張華英，聞 亞，鄭 琴，王以躍，謝等龍

（浙江海正動物保健品有限公司，浙江 杭州 311400）

美洛昔康（Meloxicam）是一種烯醇類非甾體類抗炎藥，作為世界上第一種選擇性抑制環(huán)氧化酶-2（COX-2）抑制劑，美洛昔康具有良好的抗炎、鎮(zhèn)痛和解熱作用，它也是目前眾多獲批的用于犬臨床的非甾體抗炎藥中的一種，美洛昔康在犬上有多種臨床給藥途徑，目前在歐洲批準(zhǔn)的有美洛昔康片劑和口服混懸液。本文所研究的美洛昔康咀嚼片，具有適口性好、犬用藥順應(yīng)性高等優(yōu)點，可用于緩解犬急性和慢性肌肉骨骼疾病引起的炎癥和疼痛。為了建立美洛昔康咀嚼片中美洛昔康的含量檢測方法，依據(jù)咀嚼片的特性，排除紫外可見分光光度法和電化學(xué)法，最終選擇高效液相色譜法，成功建立了一種高效、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好、靈敏度高的美洛昔康含量測定方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀 器Agilent 1260高效液相色譜儀（DAD檢測器），德國塞多利斯電子分析天平（感量0.00001g），KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），超純水儀（Milli-Q Advantage A10）。

1.2 試驗藥品甲醇（色譜純、TEDIA），異丙醇（色譜純、TEDIA），磷酸氫二銨（分析純、科密歐），美洛昔康對照品（EP、Y0001080），美洛昔康咀嚼片（浙江海正動物保健品有限公司），批號分別為：P1505001A、P1505002A、P1505003A，規(guī)格為每片含美洛昔康1mg。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件采用Welch Xtimate C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；以磷酸氫二銨溶液-甲醇-異丙醇（64：32：4）混合溶液為流動相；流速為1.0mL/min；進樣量為20μL；檢測波長為254nm。典型色譜圖（見圖1）：

圖1 美洛昔康咀嚼片含量典型色譜圖

2.2 溶液配制

2.2.1 對照品溶液的配制 精密稱取美洛昔康對照品12mg，置25mL量瓶中，用流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密量取5mL，置50mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，得到對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的配制 取本品20片，稱定總重，用研缽將片研磨成均勻粉末。精密稱取粉末適量（約相當(dāng)于美洛昔康1.2mg），置25mL量瓶中，加流動相超聲處理15min，并用流動相稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3 供試品溶液的測定按照2.1的色譜條件和2.2的溶液配制方法，將對照品溶液和供試品溶液注入高效液相色譜儀，按外標(biāo)法以峰面積計算，即得美洛昔康的含量。

2.4 線性關(guān)系考察配制約含美洛昔康450 μg/mL的線性儲備溶液，取線性儲備溶液適量，用稀釋劑定容，制成濃度為22.5、33.75、45.0、56.25、67.5μg/mL的美洛昔康線性溶液，每個濃度點重復(fù)進樣2次，按照2.1的色譜條件進行測定。以美洛昔康對照品濃度為橫坐標(biāo)（x），以相應(yīng)濃度測得的平均峰面積為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到線性方程為y=47607x-8.762，相關(guān)系數(shù)為1，y軸截距占100%濃度峰面積的0.41%。說明美洛昔康在22.5～67.5μg/mL濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。線性結(jié)果（見圖2）：

圖2 美洛昔康線性關(guān)系圖

2.5 準(zhǔn)確度試驗取線性儲備溶液適量，分別加入到空白輔料中，用稀釋劑定容，制成濃度為22.5、45.0、67.5μg/mL的準(zhǔn)確度溶液，每個濃度配制三份平行樣，按照2.1的色譜條件進行測定。結(jié)果（見表1），三個濃度的回收率分別為101.0%、101.5%和100.6%，RSD值分別為0.3%、0.0%和0.4%，美洛昔康回收率良好。

表1 美洛昔康準(zhǔn)確度結(jié)果

2.6 重復(fù)性試驗按照2.1的色譜條件和2.2的溶液配制方法，每個批次樣品配制6份樣品溶液，依次進樣檢測，并記錄峰面積。結(jié)果（見表2），各批次樣品的RSD在0.4%～0.9%，重復(fù)性較好。

表2 美洛昔康重復(fù)性結(jié)果

2.7 中間精密度試驗中間精密度試驗由另外一名實驗員用不同HPLC系統(tǒng)、不同色譜柱在不同日期采用與“重復(fù)性”試驗中相同批號的成品藥來進行檢測。實驗員A，使用Agilent 1260高效液相色譜儀，配Welch Xtimate C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；實驗員B，使用Waters e2695高效液相色譜儀，配Waters Symmetry C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）。結(jié)果（見表3），各批次樣品的RSD在0.3%～1.0%，中間精密度較好。

表3 美洛昔康中間精密度結(jié)果

2.8 穩(wěn)定性考察按2.2配制對照品溶液和供試品溶液，分別于25℃放置0、1、2、3d，每天用新配制的對照品溶液計算美洛昔康的含量。取20μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以美洛昔康含量與最初值比較。結(jié)果（見表4），差值在0.17%～0.65%，小于2.0%。因此對照品溶液和供試品溶液在室溫密封條件下，3d內(nèi)穩(wěn)定。

表4 對照品溶液和供試品溶液穩(wěn)定性結(jié)果

2.9 耐用性考察取P1505001A批次樣品，按照2.1的色譜條件和2.2的溶液配制方法，配制2份平行樣進行耐用性試驗，考察流速、柱溫、波長及流動相比例對含量測定的影響。結(jié)果（見表5），各條件下美洛昔康含量與正常條件結(jié)果的差值均小于2.0%，耐用性良好，對含量測定結(jié)果無影響。

表5 美洛昔康耐用性結(jié)果

3 討論與結(jié)果

3.1 檢測波長的確定取美洛昔康對照品溶液、空白輔料溶液和供試品溶液，使用DAD檢測器進行全波長掃描。美洛昔康在254nm和270nm處均有較大吸收。因空白輔料溶液在270nm處有明顯吸收峰，會干擾主成分的分析，同時參考美洛昔康片國家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS1-（X-332-2）-2003含量檢測方法中規(guī)定的波長254nm，故確定254nm為美洛昔康咀嚼片含量測定的波長。

3.2 稀釋劑的確定許多文獻報道二甲基甲酰胺可用于溶解美洛昔康對照品。二甲基甲酰胺作為助溶劑，對加快美洛昔康溶解，改善色譜峰型，平穩(wěn)基線有一定作用，但二甲基甲酰胺作為一種特殊的溶劑，會對色譜柱造成損傷，進而降低色譜柱的柱效及理論塔板數(shù)，不利于檢測任務(wù)的長期重復(fù)進行。參考美洛昔康注射液（農(nóng)業(yè)部公告1296號）中采用0.2%磷酸氫二銨溶液600mL和甲醇-異丙醇（65：10）400mL混合溶液為稀釋劑，通過對不同比例稀釋劑的選擇和比對，最終確定采用磷酸氫二銨溶液-甲醇-異丙醇（64：32：4）為稀釋劑，結(jié)果顯示其對美洛昔康溶解性能良好，得到的峰信號強度比以二甲基甲酰胺為溶劑信號強，純度高，色譜峰峰形對稱；對儀器和色譜柱無污染和損壞。最終建立的美洛昔康咀嚼片含量測定方法簡便、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好、靈敏度高。