外泌體在過敏性疾病中的研究進(jìn)展

呂婷 劉東璞 盛延良 薛超 彭玲 盧鳳美

(佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生態(tài)-免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)與相關(guān)疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 佳木斯 154007)

過敏性疾病因其復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制和臨床表現(xiàn)對(duì)于臨床醫(yī)學(xué)的診斷、治療及法醫(yī)學(xué)鑒定方面都是急需解決的一項(xiàng)難題。外泌體是一種大小為30～150 nm的雙層膜囊泡。其強(qiáng)大的細(xì)胞通訊功能可直接影響下游細(xì)胞功能及生物學(xué)特性，在固有免疫應(yīng)答中Toll樣受體(TLR)調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)及調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化外泌體在過敏性疾病中都發(fā)揮不可磨滅的作用。過敏性疾病在全球目前呈持續(xù)增長(zhǎng)的趨勢(shì)，自2000年以來，食物過敏、嗜酸性食管炎和藥物性過敏反應(yīng)的流行率已上升到流行病的比例〔1〕。不同疾病釋放的外泌體含量及特異性遺傳信息也不盡相同〔2〕。在過敏性疾病中，外泌體釋放數(shù)量各有差異，外泌體內(nèi)攜帶的物質(zhì)信息亦有區(qū)別。本文主要論述外泌體的基本特征及其在過敏性疾病的作用。

1 外泌體概述

1.1外泌體發(fā)現(xiàn) 1983年，學(xué)者在綿羊的網(wǎng)織紅細(xì)胞中首次發(fā)現(xiàn)外泌體的存在，剛開始人們都認(rèn)為外泌體是人體的一種沒有任何作用的排泄物，并未過多關(guān)注〔3〕。后來發(fā)現(xiàn)它是有功能的，主要參與物質(zhì)之間的信息傳遞交流及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等，隨后1987年被命名為外泌體。外泌體幾乎被除成熟紅細(xì)胞外的所有細(xì)胞釋放，在人體血液〔4〕、尿液〔5〕、唾液〔6〕、支氣管肺泡灌洗液(BALF)〔7〕中均可檢測(cè)不同含量外泌體。

1.2外泌體釋放機(jī)制和功能 外泌體釋放機(jī)制主要為兩種：(1)細(xì)胞膜外部分子內(nèi)化形成核內(nèi)體，晚期核內(nèi)體通過核內(nèi)體膜進(jìn)一步內(nèi)出芽變?yōu)橐粋€(gè)小的囊泡(ILV)，隨之形成許多囊腔內(nèi)多囊體即多泡體( MVBs)。(2)內(nèi)分體分類復(fù)合體(ESCRT)獨(dú)立出芽〔8〕，ESCRT由30種蛋白質(zhì)組成，其中包含4種功能亞復(fù)合物，ESCRT-0亞復(fù)合物分隔泛素化的蛋白TSG101和 VPS4B，ESCRT-Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ直接輔助ILVs出芽，而液泡蛋白分選因子復(fù)合物Vps4確保了最終的膜斷裂和(或)ESCRT循環(huán)，最后輔助因子凋亡連鎖基因2相互作用蛋白(ALI)X將膜蛋白分成囊泡，囊泡隨后出芽成MVBs〔9〕。整個(gè)ESCRT通路過程是ATP酶依賴的，它通過酶作用完成膜脫落〔10〕。MVBs最終與細(xì)胞膜融合，此時(shí)多泡體內(nèi)物質(zhì)被釋放入外部環(huán)境中，即外泌體。外泌體主要作用：(1)疾病的診斷，其攜帶豐富的信息及外部雙層膜結(jié)構(gòu)，可有效避免囊泡內(nèi)物質(zhì)被破壞。外泌體存在于各體液中，易于獲取。Jin等〔11〕在腺癌(AC)和鱗狀細(xì)胞癌(SCC)患者研究中發(fā)現(xiàn)，AC患者外泌體內(nèi)miR-181-5p、miR-30a-3p、miR-30e-3p和miR-361-5p與健康志愿者相比顯著增高(P<0.05)，SCC患者外泌體中miR-10b-5p、miR-15b-5p和miR-320b特異性強(qiáng)，有助于AC和SCC診斷。(2)參與細(xì)胞間通訊，構(gòu)建新的物質(zhì)傳輸載體通路，是攜帶藥物適合的載體。外泌體分子結(jié)構(gòu)小，生物相容性高，可攜帶核酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等。Tian等〔12〕研究表明靜脈注射靶向外泌體能將阿霉素特異性輸入腫瘤組織中，能抑制腫瘤生長(zhǎng)且未表現(xiàn)出明顯毒性。(3)疾病的治療靶點(diǎn)，將不同細(xì)胞來源的外泌體作為治療靶點(diǎn)治療疾病。Kordelas等〔13〕實(shí)驗(yàn)證明將間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)來源的外泌體用于移植物抗宿主病治療發(fā)現(xiàn)患者對(duì)外泌體的重復(fù)注射耐受性良好，不僅沒有實(shí)質(zhì)性的副作用，還可減輕患者臨床癥狀。

1.3外泌體的提取及鑒定 目前外泌體的提取主要是使用離心法，首先用低速離心除去液體中的大質(zhì)量蛋白，然后采取超高速離心法便可分離出大小均勻的外泌體，該方法可以得到較純凈的外泌體。該方法操作較麻煩，提取率相對(duì)較低，目前仍是主要使用的方法。試劑盒(Invitrogen、Exo-spinTM)等提取外泌體更高效快捷，未來可能替代離心法成為一種新的趨勢(shì)。鑒定外泌體可在投射電鏡下觀察外泌體形態(tài)均勻多呈杯狀或盤狀、大小一致，均為30～150 nm，也可以通過外泌體表面特異性采用標(biāo)記蛋白經(jīng)蛋白印跡技術(shù)，可見CD63、CD9、CD81等高表達(dá)。納米粒子追蹤分析亦可對(duì)外泌體進(jìn)行定量分析，且能更好減少外泌體結(jié)構(gòu)被破壞〔5〕。

2 外泌體與過敏性疾病

2.1外泌體與變態(tài)反應(yīng)性鼻炎(AR) 特異性個(gè)體接觸過敏原后，引起各種免疫活性細(xì)胞與細(xì)胞炎性介質(zhì)共同參與的鼻黏膜慢性非感染性炎癥即過敏性鼻炎，且這一過程是由IgE介導(dǎo)的〔14〕。IgE與肥大細(xì)胞表面受體結(jié)合導(dǎo)致輔助性T細(xì)胞Th1/Th2平衡失調(diào)，Th2釋放促炎介質(zhì)白細(xì)胞介素(IL)-5、IL-4等引起過敏反應(yīng)。Zhu等〔15〕在AR 患者鼻腔黏液和用卵清蛋白(OVA)刺激的鼻腔上皮細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中不僅發(fā)現(xiàn)鼻腔黏液中可分離出外泌體，還可見長(zhǎng)鏈非編碼RNA生長(zhǎng)停滯特異性轉(zhuǎn)錄本(LncGAS)5高表達(dá)。研究結(jié)果表明上皮來源外泌體LncGAS5部分通過下調(diào)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子T-bet和Zeste Homolog2的增強(qiáng)子(EZH)2來介導(dǎo)Th1/Th2的分化，主要是抑制Th1分化，促進(jìn)Th2分化，由此可見lncGAS5 是介導(dǎo) Th1/Th2 細(xì)胞分化的不可缺少的介質(zhì)，這項(xiàng)研究也表明外泌體在AR中的關(guān)鍵介質(zhì)作用。Wang等〔16〕在鼻炎患者鼻黏膜檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，相對(duì)健康測(cè)試者AR患者鼻黏液中高表達(dá)外泌體lncRNA核旁斑點(diǎn)組裝轉(zhuǎn)錄本(NEAT)1，而NEAT1表達(dá)與鼻炎的嚴(yán)重程度相關(guān),這一過程主要是通過調(diào)節(jié)microRNA-511/核受體亞家族4A組成員(NR4A)2軸而實(shí)現(xiàn)的。Wu等〔17〕在IgE水平升高的臍帶血和AR兒童鼻黏液提取到的外泌體中發(fā)現(xiàn)miR-21和miR-126水平顯著降低。隨后將miR-21前體轉(zhuǎn)染到單核細(xì)胞中抑制了轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)β受體(TGFBR)2的表達(dá)，可見miR-21在調(diào)節(jié)TGFBR2中發(fā)揮作用。而TGFBR2在之前的證據(jù)表明可能是抑制IgE產(chǎn)生的代償機(jī)制〔18〕。除此之外，F(xiàn)ang等〔19〕實(shí)驗(yàn)證明人間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞的小細(xì)胞外泌體可通過傳遞miR-146a-5p來減輕第2組先天淋巴樣細(xì)胞顯性的過敏性氣道炎癥，包括過敏性鼻炎、支氣管哮喘(BA)等。

2.2外泌體與BA 哮喘是最普遍的慢性呼吸道疾病之一，影響著世界上近3億人〔20〕。在對(duì)中國北京2010～2011年14歲以上哮喘患者流行病學(xué)調(diào)查顯示，哮喘的發(fā)病率為1.19%，且有增加趨勢(shì)〔21〕。

2型細(xì)胞驅(qū)動(dòng)氣道炎癥引起哮喘發(fā)生，特異性病理表現(xiàn)主要為氣道內(nèi)嗜酸性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞,還有中性粒細(xì)胞及各種炎細(xì)胞浸潤。目前哮喘的治療目標(biāo)仍然控制癥狀和炎癥因子以避免病情惡化。Mazzeo等〔22〕研究發(fā)現(xiàn)與健康者相比，哮喘患者嗜酸性粒細(xì)胞可以釋放的外泌體數(shù)量更多,且對(duì)哮喘發(fā)病及病情嚴(yán)重程度可能有作用。嗜酸性粒細(xì)胞分泌的外泌體導(dǎo)致氣道黏液分泌增多，小氣道的痙攣還能反作用于嗜酸性粒細(xì)胞釋放更多外泌體，而氣道高反應(yīng)性的增加也是其分泌的外泌體通過活化及增強(qiáng)促炎因子的聚集和釋放達(dá)到的。Du等〔23〕研究證實(shí)間充質(zhì)干細(xì)胞源外泌體可以上調(diào)哮喘患者外周血單核細(xì)胞M2 樣表型中的TGF-β1和 IL-10 來刺激調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)增殖和分泌從而發(fā)揮抗炎作用，而這一反應(yīng)可能是通過抗原遞呈細(xì)胞的內(nèi)化而實(shí)現(xiàn)的。外泌體可以攜帶體內(nèi)各遺傳物質(zhì)隨著體液及胞吞胞吐作用轉(zhuǎn)運(yùn)至相應(yīng)靶細(xì)胞發(fā)揮作用，從而有助于哮喘的治療。其中哮喘患者BALF中miRNA-449已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)可以調(diào)節(jié)氣道纖毛細(xì)胞的分化，促進(jìn)中心粒增殖和多纖毛發(fā)生，部分是通過靶向NOTCH1mRNA發(fā)揮作用的〔24〕。研究發(fā)現(xiàn)哮喘患者的BALF外泌體中存在大量的白三烯(LTs)C4合酶(LTC4S)，而超敏反應(yīng)釋放的炎癥因子LTs途徑被證明存在于外泌體，是LTs生物合成酶的載體，改變毛細(xì)血管和微靜脈血管通透性，引起哮喘發(fā)生外泌體的半胱氨酸(cys)LT代謝能力同時(shí)也增強(qiáng)了外泌體特異性釋放的具有更強(qiáng)大信使功能的納米囊泡〔25〕。在重型哮喘的研究中，Haj-Salem等〔26〕發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重哮喘患者的成纖維細(xì)胞中釋放的外泌體中TGF-β2增強(qiáng)，導(dǎo)致上皮細(xì)胞增殖減少，而下調(diào)TGF-β2則增強(qiáng)上皮細(xì)胞增殖，在嚴(yán)重哮喘患者外泌體檢測(cè)中證實(shí)TGF-β2明顯低于健康者，此項(xiàng)實(shí)驗(yàn)亦證明外泌體中至少部分促進(jìn)氣道重塑。嚴(yán)重的類固醇抗性哮喘(SSRA)患者由于抵抗類固醇激素導(dǎo)致治療效果極差，生活質(zhì)量嚴(yán)重惡化。Dong等〔27〕發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體(MSC-Exo)處理對(duì)巨噬細(xì)胞極化、核因子(NF)-κB和磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信號(hào)通路的影響依賴于腫瘤壞死因子相關(guān)因子(TRAF)1，通過抑制TRAF1來重塑巨噬細(xì)胞的極化，調(diào)整炎癥從而可改善SSRA。

2.3外泌體與過敏性接觸性皮炎(ACD) ACD是一種由接觸皮膚的各種物質(zhì)的免疫反應(yīng)引起的皮疹〔28〕。其發(fā)病率尚未明確定義，但其發(fā)病率一直被認(rèn)為是持續(xù)增加的，常見的相關(guān)過敏原包括羊毛脂、甲醛、倍半萜內(nèi)酯混合物及ACD患者個(gè)人護(hù)理用品中各種成分。ACD臨床表現(xiàn)多樣而復(fù)雜，癥狀輕微的ACD常使人心情煩躁，嚴(yán)重時(shí)還會(huì)影響患者日常生活，甚至工作能力，由此引起的一些民事醫(yī)療索賠案件也占有一定比例〔29〕。此外，ACD很少單獨(dú)存在，常伴隨AR、過敏性哮喘等其他過敏性反應(yīng)同時(shí)存在。角質(zhì)形成細(xì)胞是皮膚最外層保護(hù)屏障,角質(zhì)形成細(xì)胞排列紊亂，角質(zhì)層呈網(wǎng)籃狀是ACD常見病理變化,有學(xué)者在ACD患者血液中提取超出正常人群數(shù)量的外泌體,通過電鏡觀察出外泌體的大小,用二代基因測(cè)序發(fā)現(xiàn)最具差異表達(dá)的miRNA-150-5p，然后將不同濃度的外泌體與角質(zhì)形成細(xì)胞共同培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)不同濃度的培養(yǎng)皿中可檢測(cè)到炎癥介質(zhì)IL-33、趨化因子CXCL1、CXCL2不同程度上調(diào)，而間充質(zhì)來源外泌體可通過抑制促炎因子表達(dá)，增強(qiáng)抗炎因子表達(dá)從而發(fā)現(xiàn)治療ACD可行靶點(diǎn)〔30〕。此外，外泌體中miRNA-150-5p還可在ACD中參與各種通路的表達(dá),靶向作用于人高遷移率族ATHook蛋白(HMG)2基因，促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖、細(xì)胞活化及炎癥發(fā)生〔31〕。

2.4外泌體與過敏性休克(AS) AS是一種嚴(yán)重的、快速發(fā)展的、可能致命的全身反應(yīng)。接觸過敏原后，觸發(fā)機(jī)體發(fā)生反應(yīng)，引起肥大細(xì)胞脫顆粒釋放出許多影響血管通透性、血管平滑肌張力和支氣管的炎性介質(zhì)及細(xì)胞因子(LTs、C3a、C5a)等，激活全身炎癥級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)，從病理生理學(xué)角度來看，這一機(jī)制主要是IgE與受體(FcεRI)結(jié)合介導(dǎo)的。另一機(jī)制主要由巨噬細(xì)胞、嗜堿粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等與FcγRⅢ結(jié)合誘導(dǎo)特異性過敏反應(yīng)，即非IgE依賴的過敏反應(yīng)〔32〕。不論是經(jīng)過哪一途徑，作為過敏性疾病最嚴(yán)重的疾病發(fā)展，其中損害最嚴(yán)重的就是循環(huán)呼吸系統(tǒng)，引起血管擴(kuò)張，痙攣、器官組織處于充血狀態(tài)導(dǎo)致大量體液流失出現(xiàn)休克癥狀。如果沒有及時(shí)發(fā)現(xiàn)救治患者很快死亡，由此可引起一系列醫(yī)療糾紛和死亡鑒定困難等問題。而外泌體作為信息通路的傳播載體，在AS發(fā)病機(jī)制、診斷及治療中起十分重要的作用。TLR作為機(jī)體保護(hù)性的免疫哨兵，能夠感應(yīng)與病原體相關(guān)的分子模式，識(shí)別損傷細(xì)胞分子及內(nèi)源性配體，介導(dǎo)炎癥的發(fā)生。一方面外泌體可通過TLR2調(diào)控固有免疫，擴(kuò)大TLR2對(duì)病原體的識(shí)別范圍，促進(jìn)免疫識(shí)別,這是通過TRL2/TRL4/MyD88通路實(shí)現(xiàn)的〔33〕。另一方面外泌體可調(diào)控TLR4,在固有免疫中作為運(yùn)輸?shù)妮d體運(yùn)輸疾病診斷的標(biāo)志物miRNA。Fang等〔34〕在對(duì)弓形蟲感染的小鼠實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，熱休克蛋白70可引起感染小鼠發(fā)生致命性過敏反應(yīng)，而該反應(yīng)主要依賴TLR4/MyD88通路，熱休克蛋白70作為外泌體表面特異性標(biāo)志物之一，也提示著外泌體在致命性過敏反應(yīng)中扮演的重要角色。

綜上，外泌體目前作為疾病診斷和治療的研究熱點(diǎn)，不僅在過敏性疾病中受到廣泛關(guān)注，在腫瘤、消化系統(tǒng)疾病、呼吸系統(tǒng)疾病及循環(huán)系統(tǒng)疾病中也有不可或缺的作用。生理狀態(tài)下外泌體承接運(yùn)輸載體的作用，激活信號(hào)傳輸至相應(yīng)靶點(diǎn)發(fā)揮生物效應(yīng)。病理狀態(tài)下被大量釋放，擴(kuò)大物質(zhì)信號(hào)傳遞，促進(jìn)炎癥發(fā)生。同時(shí)在過敏性疾病中炎癥因子及信號(hào)通路中通過各種運(yùn)輸傳遞方式介導(dǎo)各種過敏性疾病的發(fā)生發(fā)展。鑒于過敏性疾病的復(fù)雜性，外泌體的功能及作用還需進(jìn)一步研究。過敏性疾病治療主要是對(duì)癥治療，外泌體獨(dú)特的藥物運(yùn)輸載體優(yōu)勢(shì)不僅可考慮引入過敏性疾病的長(zhǎng)期預(yù)防或急救治療，還可考慮運(yùn)用到臨床診斷中，使得臨床醫(yī)生在診斷和治療過敏性疾病更快捷方便。在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中由于過敏性猝死案例中常無法得知死者的過敏史、疾病史及生前的治療史等等使得法醫(yī)學(xué)鑒定者進(jìn)行死因鑒定困難，外泌體因其良好的雙層囊泡可保護(hù)外泌體內(nèi)核酸、脂質(zhì)及蛋白質(zhì)，可有效應(yīng)對(duì)尸體自溶和外界環(huán)境因素帶來的干擾，目前外泌體在過敏性猝死研究尚未開展，未來法醫(yī)學(xué)家可針對(duì)過敏性猝死外泌體作為新的研究思路進(jìn)行探究。