劉細(xì)細(xì)綜述；陳碧清，朱學(xué)軍審閱（.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院、第一臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 009；.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中心實驗室，江蘇 南京 009；.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 血液科，江蘇 南京 009）

血液系統(tǒng)惡性腫瘤是一組危及生命的異質(zhì)性血液疾病。血液腫瘤細(xì)胞亞群的異質(zhì)性和克隆演變是疾病精確診斷、風(fēng)險分層，乃至靶向治療的主要障礙[1]。傳統(tǒng)的異質(zhì)性研究主要使用流式細(xì)胞術(shù)來鑒別血液中的各類型細(xì)胞，但是這種方法嚴(yán)重依賴于熒光標(biāo)記的細(xì)胞膜表面分子標(biāo)志物，而現(xiàn)有可用的分子標(biāo)志物十分有限，而且很多胞內(nèi)分子標(biāo)志物無法檢測。近年來新興的單細(xì)胞測序技術(shù)很好地解決了這一問題，為細(xì)胞異質(zhì)性的研究提供了有力的平臺。單細(xì)胞測序在腫瘤研究等領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用，正成為生命科學(xué)研究的焦點[2]。應(yīng)用以單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）為主的單細(xì)胞測序技術(shù)來研究血液腫瘤，可以了解腫瘤細(xì)胞在基因表達水平的異質(zhì)性，有助于實現(xiàn)更準(zhǔn)確的疾病監(jiān)測和分層、闡明疾病發(fā)生和發(fā)展的分子機制及制定精準(zhǔn)的治療方案[3]。

1 化解腫瘤異質(zhì)性難題

腫瘤組織樣本中的細(xì)胞具有異質(zhì)性。單細(xì)胞測序技術(shù)已廣泛應(yīng)用于腫瘤方向的研究，但是受限于腫瘤細(xì)胞沒有明確的分子標(biāo)記基因，很難直接通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的基因表達水平從腫瘤組織中區(qū)分正常細(xì)胞和惡性腫瘤細(xì)胞[4]?；趕cRNA-seq 數(shù)據(jù)進行單細(xì)胞拷貝數(shù)變異分析，就是利用不同樣本或不同細(xì)胞類型之間的基因表達量預(yù)測大規(guī)模染色體水平的拷貝數(shù)變異，發(fā)現(xiàn)拷貝數(shù)異常的細(xì)胞，從而幫助區(qū)分腫瘤惡性細(xì)胞，為腫瘤異質(zhì)性、克隆進化的研究奠定基礎(chǔ)[5-6]。PETTI 等[7]通過全基因組測序與scRNAseq相結(jié)合的方法，將急性髓系白血病細(xì)胞（包括正常核型的白血病細(xì)胞）與正常細(xì)胞區(qū)分開來，識別與亞克隆突變相關(guān)的表達特征，并找到可用于純化亞克隆以進行進一步研究的細(xì)胞表面標(biāo)志物。

腫瘤細(xì)胞具有高度異質(zhì)性，并隨時間發(fā)生演變[8]。有研究[9]表明，腫瘤干細(xì)胞不是單克隆群體，而是由不同的惡性細(xì)胞亞群組成，這導(dǎo)致了腫瘤內(nèi)的異質(zhì)性。HALBRITTER 等[10]通過scRNA-seq 制作了詳細(xì)的朗格漢斯細(xì)胞組織細(xì)胞增生癥（langerhans cell histiocgtosis，LCH）的病變分子及細(xì)胞圖譜，并利用數(shù)據(jù)庫中單細(xì)胞高分辨率研究了LCH細(xì)胞間的異質(zhì)性，證實LCH病變中存在的復(fù)雜發(fā)育層次，為LCH個性化治療提供了新的方向。GUPTA 等[11]利用scRNA-seq分析技術(shù)，同時分析數(shù)百萬兒童白血病細(xì)胞的表型和信號特征，識別出六種類型的惡性細(xì)胞，這些發(fā)現(xiàn)有助于精準(zhǔn)診療和開展免疫療法。

腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）具有異質(zhì)性。TME 的異質(zhì)性與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[12]。TME是由非腫瘤基質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成,包括免疫細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等，其通過與腫瘤細(xì)胞之間的相互作用來影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展[13]。免疫細(xì)胞的浸潤牽涉到多種細(xì)胞的參與，這些細(xì)胞群可能具有促進腫瘤生成或抗腫瘤的作用。識別免疫細(xì)胞的異質(zhì)性是導(dǎo)致腫瘤治療失敗和腫瘤演進的關(guān)鍵因素[14-15]。VILLANI 等[16]通過scRNA-seq 在外周血單個核細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了新型樹突狀細(xì)胞、單核細(xì)胞和祖細(xì)胞，將實現(xiàn)更準(zhǔn)確的功能和發(fā)育分析及健康和疾病的免疫監(jiān)測。BARYAWNO 等[17]使用scRNA-seq 技術(shù)定義了小鼠骨髓基質(zhì)中17個不同的細(xì)胞亞群及其基因特征，發(fā)現(xiàn)了在穩(wěn)態(tài)造血中表達關(guān)鍵生態(tài)位因子的基質(zhì)細(xì)胞，揭示了急性髓系白血病擾亂間充質(zhì)干細(xì)胞分化、損害正常造血功能的致病機制。為探究濾泡性淋巴瘤（follicular lymphoma，F(xiàn)L）的潛在轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)，ANDOR等[18]分析了6個原發(fā)性FL患者的34 188個細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄本，通過基因表達鑒別每一個腫瘤的正常的免疫亞群和惡性B細(xì)胞，揭示淋巴瘤與T細(xì)胞免疫檢查點的共表達基因。

2 探究腫瘤發(fā)生發(fā)展和治療耐藥性的分子機制

血液腫瘤的高度異質(zhì)性是病情進展和出現(xiàn)耐藥性的主要因素[19-20]?，F(xiàn)階段大多數(shù)治療手段沒有靶向腫瘤異質(zhì)性，而是將腫瘤當(dāng)作同質(zhì)的群體，從而導(dǎo)致腫瘤藥物治療失敗?；颊咴诮邮芑熀蟮木徑馄诳尚纬尚峦蛔兗霸黾涌寺∵M化概率，進而導(dǎo)致復(fù)發(fā)，而復(fù)發(fā)與不良預(yù)后有關(guān)，故了解耐藥的分子機制有助于減少疾病復(fù)發(fā)率、提高治愈率。BELL 等[21]應(yīng)用scRNA-seq 監(jiān)測急性髓系白血病的幼稚細(xì)胞對BET抑制劑耐藥過程的轉(zhuǎn)錄軌跡，發(fā)現(xiàn)耐藥出現(xiàn)在表觀遺傳層面，而不是遺傳層面，轉(zhuǎn)錄層面不斷動態(tài)地出現(xiàn)適應(yīng)性改變。BUUS 等[22]利用scRNA-seq 發(fā)現(xiàn)了一些組蛋白去乙?；敢种苿┲委烻ézary 綜合征耐藥的惡性細(xì)胞亞群。同時，scRNA-seq 提供了一種在單細(xì)胞水平上區(qū)分不同惡性細(xì)胞亞群變化的針對性方法，可以幫助設(shè)計新療法來對抗耐藥性。COHEN等[23]通過scRNA-seq 發(fā)現(xiàn)肽基脯氨酰異構(gòu)酶A 是多發(fā)性骨髓瘤耐藥的潛在有效治療新靶點。

了解一個正常的造血細(xì)胞如何發(fā)展成一個潛在的惡性腫瘤干細(xì)胞并最終導(dǎo)致血液惡性腫瘤，有助于認(rèn)識克隆演變的過程以及腫瘤耐藥復(fù)發(fā)的分子機制。單細(xì)胞測序可以用來檢測腫瘤異質(zhì)性、發(fā)現(xiàn)疾病治療過程中由于克隆演變引起的耐藥及復(fù)發(fā)相關(guān)的惡性克隆。由于個體患者的惡性克隆具有異質(zhì)性且處于不斷演變中，運用單細(xì)胞測序方法相比于傳統(tǒng)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)化治療方案而言，可以更詳細(xì)地了解血液腫瘤細(xì)胞亞群的基因組結(jié)構(gòu)和克隆進化，促進血液腫瘤的個體化靶向治療的實現(xiàn)[24]。ADELMAN等[25]研究者通過對急性髓系白血病患者的造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cell，HSC）的單細(xì)胞測序分析發(fā)現(xiàn)，人類HSC 的表觀遺傳重編程隨著年齡的增長而增加，這些表觀遺傳改變的基因表達水平下調(diào)，繼而導(dǎo)致了分化受損，表明髓系惡性腫瘤的風(fēng)險增加與衰老和HSC的功能衰退有關(guān)。

3 探索更精細(xì)層次的標(biāo)志物

疾病狀態(tài)的無創(chuàng)監(jiān)測、早期進展預(yù)測、治療反應(yīng)評估和復(fù)發(fā)的早期發(fā)現(xiàn)均依賴于分子標(biāo)志物，單細(xì)胞測序技術(shù)為發(fā)現(xiàn)新的分子標(biāo)志物提供了可靠工具。多發(fā)性骨髓瘤通過血液轉(zhuǎn)移時會在外周血中殘留微量的循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell，CTC），這些CTC 的遺傳信息與骨髓中的骨髓瘤細(xì)胞相同，具有相似的異質(zhì)性[26]。LOHR 等[27]應(yīng)用scRNA-seq 分析了從2 名多發(fā)性骨髓瘤患者的骨髓和外周血中收集的骨髓瘤細(xì)胞和B 細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)可以通過CD45、CD27 和CD56 標(biāo)記物來區(qū)分CTC。區(qū)分這些CTC 的分子特征可建立腫瘤克隆之間的相關(guān)性。因此，對外周血中的CTC應(yīng)用單細(xì)胞測序可在臨床環(huán)境中監(jiān)測多發(fā)性骨髓瘤，定量評估與預(yù)后和治療相關(guān)的基因，并且在揭示突變方面甚至比骨髓活檢更敏感。這些研究結(jié)果揭示了單細(xì)胞測序結(jié)合CTC取代骨髓活檢的潛力，可以廣泛應(yīng)用于更多涉及活檢的血液腫瘤疾病。LEDERGOR 等[28]利用scRNA-seq 對從正常漿細(xì)胞到多發(fā)性骨髓瘤的整個臨床進展譜進行敏感表征，在早期無癥狀和治療后有微小殘留病灶（mininal residual disease，MRD）的患者中，能夠靈敏而精確地檢測罕見的殘留腫瘤細(xì)胞，其分子特征與活動期骨髓瘤相似，這可能為個體化治療提供依據(jù)。ZHU等[29]通過對T淋巴細(xì)胞急性白血病小鼠模型的scRNA-seq，確定了一個白血病干細(xì)胞特異性表達的調(diào)控因子SPI1，該基因決定了白血病干細(xì)胞的分子特征和活性，可作為急性白血病治療的潛在新靶點。GAYDOSIK 等[30]則通過對比探究侵襲性皮膚T 細(xì)胞淋巴瘤的基因表達異質(zhì)性，揭示了PCNA、ATP5C1、NUSPA1和TOX基因的共表達模式可作為該疾病的晚期診斷分子標(biāo)志物。

單細(xì)胞測序使得研究者能夠獲得患者來源的腫瘤細(xì)胞的無偏性基因表達譜，可以前瞻性地識別腫瘤進展過程中最重要的基因或受影響的分子通路，為精準(zhǔn)診斷和疾病風(fēng)險分層、預(yù)測患者的進展風(fēng)險提供了更多分子標(biāo)簽，有助于制定相對應(yīng)的個體化治療方案。已有利用單細(xì)胞測序鑒定急性髓系白血病骨髓中各亞型細(xì)胞的基因表達譜[31]，以及輔助多發(fā)性骨髓瘤的分期和定量評估預(yù)后基因的實例[27]。JANG 等[32]通過單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)分析將骨髓活檢中的CD138陽性細(xì)胞分為4組，對應(yīng)于遞增的多發(fā)性骨髓瘤進展風(fēng)險水平，并證明了氧化磷酸化、Myc 靶點和mTORC1 信號通路的高表達與腫瘤進展相關(guān)。ZHANG 等[33]通過scRNA-seq 對B-ALL 細(xì)胞進行識別，并縱向分析了診斷階段、治療階段到復(fù)發(fā)階段的腫瘤細(xì)胞分化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)了缺氧信號通路這一有價值的治療MRD 的靶點，深入了解了MRD 細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組特征，為其他血液系統(tǒng)惡性腫瘤和實體癌癥的治療提供了研究思路。

4 精準(zhǔn)區(qū)分惡性血液腫瘤種類及測評預(yù)后

血液惡性腫瘤包括各種形式的白血病、淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤等，其中大部分血液腫瘤的發(fā)病機制均涉及多種基因突變引起的異?；虮磉_[34]。鑒于惡性血液病的不同種類疾病、不同患者群體、疾病不同階段的巨大差異[35]，scRNA-seq 能夠進行更精準(zhǔn)的區(qū)分疾病種類、危度分層，從而制定并及時改善治療方案[36]。有研究[37-38]發(fā)現(xiàn)，利用scRNA-seq在骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndromes，MDS）患者體內(nèi)也檢測到TP53 突變，但該突變在不同的惡性血液?。ˋML、CLL、ALL）中具有異質(zhì)性，這對MDS 精準(zhǔn)化診斷具有重要意義。FRAWLEY 等[39]利用scRNA-seq 對JAK2、MPL、CALR 基因進行測序，有助于提高骨髓增殖性腫瘤（myeloproliferative neoplasm，MPN）患者的檢出率，為傳統(tǒng)的MPN 突變基因篩選提供一種穩(wěn)健的解決方案。KUENDGEN等[40]運用scRNA-seq 檢測了多名使用阿扎胞苷治療MDS 患者的常見突變基因（ASXL1、RUNX1、DNMT3A、IDH1、IDH2、TET2、TP53、NRAS、KRAS、FLT3、KMT2A-PTD、EZH2、SF3B1、SRSF2），以此來評估阿扎胞苷的遠(yuǎn)期療效，并試圖找到能夠反映其預(yù)后的指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)MPN 患者具有一定風(fēng)險進展為MDS 或AML。LANGABEER 等[41]利用scRNA-seq 發(fā)現(xiàn)攜帶CBLL380P基因突變的患者，盡管沒有JAK2、MPL exon10、CA-LR exon9 突變，但其仍然具有進展為MDS 或AML 的高風(fēng)險。近年來研究發(fā)現(xiàn)t（8;21）AML患者的預(yù)后具有異質(zhì)性，遠(yuǎn)期復(fù)發(fā)率約40%，因此需要對其進行危險分層治療，進一步提高根治率。XIONG 等[42]對2 名t（8;21）AML 患者進行了scRNA-seq 分析，發(fā)現(xiàn)可用3 個生物標(biāo)志物來預(yù)測t（8;21）AML的預(yù)后。

5 評估臨床試驗有效性和安全性的利器

單細(xì)胞測序可識別各類型細(xì)胞對藥物或干預(yù)處理的響應(yīng)差異，探索臨床干預(yù)的動態(tài)調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)[43]。近年來，單細(xì)胞測序被廣泛用于精細(xì)衡量臨床試驗中新藥的有效性和安全性，如監(jiān)測急性淋巴細(xì)胞白血病和淋巴瘤的患者接受治療時外周血中的體細(xì)胞突變。ESCOBAR 等[44]通過scRNA-seq 發(fā)現(xiàn)，對TME 實施免疫刺激（即IFN 基因治療）可通過單核細(xì)胞介導(dǎo)的IFN-α 基因傳遞來抑制模型小鼠的急性淋巴母細(xì)胞白血病。嵌合抗原受體（CAR）和T細(xì)胞受體（TCR）修飾的T 細(xì)胞是當(dāng)前過繼性細(xì)胞治療技術(shù)中兩大核心技術(shù)，通過工程化編輯使得T細(xì)胞表達人工合成受體并具有特異性識別靶細(xì)胞的能力，可實現(xiàn)對血液相關(guān)腫瘤（如白血病和淋巴瘤）的長期緩解甚至治愈，正在徹底改變癌癥的治療景觀。SHEIH 等[45]通過scRNA-seq 測序鑒定人腦中的CD19 陽性壁細(xì)胞，表明正常腦組織中的一小部分壁細(xì)胞表達CD19，并被CD19 CAR-T細(xì)胞作為靶細(xì)胞，該治療可能通過增加腦血管通透性導(dǎo)致神經(jīng)毒性。scRNA-seq可能提供前所未有的高分辨率表達譜，能夠根據(jù)罕見細(xì)胞亞群中靶細(xì)胞的表達來了解CAR 治療的有效性和安全性。PARKER等[46]通過scRNA-seq分析和免疫組庫測序技術(shù)對CAR-T細(xì)胞輸注到患者體內(nèi)前后的克隆型多樣性變化、輸注后不同時期細(xì)胞基因表達特征和具體判斷何種細(xì)胞類型會有更強的克隆動力進行了深入、細(xì)致的探究，為CAR-T細(xì)胞的治療效果提升奠定了重要基礎(chǔ)。STADTMAUER等[47]利用單細(xì)胞測序探究CRISPR-Cas9編輯的TCR-T細(xì)胞在人體臨床試驗的安全性和可行性，了解了基因編輯后細(xì)胞突變比例、基因表達及體內(nèi)動態(tài)特征。在細(xì)胞免疫治療研究中應(yīng)用單細(xì)胞測序可以區(qū)分不同的免疫細(xì)胞組，分析浸潤淋巴細(xì)胞的不同CAR-T細(xì)胞亞型和克隆擴增，從而有助于個性化的一線治療。推進CAR-T細(xì)胞療法的一個重要方向是利用scRNA-seq 開發(fā)預(yù)測臨床結(jié)果的生物標(biāo)志物。目前，CAR-T細(xì)胞是使用患者自身的T 細(xì)胞生產(chǎn)的，因此CAR-T 質(zhì)量和個體差異可能有很大關(guān)系。單細(xì)胞測序研究可以將輸注前將CAR-T 細(xì)胞產(chǎn)品中的T 細(xì)胞特性與患者反應(yīng)聯(lián)系起來，有助于開發(fā)預(yù)測療效的生物標(biāo)志物。

6 結(jié)語

結(jié)合二代測序技術(shù)的單細(xì)胞測序分析在揭示免疫細(xì)胞異質(zhì)性和深入理解血液腫瘤發(fā)病與耐藥機制、疾病分層、疾病進展監(jiān)測和靶向治療反應(yīng)性等方面已經(jīng)顯示出了良好的實用價值。目前，結(jié)合質(zhì)譜、光譜等其他領(lǐng)域尖端技術(shù)的單細(xì)胞基因組、單細(xì)胞蛋白組等技術(shù)手段，以及已擺脫單細(xì)胞分離難題的空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)層出不窮，未來這些技術(shù)將和scRNA-seq 結(jié)合起來，互相補充，共同促進對血液系統(tǒng)腫瘤的生理和病理過程在單個細(xì)胞精度和細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)層面上的綜合認(rèn)知?？梢灶A(yù)見的是，未來單細(xì)胞測序相關(guān)技術(shù)將更廣泛地應(yīng)用于各種血液腫瘤和免疫的研究，助力開發(fā)更好的診斷及預(yù)后測評的生物標(biāo)志物，促進設(shè)計個體化的抗腫瘤方案，以提高治療效果并避免耐藥性?？傊?，未來單細(xì)胞測序的應(yīng)用將具有深遠(yuǎn)和廣闊的臨床前景。