鄭雪芳，陳燕萍，肖榮鳳，陳梅春，陳 崢，劉欣，王階平，劉 波

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所, 福州 350003）

青枯雷爾氏菌Ralstonia solanacearum（簡(jiǎn)稱(chēng)青枯菌）可導(dǎo)致多種重要經(jīng)濟(jì)作物毀滅性枯萎[1]，在世界范圍內(nèi)，尤其是中國(guó)危害極大，嚴(yán)重威脅世界農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展[2]。青枯菌因其侵染性強(qiáng)，寄主范圍大，地域分布廣，生存能力強(qiáng)，被認(rèn)為是世界上危害最大植物病原菌之一[3]。由青枯菌引起的茄科作物青枯病在我國(guó)南方地區(qū)普遍發(fā)生，其中以福建、廣東、湖南、浙江及廣西危害最為嚴(yán)重[4]。隨著全球氣侯變?，世界范圍內(nèi)青枯病發(fā)生危害呈現(xiàn)越來(lái)越嚴(yán)重的趨勢(shì)。

青枯菌是一個(gè)非常復(fù)雜的類(lèi)群，呈現(xiàn)出高度種下分化的多態(tài)性。例如，根據(jù)寄主范圍差異，可將青枯菌分為5個(gè)生理小種[5]；根據(jù)青枯菌對(duì)3種雙糖（麥芽糖、乳糖、纖維二糖）和3種已醇（甘露醇、山梨醇、甜醇）的氧化能力，可將其劃分為6個(gè)生化型[6,7]。Fegan和Prior[8]根據(jù)青枯菌的基因型提出了演化型分類(lèi)框架，通過(guò)特異性多重 PCR將青枯菌劃分為 4個(gè)主要的演化型，并根據(jù)內(nèi)源葡聚糖酶基因（endoglucanase gene，egl）的序列相似性確定序列變種。Safni等[9]綜合生理生化分析、脂肪酸測(cè)定、16S rRNA序列、egl基因序列和DNA雜交分析結(jié)果，將青枯菌的不同菌株進(jìn)行了重新分類(lèi)和命名，包括演化型Ⅰ和Ⅲ的Ralstonia pseudosolanacearum，演化型Ⅱ的Ralstonia solanacearum，演化型Ⅳ的R.syzygiisubsp.celebesensis、R.syzygiisubsp.syzygii和R.syzygiisubsp.indonesiensis。

放線菌是產(chǎn)生天然生物活性物質(zhì)的重要微生物資源[10]。據(jù)報(bào)道，微生物來(lái)源的生物活性物質(zhì)中，約70%由放線菌產(chǎn)生，且這些放線菌中的 80%是鏈霉菌[11]。鏈霉菌具有促進(jìn)植株生長(zhǎng)（Plant growth promoting,PGP）和/或病害生防作用，在農(nóng)業(yè)研究領(lǐng)域越來(lái)越受到重視[12]。一些鏈霉菌如金色鏈霉菌Streptomyces aureofaciens、阿維鏈霉菌Streptomyces avermitilis、潮濕鏈霉菌Streptomyces humidus、吸水鏈霉菌Streptomyces hydroscopicus、鉛青鏈霉菌Streptomyces lividans、利迪鏈霉菌Streptomyces lydicus、橄欖綠鏈霉菌Streptomyces olivaceoviridis、褶皺鏈霉菌Streptomyces plicatus、玫瑰黃鏈霉菌Streptomyces roseoflavus、結(jié)痂鏈霉菌Streptomyces scabies和紫黑鏈霉菌Streptomyces violaceusniger能產(chǎn)生各種不同的抗菌物質(zhì)，抗菌活性強(qiáng)，已被用于土傳病害的防治[13-15]。

本研究通過(guò)對(duì)分離自福建省不同地區(qū)番茄、茄子和辣椒3種茄科作物的青枯菌菌株，進(jìn)行菌株的生化型、演化型和序列變種鑒定，評(píng)價(jià)其遺傳多樣性；同時(shí)針對(duì)不同類(lèi)群的青枯菌，篩選出具有拮抗作用的生防放線菌，為茄科青枯病的防控探尋新的自然資源奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試56株青枯菌分離自福建省不同地區(qū)和寄主的青枯病植株，供試的14株放線菌均分離自福建漳州番茄根系土壤，由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源所菌種庫(kù)保存。青枯菌的參比菌株 GMI1000由福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院饋贈(zèng)，菌株的詳細(xì)信息見(jiàn)表1。青枯菌培養(yǎng)所需的培養(yǎng)基為2, 3, 5-氯化三苯基四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride, TTC），參照Kelman[16]方法配制（1% 蛋白胨、0.1%水解酪蛋白、0.5%葡萄糖、1.8% 瓊脂和0.05% 2,3,5-氯化三苯基四氮唑）；蔗糖蛋白胨（sugar and peptone, SP）培養(yǎng)基，用蒸餾水將蔗糖20 g、蛋白胨5 g、磷酸氫二鉀0.5 g和硫酸鎂0.025 g定容至1 L，pH為7.2，121℃滅菌20 min。放線菌培養(yǎng)所需的培養(yǎng)基為高氏1號(hào)培養(yǎng)基：用蒸餾水將可溶性淀粉20 g，氯化鈉0.5 g，硫酸亞鐵0.01 g，硝酸鉀1 g，磷酸氫二鉀0.5 g，硫酸鎂0.5 g，重鉻酸鉀0.05 g，定容至1 L，pH為7.2，121℃滅菌20 min。

表1 供試青枯雷爾氏菌菌株信息Table 1 Ralstonia solanacearum strains used in this study

試劑及儀器：2,3,5-氯化三苯基四氮唑，美國(guó)Sigma公司；細(xì)菌DNA提取試劑盒、2×TaqPCR MasterMix，杭州博日科技有限公司；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。Life Eco PCR儀，杭州博日科技有限公司；Gel Doc-ItTM凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)UVP公司；Eppendorf 5418R高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；SW-CJ-1F超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；BI-250AG恒溫培養(yǎng)箱，施都凱儀器設(shè)備有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 供試菌株的生化型鑒定 基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方為NH4H2PO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，KC1 0.2 g，蛋白胨1.0 g，1%溴百里酚藍(lán)水溶液6.0 mL，瓊脂15 g，蒸餾水定容至1000 mL，調(diào)節(jié)pH值至7.2，121 ℃滅菌20 min。將3種雙糖（麥芽糖、乳糖、纖維二糖），3種己醇（甘露醇、山梨醇和甜醇）用0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾滅菌后，分別加入到基礎(chǔ)培養(yǎng)基，使其終濃度為1%。24孔板上每孔加入1 mL 6種不同生化型鑒定培養(yǎng)基和25 mL供試青枯菌菌懸液（107cfu/mL），28 ℃培養(yǎng)21 d，根據(jù)各鑒定培養(yǎng)基中指示劑顏色變化的情況，分析菌株對(duì)3種雙糖和3種己醇的利用能力，確定各代表菌株的生化型的分類(lèi)歸屬。

1.2.2 供試菌株的演化型鑒定 采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取青枯菌基因組DNA，根據(jù)Fegan和Prior[8]的報(bào)道合成青枯菌演化型特異性復(fù)合PCR引物（表2）。采用復(fù)合PCR法對(duì)供試菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系為（25 μL）：12.5 μL 2×TaqPCR MasterMix，引物Nmult22: RR 4 μL，其他6個(gè)引物各1 μL，模板DNA 1 μL和無(wú)菌水1.5 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火50 s，72 ℃復(fù)性90 s，30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物利用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，DNA Marker為DS2000。

1.2.3 供試菌株的序列變種鑒定 利用引物Endo-F/Endo-R[17]對(duì)供青枯菌的egl基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列見(jiàn)表2。PCR反應(yīng)體系為（25 μL）：12.5 μL 2×TaqPCR MasterMix，上下游引物各1 μL，模板DNA 1 μL和無(wú)菌水10.5 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃復(fù)性90 s，30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5 %瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定為目標(biāo)單一條帶后，送至福州博尚生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。序列經(jīng)NTI11.5.3軟件編輯后，提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)（菌株登入號(hào)見(jiàn)表3），并通過(guò)NCBI進(jìn)行同源性比對(duì)；從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)下載每個(gè)變種1～3個(gè)代表性菌株的egl基因序列，用CLUSTAL_X軟件進(jìn)行序列多重比較，采用Mega version 6.0軟件[18]和鄰接法（Neighbor -Joining，NJ）[19]構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，確定供試青枯菌在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中的位置，明確其歸屬地位。

表2 供試青枯菌演化型特異性多重PCR和egl基因序列變種的PCR鑒定引物Table 2 Primers used for phylotype specific multiplex PCR and egl gene sequevar identification of the tested strains

1.2.4 青枯菌的生防菌篩選 采用瓊脂擴(kuò)散法，以上述鑒定不同類(lèi)型青枯菌FJAT-91和FJAT-15304為靶標(biāo)菌，篩選出具拮抗作用的放線菌。將1 mL菌濃度為1×108cfu/mL的FJAT-91和FJAT-15304分別與9 mL約50 ℃的LB培養(yǎng)基混合后，倒入已制備好的LB固體培養(yǎng)基中，制成含病原菌的雙層培養(yǎng)基；待培養(yǎng)基凝固后，用滅菌的打孔器在平板上打孔（直徑為7 mm）。供試放線菌經(jīng)高氏1號(hào)液體培養(yǎng)基，30 ℃、170 r/min振蕩養(yǎng)7 d后，將培養(yǎng)液過(guò)0.22 μm濾膜，隨后將200 μL濾液加入雙層培養(yǎng)基的孔中，孔中加入雙蒸水為陰性對(duì)照，孔中加入潮霉素（100 mg/mL）為陽(yáng)性對(duì)照，30 ℃培養(yǎng)3 d后，觀察并測(cè)量抑菌圈直徑。試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。

1.2.5 生防菌16S rDNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建 按細(xì)菌基因組提取試劑盒（購(gòu)自上海捷瑞生物工程有限公司）操作步驟提取菌株FJAT-31547的基因組DNA，采用16S rRNA通用引物27F（5′-GAGTTT GATCCTGGCTCAG-3′）和 1492 R（5′-ACGGCTACCTTG TTACGA CTT-3′）[20]進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火60 s，72 ℃復(fù)性90 s，重復(fù)33個(gè)循環(huán)；最后72 ℃下延伸10 min。PCR產(chǎn)物純化和測(cè)序由北京華大基因研究中心完成。獲得的16S rRNA序列提交到GenBank。供試菌株16S rRNA序列與EzTaxon數(shù)據(jù)庫(kù)（hhtp://eztaxon-e.ezbiocloud.net/）的已知序列進(jìn)行比對(duì)[21]，分析系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，用CLUSTAL_X軟件進(jìn)行序列多重比較，用Mega version 6軟件和NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 青枯菌的生化型鑒定

根據(jù)對(duì)3種糖（乳糖、麥芽糖、纖維二糖）和3種醇（甘露醇、山梨醇、甜醇）的利用情況將供試的56株青枯菌劃分為不同的生化型（表3），53株青枯菌能利用3種雙糖和3種已醇，鑒定為生化型Ⅲ；菌株FJAT-15304能夠利用3種糖，不能利用3種醇，鑒定為生化型Ⅱ；菌株FJAT-49能利用3種醇、乳糖和麥芽糖，不能利用纖維二糖，菌株FJAT-15466能利用3種糖、山梨醇和甜醇，不能利用甘露醇，這表明菌株FJAT-49和FJAT-15466為非標(biāo)準(zhǔn)型生化型。

2.2 青枯菌的演化型鑒定

演化型復(fù)合PCR檢測(cè)結(jié)果表明，供試的56株青枯菌均擴(kuò)增出大小分別為280和144 bp的2條特異性條帶（圖1），其中280 bp為青枯菌特異擴(kuò)增條帶，144 bp為演化型Ⅰ的特異性擴(kuò)增條帶。表明這56株青枯菌均屬于演化型Ⅰ，即亞州分支菌株。

圖1 部分供試青枯菌演化型復(fù)合PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Phylotype specific multiplex PCR product patterns of partial strains of Ralstonia solanacearum

2.3 青枯菌的egl基因序列變種鑒定

基于egl基因序列對(duì)福建不同地區(qū)及寄主的56株青枯菌進(jìn)行序列變種鑒定，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，供試菌株均聚集在亞洲分支，即演化型I分支上（表3，圖2）。分離自茄子的青枯菌均屬于以PSS358為參比菌株的序列變種15；24株分離自辣椒的青枯菌（除了FJAT-74）均與序列變種14的參比菌株P(guān)SS81聚在同一類(lèi)群；分離自番茄的青枯菌中，序列變種15最多，有9株，其次是序列變種16，共7株，序列變種14有3株，屬于序列變種13、17、44和55的青枯菌均為2株；從總體來(lái)看序列變種14和15為福建省茄科青枯菌的優(yōu)勢(shì)菌系，分別占供試菌株48.21%和23.21%。

表3 福建省青枯菌egl基因序列變種的分布及寄主來(lái)源Table 3 Distribution and host sources of egl sequevars in Ralstonia solanacearum strains isolated from Fujian province

續(xù)表3

圖2 基于egl基因序列構(gòu)建的青枯菌系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)Fig.2 A phylogenetic tree of Ralstonia solanacearum based on egl gene sequences

2.4 不同變種青枯菌的生防放線菌篩選

供試的14株放線菌中只有菌株FJAT-31535對(duì)生化型Ⅲ、序列變種16的青枯菌FJAT-91具有抑菌活性，抑菌圈直徑為13.87 mm，略低于陽(yáng)性對(duì)照的抑菌圈直徑（15.54 mm），未篩選到對(duì)生化型Ⅱ、序列變種15的青枯菌FJAT-15304有抑菌效果的放線菌（表4）。

表4 不同放線菌對(duì)青枯雷爾氏菌的抑菌活性Table 4 Antibacterial activities of the different actinomycete strains against Ralstonia solanacearum

2.5 生防菌FJAT-31535的鑒定

菌株FJAT31535在高氏1號(hào)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，30℃培養(yǎng)7 d，F(xiàn)JAT31535的菌落形態(tài)為圓形、灰白色、邊緣細(xì)絲狀突起，表面干燥、有褶皺，貼緊培養(yǎng)基生長(zhǎng)，不易挑起（圖3A，B）。

圖3 菌株FJAT31535在高氏1號(hào)平板上（A）和體視鏡下（B）的菌落形態(tài)特征Fig.3 Colony morphology of the strain FJAT31535 on a Gause’s No.1 plate (A) and under a stereomicroscope (B)

利用細(xì)菌16S rRNA通用引物擴(kuò)增菌株FJAT31535的16S rRNA基因序列，獲得序列長(zhǎng)度為1396 bp，序列提交GenBank（登錄號(hào)：ON038371）。FJAT-31535序列與GenBank和Ezbioclound數(shù)據(jù)庫(kù)已知序列比對(duì)，結(jié)果表明，其與弗氏鏈霉菌模式菌株RSU15T的16S rRNA基因序列相似性最高，為100%。利用MEGA 6.0軟件NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖4），結(jié)果表明，F(xiàn)JAT-31535與弗氏鏈霉菌模式菌株RSU15T聚在一類(lèi)群（圖4）?；谛螒B(tài)、生理生化特性和16S rRNA基因序列相似性，菌株FJAT-31535鑒定為鏈霉菌屬。

圖4 基于16S rRNA序列構(gòu)建菌株FJAT31535系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.4 The phylogenetic tree of the strain FJAT31535 based on 16S rRNA sequences

3 討論

青枯菌具有豐富的種內(nèi)遺傳多樣性[22,23]，其致病性和菌系變化與寄主作物品種、栽培方式及外界環(huán)境均存在較大關(guān)系[24]。通過(guò)生理小種和生化型進(jìn)行的青枯菌菌系劃分存在一定的局限性，不能有效地反映出病原菌在遺傳進(jìn)化及地理起源上的差異[25]。Fegan等[8]在第三屆青枯病國(guó)際會(huì)議上提出青枯菌演化型分類(lèi)框架，將青枯菌依次劃分為種（Species）、演化型（Phylotype）、序列變種（Sequevar）以及克?。–lone）4個(gè)不同水平的分類(lèi)單元，并建立了與之相對(duì)應(yīng)的鑒定方法。

本研究采用演化型復(fù)合PCR檢測(cè)體系結(jié)合傳統(tǒng)的生化型鑒定方法對(duì)分離自福建8個(gè)地區(qū)的番茄、辣椒和茄子寄主的 56株青枯菌進(jìn)行演化型劃分和生化型鑒定，結(jié)果表明，福建茄科青枯菌大部分屬于生化型Ⅲ、演化型Ⅰ，為亞州分支菌株，與前人研究結(jié)果相吻合[4]。Xue等[26]、She等[27]研究證實(shí)我國(guó)青枯菌可分為生化型Ⅲ和Ⅳ，以生化型Ⅲ為主；而生化型Ⅲ和Ⅳ均屬于演化型Ⅰ菌株。徐進(jìn)等[4]對(duì)45株福建煙草青枯菌演化型和生化型鑒定結(jié)果表明，45株青枯菌均屬于演化型Ⅰ，43株屬于生化型Ⅲ，說(shuō)明福建茄科寄主青枯菌中，生化型Ⅲ是占居優(yōu)勢(shì)或普遍存在，但這個(gè)生化型在南、北美洲和奧洲并不多見(jiàn)[27]。本研究從番茄寄主分離的1株青枯菌FJAT-15304，鑒定為生化型Ⅱ、演化型Ⅰ，一方面說(shuō)明青枯菌生化型分布的復(fù)雜性，另一方面也證明同一省同一寄主上存在不同生化型。青枯菌生化型在地理來(lái)源和寄主范圍分布的復(fù)雜性，可能與種苗帶毒和頻繁調(diào)運(yùn)有關(guān)[28]。

根據(jù)演化型分類(lèi)框架，基于egl基因序列，每個(gè)演化型可進(jìn)一步劃分為一系列的序列變種。目前，青枯菌有超過(guò)15個(gè)序列變種[27,29]。序列變種分類(lèi)與生理小種、寄主和地理來(lái)源相關(guān)[30]。潘哲超等[6]、劉海龍等[31]研究福建、貴州、湖北等地?zé)煵萸嗫菥蛄凶兎N時(shí)發(fā)現(xiàn)，來(lái)自相同煙區(qū)的序列變種相對(duì)單一；He等研究發(fā)現(xiàn)，采集同一鄉(xiāng)鎮(zhèn)或毗鄰鄉(xiāng)鎮(zhèn)的同一寄主的青枯菌，大多具有相同的序列變種[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，福建茄科青枯菌種以下分類(lèi)存在亞州分支的7個(gè)序列變種。寄主番茄存在的序列變種較多，遺傳多樣性較為豐富，與前人研究結(jié)果一致[32]，表明福建番茄青枯菌的遺傳多樣性較高，這個(gè)研究結(jié)果將為抗病品種的選育和青枯病的防控提供理論參考。

Anuratha和 Gnananickam[33]研究表明，青枯菌具有復(fù)雜的遺傳多樣性，在離體條件下生防菌 DZ-9、BS2004和DZ-42對(duì)青枯菌生化型Ⅲ均表現(xiàn)出較顯著的拮抗效果，但對(duì)生化型V卻未顯示明顯的抑制作用。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，生防放線菌FJAT-31535對(duì)生化型Ⅲ的青枯菌FJAT-91具有明顯的拮抗作用，而對(duì)生化型Ⅱ的青枯菌FJAT-15304無(wú)拮抗作用，這說(shuō)明生防菌并非對(duì)所有生化型青枯菌都有抑制作用，從而給病害防治帶來(lái)了一定的難度。此外，放線菌已被廣泛用于生防菌劑的開(kāi)發(fā)與利用[34]，它們通常寄居根系土壤，保護(hù)植株免受病原真菌或細(xì)菌侵染[35]。本研究篩選到一株放線菌 FJAT-31535，對(duì)生化型Ⅲ的青枯菌具有明顯的拮抗效果，未來(lái)可以考慮利用這個(gè)菌株防治由生化型Ⅲ的青枯菌引起的茄科青枯病。