李曉波 王 吉 王莎莎 李 威 秦 驍 黃宗文 岳秉飛 王淑菁 付 瑞

(中國(guó)食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源研究所，北京 102629)

鴿圓環(huán)病毒(pigeon circovirus, PiCV)為圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，無(wú)囊膜，直徑約20 nm，基因組為單鏈環(huán)狀DNA，大小約為2.0 kb，包含兩個(gè)主要開(kāi)放讀碼框架(ORFs)：V1和C1，前者編碼病毒復(fù)制相關(guān)的蛋白，后者編碼病毒唯一的結(jié)構(gòu)蛋白，即衣殼蛋白[1-2]。PiCV既可通過(guò)排泄物水平傳播也可通過(guò)垂直傳播[3]，是導(dǎo)致幼鴿疾病綜合征(young pigeon disease syndrome, YPDS)的病原體之一，患病鴿多為2～12月齡青年鴿，典型癥狀包括嗜睡、體質(zhì)量減輕、厭食、作物反流、多飲和腹瀉等，病毒也可破壞鴿的免疫系統(tǒng)，使其容易再次感染多種條件致病病原體，引起免疫器官衰退，導(dǎo)致氣管、肝、肺及腸道的炎癥等病理改變[2,4]。

目前PiCV還未能通過(guò)體外細(xì)胞成功培養(yǎng)增殖，因此主要依靠PCR方法檢測(cè)其抗原[5-6]，本研究選取其polymerase基因保守序列設(shè)計(jì)引物探針，建立了TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR(FQ-PCR)方法，可實(shí)現(xiàn)鴿樣本中PiCV靈敏特異性的檢測(cè)。

1 材料和方法

1.1 試劑

FQ-PCR引物探針由ABI公司合成，TaqMan Universal PCR Master Mix為ABI產(chǎn)品；病毒核酸提取試劑盒(TaKaRa公司)。

1.2 病毒株和樣品

豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)，禽腺病毒 I 型、III 型(FAdv I、III)，禽白血病病毒(ALV)，禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒(REV)均購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所；40份鴿肝、脾、肺、法式囊及36份鴿盲腸樣本均采自北京某養(yǎng)殖場(chǎng)。

1.3 方法

1.3.1引物設(shè)計(jì)：選擇鴿圓環(huán)病毒(Genbank：NC_002361)基因保守序列設(shè)計(jì)引物和探針，序列見(jiàn)表1。

表1 PiCV FQ-PCR引物探針信息Table 1 Primers and probes for PiCV FQ-PCR

1.3.2病毒核酸的提?。贺i圓環(huán)病毒2型(PCV2)，禽腺病毒I型、III型，禽白血病病毒，禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生性病毒，各取0.2 mL病毒液按試劑盒說(shuō)明提取核酸，最后用150 μL滅菌水洗脫。

1.3.3質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備：由上海生工合成PiCV(Genbank：NC_002361)全長(zhǎng)(1～2 037 bp)DNA序列，轉(zhuǎn)入pUC57質(zhì)粒，構(gòu)建質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品pUC57-PiCV，經(jīng)測(cè)定其濃度為3.48×1010copies/μL。

1.3.4PiCV FQ-PCR擴(kuò)增體系及標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立：對(duì)引物、探針濃度、退火溫度等條件進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后的反應(yīng)體系為：TaqMan Universal PCR Master Mix 10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，探針(10 μmol/L)0.2 μL，DNA模板1 μL，滅菌ddH2O補(bǔ)足至終體積20 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?0 ℃ 2 min；95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min；40個(gè)循環(huán)。將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品pUC57-PiCV 10倍系列稀釋為3.48×107～3.48 copies/μL，以其為模板，按上述反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每個(gè)稀釋度做3 個(gè)平行，選取線(xiàn)性較好的7 個(gè)稀釋度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.3.5PiCV FQ-PCR方法的敏感性驗(yàn)證

1.3.5.1 FQ-PCR方法檢測(cè)限的驗(yàn)證：以3.48×107～3.48 copies/μL 10倍系列稀釋的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，用優(yōu)化好的反應(yīng)條件進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)稀釋度做3個(gè)平行，驗(yàn)證該方法所能檢測(cè)的最低質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度。

1.3.5.2 與常規(guī)PCR方法敏感性比較：3.48×107～3.48 copies/μL 10倍系列稀釋的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，使用PiCV FQ-PCR方法及文獻(xiàn)報(bào)道的常規(guī)PCR法分別進(jìn)行擴(kuò)增[7]，比較FQ-PCR方法與常規(guī)PCR方法的敏感性。

1.3.6PiCV FQ-PCR方法特異性驗(yàn)證：用建立的熒光定量PCR法檢測(cè)同為圓環(huán)病毒科的豬圓環(huán)病毒2型及禽腺病毒 I 型、III 型，禽白血病病毒，禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒等禽源病毒，驗(yàn)證方法的特異性。

1.3.7PiCV FQ-PCR方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性驗(yàn)證：應(yīng)用優(yōu)化好的反應(yīng)條件，以濃度為3.48×105和3.48×104copies/μL的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板進(jìn)行FQ-PCR擴(kuò)增，每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)重復(fù)，同時(shí)選擇不同的3個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)，計(jì)算組內(nèi)和組間Ct值及定量拷貝數(shù)的均值、標(biāo)準(zhǔn)差及變異系數(shù)。

1.3.8PiCV FQ-PCR方法的應(yīng)用：取鴿肝、脾、肺、法式囊樣本各40份，盲腸36份，提取DNA，用建立的PiCV FQ-PCR方法檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 PiCV熒光定量PCR擴(kuò)增體系及標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立

用優(yōu)化好的體系擴(kuò)增3.48×107～3.48×101copies/μL的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，各稀釋度擴(kuò)增曲線(xiàn)間距均勻，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Slope為-3.381(-3～-3.5)，R2值為1(>0.99)，擴(kuò)增效率為97.61%(90%～105%)(圖1)。

圖1 PiCV熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.1 PiCV FQ-PCR standard curve

2.2 PiCV FQ-PCR方法的敏感性驗(yàn)證

如圖2A所示，3.48×107～3.48×101copies/μL各稀釋度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品均出現(xiàn)S型擴(kuò)增曲線(xiàn)，而3.48 copies/μL的3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)有1個(gè)未出現(xiàn)S型擴(kuò)增曲線(xiàn)，說(shuō)明本方法最低可定量檢測(cè)34.8 copies/μL的樣品。用常規(guī)PCR方法檢測(cè)同樣的3.48×107～3.48×101copies/μL系列稀釋的PiCV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，由圖2B可見(jiàn)，常規(guī)PCR最低可檢測(cè)到3.48×103copies/μL，表明PiCV FQ-PCR方法敏感性比常規(guī)PCR方法高兩個(gè)數(shù)量級(jí)。

A：PiCV熒光定量PCR敏感性；B：PiCV常規(guī)PCR敏感性；1～8：PiCV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為3.48×107～3.48 copies/μLA:The sensitivity of PiCV FQ-PCR; B: The sensitivity of PiCV conventional PCR；1-8:The concentration of PiCV plasmid standard is 3.48×107～3.48 copies/μL respectively圖2 PiCV熒光定量PCR方法與常規(guī)PCR方法敏感性比較Fig.2 Comparison of sensitivity between PiCV FQ-PCR and conventional PCR

2.3 PiCV FQ-PCR方法的特異性驗(yàn)證

圖3顯示，當(dāng)以PiCV為模板時(shí)，出現(xiàn)FAM熒光擴(kuò)增曲線(xiàn)，以豬圓環(huán)病毒2型，禽腺病毒 I 型、III 型，禽白血病病毒，禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生性病毒為模板均無(wú)明顯擴(kuò)增曲線(xiàn)。表明所建立的熒光定量PCR法特異性強(qiáng)，與其他病毒均無(wú)交叉反應(yīng)。

注：1～7分別為PiCV，豬圓環(huán)病毒2型，禽腺病毒I型、III型，禽白血病病毒，禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒及陰性對(duì)照Note: 1-7: PiCV、PCV2、FAdv I、FAdv III、ALV、REV and negative control圖3 PiCV熒光定量PCR方法特異性驗(yàn)證擴(kuò)增曲線(xiàn)Fig.3 PiCV FQ-PCR specificity test amplification curve

2.4 PiCV FQ-PCR方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性驗(yàn)證

用建立的FQ-PCR方法檢測(cè)3.48×105和3.48×104copies/μL兩個(gè)濃度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，由表2可見(jiàn)，其Ct值及定量拷貝數(shù)組內(nèi)變異系數(shù)為0.08%～1.63%，組間變異系數(shù)為5.10%～7.23%，均小于10%，表明方法的重復(fù)穩(wěn)定性良好。

表2 PiCV FQ-PCR方法的重復(fù)穩(wěn)定性驗(yàn)證結(jié)果Table 2 Repeatability verification results of PiCV FQ-PCR

2.5 PiCV FQ-PCR方法的應(yīng)用

用建立的PICV FQ-PCR方法對(duì)鴿肝、脾、肺、法式囊樣品各40份，盲腸樣品36份進(jìn)行檢測(cè), 肝PiCV陽(yáng)性率為97.5%(39/40)、脾、肺、法式囊PiCV陽(yáng)性率均為100%(40/40)，盲腸PiCV陽(yáng)性率為97.2%(35/36)。肝、脾、肺、法式囊及盲腸病毒含量中位數(shù)(Q1，Q2)分別為3.39×104(2.61×102，2.69×106)，9.53×104(4.74×102，3.90×106)，4.61×104(1.10×103，4.87×105)，3.34×105(5.54×103，1.80×107)，2.69×104(1.82×103，1.15×106)，經(jīng)卡方檢驗(yàn)，各組織PiCV含量無(wú)顯著差異(P>0.05)。對(duì)陽(yáng)性樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增測(cè)序，與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，顯示與鴿圓環(huán)病毒JF2/JiangSu/2014株同源性最高，一致率為97.85%。

3 討論

熒光定量PCR方法具有靈敏度高，耗時(shí)少，特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)病原體的快速精準(zhǔn)檢測(cè)[8-9]，本研究通過(guò)比對(duì)NCBI PiCV各分離株序列，選取其polymerase基因保守序列設(shè)計(jì)引物和探針，建立了PiCV的熒光定量PCR檢測(cè)方法。經(jīng)驗(yàn)證，在標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒濃度為3.48×107～3.48×101copies/μL范圍，產(chǎn)生的熒光CT值與質(zhì)粒濃度呈線(xiàn)性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2值為1，擴(kuò)增效率為97.61%，表明建立的FQ-PCR方法可實(shí)現(xiàn)對(duì)PiCV的有效定量。用與PiCV同屬的豬圓環(huán)病毒2型及其他禽源病毒，如禽腺病毒、禽白血病病毒等對(duì)照病毒進(jìn)行方法特異性驗(yàn)證，對(duì)照病毒均未出現(xiàn)擴(kuò)增信號(hào)，表明該方法特異性良好；用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒進(jìn)行方法敏感性驗(yàn)證，最低可檢測(cè)到的質(zhì)粒濃度為34.8 copies/μL，用傳統(tǒng)PCR方法和建立的FQ-PCR方法擴(kuò)增同一批系列稀釋的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，傳統(tǒng)PCR方法的檢測(cè)限為3.48×103copies/μL，檢測(cè)敏感性比FQ-PCR方法低2個(gè)數(shù)量級(jí)；以?xún)蓚€(gè)不同濃度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性進(jìn)行驗(yàn)證，其Ct值及拷貝數(shù)值的變異系數(shù)低于2%，批間3個(gè)不同時(shí)間測(cè)定值的變異系數(shù)低于10%，表明該方法的重復(fù)性及穩(wěn)定性良好。

據(jù)報(bào)道，鴿群中PiCV的感染率大約為70%，PiCV主要侵染法式囊、脾、胸腺等免疫器官，還可侵染肺、肝、腸、氣管、腎等組織[4,10-14]，本研究用所建立的熒光定量PCR方法對(duì)40只鴿的肝、脾、肺、法式囊及盲腸等樣本進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)方法進(jìn)行應(yīng)用研究，結(jié)果顯示肝PiCV陽(yáng)性率為97.5%(39/40)，脾、肺、法式囊陽(yáng)性率均為100%，這些鴿子來(lái)自北京某養(yǎng)殖場(chǎng)，反映出北京地區(qū)鴿群中PiCV有較高的感染率，而這40只鴿子均未表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀，表明PiCV在鴿群中呈隱性感染，這與文獻(xiàn)結(jié)果一致[2,13]；各組織的PiCV定量結(jié)果顯示，法式囊的病毒含量均值雖然比肝、脾、肺及盲腸高兩個(gè)數(shù)量級(jí)，但由于其個(gè)體含量差異較大，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，各組織病毒含量無(wú)顯著差異(P>0.05)；對(duì)陽(yáng)性PCR產(chǎn)物進(jìn)行序列分析，顯示與江蘇株的同源性最高。

目前實(shí)驗(yàn)用鴿還未出臺(tái)相關(guān)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和地方標(biāo)準(zhǔn)，本實(shí)驗(yàn)建立的PiCV FQ-PCR檢測(cè)方法敏感性高，特異性及穩(wěn)定性好，可有效檢測(cè)到鴿組織樣本中的PiCV，為制定實(shí)驗(yàn)用鴿相關(guān)的微生物標(biāo)準(zhǔn)提供了技術(shù)支持和基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。