魏煒 王天雨 孟鑫 張超 李娜 楊志新 任立群

(承德醫(yī)學院河北省神經(jīng)損傷與修復重點實驗室，河北 承德 067000)

阿爾茨海默病(AD)是發(fā)生在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的退行性疾病〔1〕。雖然對AD的研究已取得了較大進展，但對其在認知功能和行為能力方面造成進行性損害的病因尚不明確，且無特效治愈藥物，目前的治療僅可進行對癥治療和延緩AD進展。關于AD的發(fā)病機制，目前存在多種假說〔2〕，主要為：①膽堿能功能缺陷假說；②淀粉樣假說，β-淀粉樣蛋白(Aβ)的異常沉積；③Tau蛋白過度磷酸化并聚集成神經(jīng)原纖維纏結(NFT)而引起的Tau蛋白病;④氧化應激和鈣調節(jié)失衡等。自1932年電子顯微鏡發(fā)明以來，對細胞超微結構的研究進一步深入。AD患者及大鼠的神經(jīng)元超微結構改變主要為：海馬CA1區(qū)神經(jīng)元萎縮，形態(tài)不規(guī)則；細胞外Aβ聚集形成中心結構均一，外圍呈星狀的淀粉樣蛋白核心，被營養(yǎng)障礙性突起所包圍；神經(jīng)元線粒體腫脹、數(shù)目減少，分布不均，嵴排列不規(guī)則或斷裂變短，基質變淺，線粒體膜模糊、空泡化；內質網(wǎng)應激產(chǎn)生，內質網(wǎng)腔增大、腫脹；含脂滴的次級溶酶體數(shù)量增加，脂褐素沉積增多;星形膠質細胞腫大增生呈活化狀態(tài)。本文擬從AD的超微結構研究方向進行綜述。

1 Tau蛋白形成與NFT

Tau 蛋白是一種主要的微管相關蛋白，通過與微管蛋白的結合對微管的穩(wěn)定和軸漿流動的維持起著重要作用，而過度磷酸化的Tau蛋白可以分解微管，導致微管堵塞，進而導致了NFT的形成，阻礙軸漿流動，誘導神經(jīng)元變性〔3〕。在已知的17號染色體相關的額顳葉癡呆合并帕金森綜合征(FTDP-17)家族中，如外顯子10(P301L,P301S,N279K)、外顯子 9 (G257T,G272V)、外顯子12 (V337M)、外顯子 13 (R406W)〔4〕,其表達與Tau蛋白的過度磷酸化有關。增強了P301S表達的轉基因大鼠，在早期就出現(xiàn)了Tau蛋白過度磷酸化表達，超微結構提示了大鼠軸突纖維喪失和脫髓鞘改變，證實了軸突末端過度磷酸化的Tau蛋白積累與軸突變性、脫髓鞘改變、神經(jīng)肌肉接處的神經(jīng)缺失、肌肉萎縮有關〔5〕。關于Tau蛋白的超微結構一直沒有得到證實，實驗中多采用免疫組織化學染色的方法對其過度磷酸化進行檢測，目前研究已經(jīng)可以通過分辨率3.4～3.5 ?的低溫冷凍電鏡技術得到展示，其結構為神經(jīng)原纖維病變中成對的螺旋和直絲(PHF和SF)組成的特征結構和相應的原子模型。該細絲核心由兩個相同的原絲組成，包括Tau蛋白的306～378殘基，它們采用了β-交叉/β-螺旋結構的結合，形成了Tau聚集的種子模型。而成對的PHF和SF在原絲間排列方式的不同，表明了其超微結構的多態(tài)性〔6〕。

2 Aβ沉積

Aβ是由淀粉樣前體蛋白 (APP) 經(jīng)一系列α-/β-/θ-分泌酶切割水解產(chǎn)生的，其中產(chǎn)生的Aβ1～40和 Aβ1～42蛋白更具有神經(jīng)毒性〔7〕，沉積在大腦皮層和海馬區(qū)域的細胞外形成老年斑(SP)，能導致神經(jīng)元的過氧化損傷、Tau 蛋白過度磷酸化、炎癥反應損傷、營養(yǎng)障礙性突起、突觸損傷甚至神經(jīng)元凋亡〔8〕，最終導致AD的發(fā)生。現(xiàn)在常用的APP/早老素(PS)1轉基因小鼠，其原理為轉入的人APP基因過表達，產(chǎn)生大量的APP，而PS1的共表達促進了Aβ1-42的產(chǎn)生。Aβ的超微結構為細胞外密集堆積的原纖維和細絲〔9〕，聚集形成中心結構均一，外圍呈星狀的淀粉樣蛋白核心，被營養(yǎng)障礙性突起所包圍的典型神經(jīng)炎性斑塊，周圍可見退變或即將消失的突觸結構和板層解離的髓鞘。Aβ也可沉積于轉基因鼠的海馬微血管旁及微血管壁，其位置可能在基膜層及基膜層外的神經(jīng)氈結構中〔10〕。在利用斑馬魚自身啟動子appb調控人源APPsw建立的AD轉基因斑馬魚模型中也得到證實，6月齡的APPsw 轉基因斑馬魚血管上出現(xiàn)Aβ沉積導致血管超微結構變化，而神經(jīng)元的變化出現(xiàn)在9月齡的轉基因斑馬魚上。Aβ對腦微血管的影響早于對神經(jīng)元的影響，其對AD的作用是相互作用、相互促進的〔11〕。Aβ的產(chǎn)生與其清除之間的不平等是最重要的因素：其清除途徑有：(1)自噬體的產(chǎn)生，在AD小鼠模型腦組織中發(fā)現(xiàn)，自噬體的產(chǎn)生早于Aβ在小鼠神經(jīng)元周圍的聚集〔12〕。體外細胞學實驗證實Aβ無論是由轉基因細胞HEK293產(chǎn)生還是外源性加入，均可誘導自噬體的產(chǎn)生和自噬標志物微管相關蛋白(LC)3過表達，在電鏡下可觀察到具有雙層膜的早期自噬體和囊泡狀的晚期自噬體。Aβ42相比Aβ40伴隨自噬表現(xiàn)出的細胞毒性更強〔13〕。(2)最主要的是通過膠質細胞的膠質蛋白清除，包括：①星形膠質細胞產(chǎn)生低密度脂蛋白受體與Aβ結合使其降解〔14〕；②小膠質細胞吞噬Aβ蛋白，但小膠質細胞激活后產(chǎn)生的炎癥反應也會對神經(jīng)元細胞造成損傷〔15〕。(3)血腦屏障(BBB)轉運出腦。腦內及外周Aβ由BBB上的晚期糖基化終產(chǎn)物受體(RAGE)將外周的Aβ轉運至大腦，BBB上的低密度脂蛋白受體相關蛋白(LRP)-1介導的大腦內Aβ轉運通過BBB進入血液〔16〕。

3 線粒體改變

線粒體為突觸前神經(jīng)遞質釋放提供所需的能量〔17〕。研究表明，與非突觸線粒體相比，突觸線粒體具有不同的形態(tài)和蛋白質組學特征，這可能使突觸特別容易變性〔18〕。由于突觸是高能量需求的場所，因此必須將線粒體運送到該位置。而Tau蛋白在線粒體順行轉運所需微管的結合和穩(wěn)定中起著至關重要的作用〔19〕。有研究表明，病理性的Tau蛋白可以干擾此轉運過程〔20〕。而線粒體功能障礙和氧化應激已被發(fā)現(xiàn)是AD患者和AD動物模型的早期和顯著特征〔21〕。在AD的患者和動物模型中，均可見到線粒體的分裂增加、融合減少，超微結構表現(xiàn)為線粒體腫脹變大變圓且數(shù)目減少，分布不均，嵴排列不規(guī)則或斷裂變短，基質變淺，線粒體膜模糊、空泡化〔22〕。在分析了人類兩個大腦區(qū)域前/后橫顳葉皮質(BA41/42)和背外側前額葉皮質(BA46)的不對稱突觸的超微結構后，觀察到線粒體在突觸前末梢中是突觸后末梢的兩倍至三倍多。超微結構顯示了異常的線粒體形態(tài)，突觸中多囊泡體的存在及AD中斑塊附近突觸長度的減少。證實了在AD中突觸線粒體的區(qū)域特定變化，并支持了AD中線粒體向突觸前末端的轉運或突觸線粒體動力學改變的觀點〔23〕。在調控融合蛋白線融素(Mfn)2表達消融的大鼠中，電子顯微鏡顯示海馬神經(jīng)元和許多皮層神經(jīng)元出現(xiàn)線粒體腫脹和嵴結構異常，線粒體的長寬比均接近1，包含許多小的囊性嵴，其外膜呈彌漫性結構，缺乏雙膜結構及線粒體膜的破裂甚至外膜幾乎不可見。表明成年神經(jīng)元中的Mfn2消融會引起線粒體破碎和功能障礙，從而通過涉及AD受損的大腦區(qū)域中神經(jīng)炎癥的氧化應激反應導致神經(jīng)變性〔24〕。

針灸作為國粹，其對AD治療也得到認可。通過針刺AD轉基因大鼠的“百會”“涌泉”“大椎”“腎俞”“太溪”等穴位，可明顯改善AD轉基因大鼠的認知能力，超微結構的觀察中可見到線粒體的結構恢復、功能改善〔25〕。針刺6月齡SAMP8小鼠的“百會”“血海”“腎俞”“膈俞”穴，可使其大腦海馬神經(jīng)元線粒體分裂蛋白(Fis)1的表達減少、線粒體融合蛋白(OPA)1的表達增加，有效提高SAMP8小鼠學習記憶能力，減少線粒體動力學異常，超微結構與模型組相比，線粒體形態(tài)基本正常，少數(shù)嵴腔擴張、嵴溶解〔26〕。

4 內質網(wǎng)改變

內質網(wǎng)是最大的細胞器，具有網(wǎng)狀的膜結構，由粗面內質網(wǎng)和滑面內質網(wǎng)組成，粗面內質網(wǎng)與核糖體相關，控制蛋白翻譯；滑面內質網(wǎng)包括核膜、細胞質池和小管〔27〕?；鎯荣|網(wǎng)多沿軸突分布，介導細胞微管骨架和線粒體的正常組織結構〔28〕。管狀內質網(wǎng)是滑面內質網(wǎng)的一部分，有證據(jù)表明它可能介導囊泡運輸和(或)細胞器接觸，控制細胞通信，調節(jié)線粒體融合和分裂〔29〕。網(wǎng)狀蛋白(RTN)是形成管狀內質網(wǎng)所必需的〔30〕。在RTN3免疫反應性營養(yǎng)不良神經(jīng)軸突(RIDNs)的超微結構中，在軸突末端逐漸積累了管狀內質網(wǎng)，并且管狀內質網(wǎng)異常分布和走向軸突末端出現(xiàn)年齡相關性。在來自AD腦的活檢樣本中的淀粉樣斑塊周圍發(fā)現(xiàn)了這種異常的管狀內質網(wǎng)包涵體。在功能上，異常聚集的管狀內質網(wǎng)在營養(yǎng)不良性軸突(DNs)形成的早期階段誘導線粒體裂變增強，并在后期階段最終導致線粒體變性〔31〕。Aβ沉積引起的內質網(wǎng)應激被認為是AD神經(jīng)元凋亡的重要機制〔32〕。在透射電鏡下 APP/PS1小鼠的大腦皮層神經(jīng)元內質網(wǎng)腔增大和腫脹，提示APP/PS1小鼠存在內質網(wǎng)應激，而表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)的應用對APP/PS1小鼠皮層異常有明顯的抑制作用，EGCG還顯著降低了APP/PS1小鼠大腦皮層內質網(wǎng)應激標志物GRP78、應激相關的凋亡蛋白CHOP 和Caspase12表達水平〔33〕。

5 突觸萎縮

突觸由3個要素組成：突觸前膜、突觸間隙和突觸后膜，突觸連接不僅是神經(jīng)元之間的連接，而且是將動作電位從一個神經(jīng)元傳遞到另一個神經(jīng)元的通道〔34〕。突觸前膜中突觸小泡儲存神經(jīng)遞質，線粒體為神經(jīng)遞質的釋放提供能量〔35〕。突觸損傷與丟失是AD的一個重要特征。突觸超微結構變化主要為突觸間隙模糊，突觸前后膜界限不清，突觸后膜致密層減少甚至消失〔36〕，海馬區(qū)線粒體異常，包括嵴膨大、斷裂合并突觸數(shù)量的減少〔37〕。APP/PS1轉基因大鼠的海馬GrayⅠ型突觸活性長度較野生型大鼠明顯縮短，但突觸間隙面積、突觸界面曲率、突觸后致密物厚度無差異〔36〕。該變化也會出現(xiàn)在小腦的浦肯野細胞層。超微結構提示老化的突觸前末梢的突觸小泡和線粒體數(shù)量減少，突觸前和突觸后膜的特殊區(qū)域變薄〔38〕。小腦顆粒細胞的平行纖維與浦肯野細胞的棘突形成興奮性突觸聯(lián)系(PF-PC)，其突觸后致密區(qū)(PSD)厚度變薄，突觸間隙變寬，突觸活性帶長度變短及突觸界面曲率變小，最終導致突觸的傳遞效能減弱〔39〕。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)調控突觸活動和突觸可塑性〔40〕。突觸素是突觸小泡特異性標記蛋白，與突觸的生長、修復、再生和突觸重塑密切相關〔41〕。其在AD模型小鼠的表達均減少〔39〕。而不論基因型或飲食，均未觀察到大腦皮層神經(jīng)元突觸數(shù)量的差異和線粒體結構、數(shù)量的變化〔37〕。

6 膠質細胞作用

6.1小膠質細胞 小膠質細胞是大腦的固有免疫細胞，使用模式識別受體復合物識別并響應sAβ和fAβ〔42〕。下游信號傳導誘導腫瘤壞死因子(TNF)α和白細胞介素(IL)-1β分泌，它們通過趨化作用募集附近的小膠質細胞，并可能引發(fā)失控的炎癥反應，損傷神經(jīng)元并引發(fā)突觸損失小膠質細胞對Aβ清除的作用可以防止Aβ沉淀到纖維斑中，并降低引起神經(jīng)退行性的有害sAβ的腦內濃度〔43〕。小膠質細胞在超微結構上表現(xiàn)為特征性豆狀核，含有密集的異染色質，細胞體中含有大量的線粒體，這些線粒體通常與內質網(wǎng)的典型長片段緊密相連，偶爾伴有高爾基體和吞噬囊泡。APP/PS1小鼠的海馬CA1區(qū)的小膠質細胞在與fAβ斑塊相互作用時結構明顯改變，包括突觸結構、吞噬體系統(tǒng)的明顯變化、顯示出內質網(wǎng)應激的增加跡象、脂質包裹體的數(shù)量顯著增加。在AD人腦的小膠質細胞超微結構中，也發(fā)現(xiàn)小膠質細胞接觸營養(yǎng)不良的神經(jīng)突和樹突棘，形成了多個接觸，幾乎完全包圍了營養(yǎng)不良性神經(jīng)突的多個側面，其中含有一個或多個吞噬包涵體〔44〕。

6.2星形膠質細胞 星形膠質細胞的活化通常被認為是AD中的神經(jīng)炎癥毒性反應。反應性星形膠質細胞可通過吞噬和降解Aβ來限制淀粉樣病變〔45〕。而星形膠質細胞的反應性可以通過中間絲蛋白(GFAP)的表達增加及形態(tài)上通過其突起的肥大部分在淀粉樣蛋白斑塊附近被明確識別〔46〕。APP/PS1小鼠海馬中Aβ斑塊周圍的反應性星形膠質細胞廣泛均勻地遍及年輕APP/PS1小鼠海馬所有區(qū)域，不管該區(qū)域有沒有細胞外淀粉樣蛋白沉積。反應性星形膠質細胞在APP/PS1小鼠海馬的斑塊內和斑塊周圍表現(xiàn)出具有肥大形態(tài)的反應性表型和擴展過程，GFAP表達增強，包裹并吞噬了營養(yǎng)不良性軸突和突觸前部分，其星形膠質細胞反應性隨年齡及淀粉樣蛋白病理改變平行發(fā)展。同時還在AD患者的海馬中檢測到了這些吞噬性星形膠質細胞〔47〕。APP/PS1 轉基因小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元和星形膠質細胞內線粒體固縮，含脂滴的次級溶酶體數(shù)量增加;星形膠質細胞腫大增生呈活化狀態(tài)，并吞噬營養(yǎng)障礙性突觸〔48〕。

綜上，關于AD的研究已持續(xù)百年，隨著研究技術的進步，從疾病表現(xiàn)、診斷、治療的臨床層面到發(fā)病機制、模型復制、分子生物學、基因學的研究，醫(yī)務工作者、科研工作者對其研究到達了全新的高度。電子顯微鏡技術在分子生物學的協(xié)作下對超微結構的研究更加細化，因為倫理的關系，對AD的超微結構研究停留在復制的動物模型和患者死后的尸體解剖上，動物模型畢竟不完全等同于人類，死后的代謝改變對研究也有一定干擾，電子顯微鏡所需組織僅需1 mm3，如能在AD患者的腦組織中進行活檢取材，發(fā)現(xiàn)新的突觸變化或內質網(wǎng)-線粒體連接改變及膠質細胞發(fā)揮的雙向作用，會有更大研究突破。