杜 淼 陳芳華 戰(zhàn)大偉

(斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司，北京 102101)

胚胎移植又稱受精卵移植，是指將雌性供體動(dòng)物經(jīng)過自然交配形成的早期胚胎或通過體外受(授)精技術(shù)獲得的早期胚胎移植進(jìn)另外一只雌性受體動(dòng)物體內(nèi)，使之進(jìn)一步產(chǎn)生新個(gè)體的技術(shù)[1]。胚胎移植技術(shù)的實(shí)現(xiàn)可以充分發(fā)揮雌性動(dòng)物的繁殖能力，大大縮短了雌性動(dòng)物的繁殖周期，增加了供體動(dòng)物一生可繁殖的后代數(shù)量。胚胎移植技術(shù)的成功有賴于動(dòng)物的生理學(xué)基礎(chǔ)[2]：(1)同種動(dòng)物的供體和受體生殖器官的生理變化是相同的，為供體胚胎移入受體提供相同的生理環(huán)境；(2)早期胚胎在一定時(shí)間內(nèi)可以處于游離狀態(tài)而不影響其質(zhì)量，為胚胎的收集提供了可能；(3)受體對(duì)移入子宮的外來胚胎基本上不發(fā)生免疫排斥反應(yīng)，為胚胎在受體內(nèi)的存活提供可能；(4)供體胚胎可與受體子宮建立正常的生理和組織聯(lián)系，但供體胚胎的遺傳特性在孕育過程中不受受體子宮環(huán)境的影響。

自英國人于1890年創(chuàng)立胚胎移植技術(shù)以來，胚胎移植技術(shù)已成為研究受精作用、胚胎學(xué)、遺傳學(xué)以及生物凈化的重要手段。以往的研究大都集中在單一遺傳背景上，以研究封閉群居多。而本研究在不同遺傳背景小鼠的基礎(chǔ)上，探索胚胎數(shù)量對(duì)移植效率的影響，為從事繁育工作的科研人員提供一定的技術(shù)支持。

在本研究中，胚胎數(shù)量≤15枚時(shí)，采用輸卵管單側(cè)移植，胚胎數(shù)量為16～30枚時(shí)，采用輸卵管雙側(cè)移植。

1 材料和方法

1.1 材料

動(dòng)物：本實(shí)驗(yàn)所有的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均來自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為：SCXK(京)2019-0010, 倫理審批號(hào)：2019012302。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)在屏障和隔離設(shè)施中。光照明暗周期為12 h/12 h，自由飲水，自由采食。

試劑：孕馬血清促性腺激素(pregnant mare serum gonadotropin ，PMSG )注射液和人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin ，HCG )注射液(寧波第二激素廠)；M2和石蠟油(Sigma Aldrich公司)；杜氏磷酸鹽緩沖液(Dulbecco’s phosphate-buffered saline，DPBS)(索萊寶公司)。

1.2 方法

1.2.1供體實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的超數(shù)排卵：選用性成熟的供體、受體動(dòng)物。第1天16:00給雌性供體動(dòng)物腹腔注射PMSG 10 IU，間隔48 h后，第3天16:00腹腔注射同樣劑量的HCG。

1.2.2平衡培養(yǎng)液體：第4天根據(jù)超數(shù)排卵效率制作培養(yǎng)液滴：每個(gè)35 mm的培養(yǎng)基中做4個(gè)50 μL的M2液滴并覆蓋石蠟油，放置溫度為37 ℃、CO2濃度為5.0%的培養(yǎng)箱中過夜平衡。

1.2.3制備假孕受體鼠：第4天15:00將結(jié)扎雄性動(dòng)物與性成熟雌性動(dòng)物交配，第5天早上將有陰道栓的動(dòng)物挑出供移植使用。

1.2.4收集胚胎：第5天將供體動(dòng)物經(jīng)75%乙醇消毒后取出輸卵管(此過程需有兩套手術(shù)鑷和手術(shù)剪，一套用于剪開皮膚，一套用于收集輸卵管，避免交叉污染)，利用DPBS沖洗液將胚胎從輸卵管中沖出，利用撿卵針將胚胎移入經(jīng)過平衡的M2培養(yǎng)液中。收集完所有胚胎準(zhǔn)備移植。

1.2.5數(shù)據(jù)記錄：記錄每只受體動(dòng)物的移植胚胎數(shù)與出生數(shù)量，計(jì)算產(chǎn)仔率。

2 結(jié)果

2.1 封閉群動(dòng)物移植不同胚胎數(shù)量對(duì)產(chǎn)仔率的影響

就KM來講，每只妊娠母鼠平均產(chǎn)仔率最高(52.6%)的移植胚胎數(shù)量是16～30枚，而ICR移植相同的胚胎數(shù)量平均產(chǎn)仔率(32.0%)則最低。ICR平均產(chǎn)仔率最高的移植胚胎數(shù)為11～15枚。同時(shí)，KM單側(cè)移植的產(chǎn)仔率低于ICR，而雙側(cè)移植的產(chǎn)仔率則優(yōu)于ICR。

表1 KM和ICR小鼠移植不同胚胎數(shù)量對(duì)移植效率的影響Table 1 Effect of different embryos transplanted on transplantation efficiency in KM and ICR

2.2 近交系動(dòng)物移植不同胚胎數(shù)量對(duì)產(chǎn)仔率的影響

本實(shí)驗(yàn)小鼠移植胚胎數(shù)量≤15枚，C57BL/6J采用輸卵管單側(cè)移植方式，由表中結(jié)果可看出，輸卵管單側(cè)移植時(shí)，C57BL/6J的平均產(chǎn)仔率在50%左右(表2)。

表2 C57BL/6J小鼠移植不同胚胎數(shù)量對(duì)移植效率的影響Table 2 Effect of different embryos transplanted on transplantation efficiency in C57BL/6J

2.3 免疫缺陷動(dòng)物移植不同胚胎數(shù)量對(duì)產(chǎn)仔率的影響

從免疫缺陷嚴(yán)重程度來講，NOD-SCID的免疫缺陷程度比BALB/c-nu更為嚴(yán)重。由表3可看出，NOD-SCID具有移植胚胎數(shù)量的依賴性，當(dāng)移植數(shù)量過少時(shí)，如≤10枚胚胎時(shí)，小鼠的平均產(chǎn)仔率為0。

表3 BALB/c-nu和NOD-SCID小鼠移植不同胚胎數(shù)量對(duì)移植效率的影響Table 3 Effect of different embryos transplanted on transplantation efficiency in BALB/c-nu and NOD-SCID

3 討論

本研究分別選用封閉群KM和ICR、近交系C57BL/6J以及免疫缺陷模型鼠NOD-SCID和BALB/c-nu為研究對(duì)象。結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同遺傳背景動(dòng)物之間移植效率有所不同。在保證胚胎質(zhì)量和受體鼠生理狀態(tài)完好的情況下，KM、ICR、C57、BALB/c-nu和NOD-SCID小鼠的最大產(chǎn)仔率分別是64%、73%、73%、50%和63.5%。

但是，本研究的數(shù)據(jù)與其他學(xué)者的數(shù)據(jù)會(huì)有所不同。如參考文獻(xiàn)[3]中提到每只KM小鼠移植胚胎數(shù)量為15枚時(shí)，產(chǎn)仔率為16.6%；當(dāng)移植胚胎數(shù)量為25枚時(shí)，產(chǎn)仔率為36%。不難發(fā)現(xiàn)，隨著移植胚胎數(shù)量的增加，小鼠的平均產(chǎn)仔率也隨之增加，這和本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是相一致的。

不同研究者實(shí)驗(yàn)結(jié)果不同的原因可能是由于胚胎質(zhì)量引起的：有研究顯示，超數(shù)排卵得到的胚胎質(zhì)量比自然排卵的質(zhì)量要差；同時(shí)，小鼠的移植方式也是造成移植效率不同的原因：如在C57BL/6J小鼠上，輸卵管雙側(cè)移植效率略高于單側(cè)移植效率，但無顯著性差異[4]。胚胎質(zhì)量、胚胎來源(鮮活胚胎/冷凍胚胎)、胚齡、受體動(dòng)物的身體素質(zhì)、生殖器官疾病(卵巢囊腫、子宮膿脹等)等均會(huì)影響移植效率，但是在胚胎移植過程中,移植的胚胎數(shù)量也是影響移植效率的重要因素[5-7]。為了提高實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的移植效率，本研究對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物移植胚胎數(shù)目與獲得的仔鼠數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，從而分析出合適的移植胚胎數(shù)量，優(yōu)化移植效率。本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定了不同背景小鼠移植胚胎數(shù)量的最佳值，即：KM小鼠最佳移植胚胎數(shù)范圍是16～30枚；ICR小鼠最佳移植胚胎數(shù)范圍是11～15枚；C57小鼠最佳移植胚胎數(shù)范圍是11～15枚；BALB/c-nu小鼠最佳移植胚胎數(shù)范圍是≤10枚；NOD-SCID小鼠最佳移植胚胎數(shù)范圍是11～15枚。根據(jù)本研究結(jié)果提示，當(dāng)剩余胚胎數(shù)量較少時(shí)，可以采取胚胎冷凍的方法將胚胎儲(chǔ)存，可有效的減少胚胎和假孕鼠的浪費(fèi)。本研究成果可以提高同等技術(shù)條件下的胚胎移植效率，使早期胚胎得到最大程度的利用，保護(hù)優(yōu)質(zhì)的種子資源，為生物凈化等工作者提供了切實(shí)可行的移植方法，具有一定的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。