫規(guī)則

研制報告的結(jié)構(gòu)包含以下部分：封面、摘要、目錄、概述（或引言）、標(biāo)準物質(zhì)樣品制備、均勻性檢驗、穩(wěn)定性檢驗、定值、不確定度評定、結(jié)果表達、附件。

研制報告的內(nèi)容具有科學(xué)、完整、易讀及數(shù)據(jù)準確的特點，報告中采用的計量單位符合國家發(fā)布的《中華人民共和國法定計量單位》的要求，并按《中華人民共和國計量單位使用方法》執(zhí)行。報告中使用的術(shù)語、符號、代號應(yīng)遵照國家有關(guān)標(biāo)準和技術(shù)規(guī)范執(zhí)行，報告中使用新的專業(yè)術(shù)語、縮略詞應(yīng)加以注釋，報告的圖、表和照片應(yīng)確保能夠完整清晰復(fù)制或計算機掃描。

2.4 標(biāo)準物質(zhì)證書和標(biāo)簽的要求

標(biāo)準物質(zhì)證書是介紹標(biāo)準物質(zhì)的技術(shù)文件，內(nèi)容和形式應(yīng)符合標(biāo)準物質(zhì)管理及技術(shù)要求，并確保與所研制的標(biāo)準物質(zhì)一同發(fā)放給用戶。證書中必須包含以下幾個部分：量值和不確定度、原材料來源和制備工藝、均勻性和穩(wěn)定性檢驗、特性量值的測量方法、溯源性描述、預(yù)期用途、使用方法及安全警示等。

證書的表述遵守以下要求：a）文字表達結(jié)構(gòu)嚴謹、用詞準確、簡潔清晰，不產(chǎn)生歧義；b）所用術(shù)語、符號、代號等要統(tǒng)一，始終表達同一概念；c）按照國家規(guī)定使用計量單位名稱與符號、量的名稱與符號、不確定度的名稱與符號；d）公式、圖表、數(shù)據(jù)準確無誤。

標(biāo)簽應(yīng)可靠附著在每個標(biāo)準物質(zhì)最小包裝單元上，并包含正確識別該標(biāo)準物質(zhì)所需的必要基本信息（如標(biāo)準物質(zhì)編號、名稱、批次編號、研制機構(gòu)等）。必要時應(yīng)包含相關(guān)法律、法規(guī)所要求的健康和安全信息。

3 總結(jié)與展望

3.1 緊跟技術(shù)發(fā)展，拓寬研制領(lǐng)域

自2008年以來，我國啟動了轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項“轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測標(biāo)準物質(zhì)研制”，建立了成熟的研制技術(shù)體系，成功研制了一批標(biāo)準物質(zhì)[18]。轉(zhuǎn)基因新技術(shù)的突破加速了新產(chǎn)品的換代升級，新型轉(zhuǎn)基因技術(shù)產(chǎn)品的監(jiān)管和質(zhì)量監(jiān)測是轉(zhuǎn)基因技術(shù)產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的新需求和新挑戰(zhàn)。新的基因編輯技術(shù)的突破，促進了轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品研發(fā)由抗蟲、抗除草劑等一代產(chǎn)品向營養(yǎng)品質(zhì)改善、產(chǎn)量提高、耐貯藏以及工業(yè)和醫(yī)藥等新產(chǎn)品的換代升級。多基因復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因技術(shù)新產(chǎn)品逐漸出現(xiàn)，已成為研發(fā)和應(yīng)用重點，對新型轉(zhuǎn)基因技術(shù)產(chǎn)品的監(jiān)管和質(zhì)量監(jiān)測需要新的轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)和標(biāo)準物質(zhì)。解美霞等[19]以基因編輯水稻為研究對象，構(gòu)建了野生型和編輯型質(zhì)粒對照，在野生型樣品中沒有A堿基，而在編輯型樣品中檢測到該堿基。美國轉(zhuǎn)基因三文魚的商業(yè)化推動了轉(zhuǎn)基因動物產(chǎn)品的產(chǎn)業(yè)化，轉(zhuǎn)基因動物產(chǎn)品的產(chǎn)業(yè)化進程逐漸加快。另外利用轉(zhuǎn)基因山羊、兔、雞生產(chǎn)的蛋白藥物已經(jīng)陸續(xù)獲準上市，專項中研發(fā)的轉(zhuǎn)基因豬、牛、羊等也逐步成熟，走向產(chǎn)業(yè)化。新型生物技術(shù)產(chǎn)品的研發(fā)及轉(zhuǎn)基因動物的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用，亟待進一步拓寬標(biāo)準物質(zhì)的研制領(lǐng)域?；诙繕?biāo)識需求的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測新技術(shù)標(biāo)準制定，多糖、多酚、多油脂等復(fù)雜基質(zhì)中多靶標(biāo)基因同時檢測新技術(shù)，也亟待加強新標(biāo)準物質(zhì)的研制。

3.2 加強合作共贏，建立交流機制

為了加強我國轉(zhuǎn)基因檢測標(biāo)準物質(zhì)研發(fā)技術(shù)的先進性，避免重復(fù)研制，建議建立國內(nèi)外合作交流機制。以信息交換、聯(lián)合攻關(guān)為重點，在實現(xiàn)資源共享的同時，優(yōu)勢互補，不僅可以提高標(biāo)準物質(zhì)的質(zhì)量，也對未來全球標(biāo)準物質(zhì)的發(fā)展、標(biāo)準物質(zhì)的申報推進意義重大。積極參與或組織國際量值比對，推動我國研制的有證標(biāo)準物質(zhì)走向國際，促進定值和定量結(jié)果的國際互認，暢通國內(nèi)外貿(mào)易。

3.3 促進成果應(yīng)用，推進產(chǎn)業(yè)發(fā)展

轉(zhuǎn)基因檢測標(biāo)準物質(zhì)可以應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測方法研究、轉(zhuǎn)基因檢測實驗室間研究、轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品定量檢測數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制等。轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的定量標(biāo)識為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的監(jiān)管和質(zhì)量監(jiān)督提供了量化工具，轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)和標(biāo)準建立面臨新需求和新的挑戰(zhàn)。定量標(biāo)識是轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品監(jiān)管的有效手段，也是國際貿(mào)易的有效壁壘。隨著數(shù)字PCR等新的基因檢測技術(shù)、三代序列測定技術(shù)等新技術(shù)的出現(xiàn)和成熟，定量標(biāo)識逐漸成為了轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品監(jiān)管的有力工具。轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的定量檢測實際上經(jīng)歷了抽樣、樣品前處理、DNA提取純化、PCR檢測、數(shù)據(jù)分析等步驟，最終得到了轉(zhuǎn)基因含量值，而這些步驟都會給最終轉(zhuǎn)基因含量帶來影響。因此急需建立標(biāo)準物質(zhì)信息共享推廣平臺，促進標(biāo)準物質(zhì)的推廣應(yīng)用，提高各檢測機構(gòu)的定量準確性、可靠性和可比性，實現(xiàn)定量檢測結(jié)果的國際互認。