周子墨 柳達 陳森相 覃森

中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院骨科，遼寧 沈陽 110004

骨髓源性間充質(zhì)干細胞(BMSCs)是一類具有多向分化潛能的干細胞，根據(jù)誘導方式的不同，可以分化為神經(jīng)元、軟骨細胞、成骨細胞等[1-3]。當骨組織發(fā)生損傷后，損傷部位釋放的因子誘導遠處的BMSCs向損傷部位遷移，發(fā)生歸巢效應(yīng)，并定植于損傷部位。同時，BMSCs不斷分化為成骨細胞，并釋放多種細胞因子，促進新的骨組織生成，這一過程也被稱為成骨分化(osteogenesis differentiation)[4]。因此，BMSCs的骨組織修復作用機制可分為3個方面：①多向分化；②旁分泌；③歸巢效應(yīng)。近年來，BMSCs的成骨分化在骨質(zhì)疏松癥、骨折、骨肉瘤等多種疾病中發(fā)揮重要作用，其相關(guān)的多種分子機制也不斷被闡述[5-6]。

隨著對干細胞研究的不斷深入，大量研究已經(jīng)證明干細胞可以沿著特定的組織譜進行自我增殖和分化。此外，從體內(nèi)分離并在體外培養(yǎng)的干細胞在誘導下可以分化為特定的細胞，這為體外器官的構(gòu)建提供了基礎(chǔ)。近年來，3D培養(yǎng)技術(shù)的不斷成熟，使得多種干細胞及腫瘤相關(guān)類器官模型被構(gòu)建，這些模型具有構(gòu)建所需時間短、遺傳學穩(wěn)定等特點，可以很好地還原相關(guān)疾病在體內(nèi)的發(fā)生發(fā)展和分子遺傳學特性，為研究疾病發(fā)病及其相關(guān)分子調(diào)控機制提供了很好的基礎(chǔ)[7]。BMSCs作為一類多能分化干細胞，其潛在的體外增殖和分化能力受到關(guān)注。目前，對BMSCs的成骨分化研究主要集中在2D細胞培養(yǎng)，而這種簡單的體外培養(yǎng)方式無法構(gòu)建骨組織及機體內(nèi)環(huán)境，極大限制了BMSCs的成骨分化研究。3D培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展使得BMSCs成骨分化相關(guān)類器官的構(gòu)建成為可能，這一技術(shù)有望在骨質(zhì)疏松癥等骨代謝性疾病的發(fā)病機制研究、分子治療、藥物研發(fā)及組織工程等領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。

1 類器官定義及發(fā)展

1.1 類器官的定義

早在1975年，Rheinwald等[8]通過角化細胞和3T3成纖維細胞的共培養(yǎng)，構(gòu)建了類似于表皮的分層鱗狀上皮細胞集落。近年來，隨著3D培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，類器官也被進一步描述為模仿哺乳動物原始組織的體內(nèi)結(jié)構(gòu)和多譜系分化干細胞形成的具有一定組織形態(tài)的三維結(jié)構(gòu)[9]。3D培養(yǎng)技術(shù)模擬了干細胞生長所需的細胞外基質(zhì)環(huán)境并提供了懸浮細胞培養(yǎng)條件，這一人工構(gòu)建的微環(huán)境與體內(nèi)微環(huán)境相似，包含多種與干細胞生物學行為相關(guān)的細胞及細胞因子等。干細胞在這一環(huán)境中受到微環(huán)境的調(diào)控，模擬在機體內(nèi)發(fā)生的一系列生物學過程，并逐漸被誘導分化形成特定的、能夠自組織的三維結(jié)構(gòu)，這一特定組織結(jié)構(gòu)也被稱為干細胞龕(stem cell niche)，即類器官。類器官的構(gòu)建及相關(guān)實驗方式兼?zhèn)淞似胀毎囵B(yǎng)、干細胞異體輸注培養(yǎng)和自體組織切片的優(yōu)點，為干細胞及腫瘤研究提供了更加靈活的手段。

1.2 類器官的發(fā)展

類器官在多種干細胞及腫瘤研究中發(fā)揮了重要的作用。Sato等[10]第一次通過在體外構(gòu)建類器官培養(yǎng)環(huán)境，使得腸成體干細胞(ASCs)在類器官中穩(wěn)定并自組織的形成隱絨毛類器官。在此基礎(chǔ)上，研究人員制備出了多種組織的類器官，包括腸道、腎臟、肝臟、胃、肺等[7,11-14]。這些類器官均由不同類型的干細胞分化而來，如2013年，Takebe等[15]誘導多能干細胞(iPSCs)分化為肝臟類器官并移植入腸系膜，極大緩解了肝衰竭的進程。此外，胚胎干細胞(ESCs)可以誘導產(chǎn)生肺和腦等類器官[9,16]。干細胞的多能分化作用還體現(xiàn)在同種多能干細胞可分化為不同的類器官，如ASCs不僅可以分化為腸道類器官，還可以分化為肝臟、胰腺、肺等[17-19]。這也提示類器官的構(gòu)建對3D培養(yǎng)環(huán)境的要求較高，適合的培養(yǎng)條件及環(huán)境對干細胞誘導極其重要。2005年，Braccini等[20]第一次描述了一種針對BMSCs的3D培養(yǎng)系統(tǒng)，可直接在3D環(huán)境中種植和分化BMSCs，其成骨效果較2D培養(yǎng)的BMSCs更好。

目前，除了構(gòu)建不同組織的類器官，與類器官培養(yǎng)相關(guān)的技術(shù)也在不斷發(fā)展。針對不同細胞類型的不同組織類器官，培養(yǎng)方案均有較大差異。針對乳腺癌的類器官培養(yǎng)，研究者將組織樣本進行機械破壞和酶消化結(jié)合方法，制定了基礎(chǔ)的培養(yǎng)方案。在此基礎(chǔ)上，實驗方案不斷被優(yōu)化，多種生物制劑被應(yīng)用于乳腺癌的類器官的構(gòu)建，大大提高了培養(yǎng)的成功率[21]。Wu等[22]發(fā)現(xiàn)在3D培養(yǎng)系統(tǒng)中提供合適的軟骨微環(huán)境，如軟骨細胞外基質(zhì)后可以促進BMSCs的軟骨分化。此外，對于3D培養(yǎng)使用的材料，也在不斷發(fā)展。一種基于骨骼肌袋的生物材料培養(yǎng)系統(tǒng)被開發(fā)，用來支持干細胞的長期培養(yǎng)，并構(gòu)成了一種新的類器官模型，為骨組織移植提供了可能[23]。

2 BMSCs成骨分化相關(guān)類器官的培養(yǎng)

類器官的3D培養(yǎng)環(huán)境對于其模型構(gòu)建至關(guān)重要。類器官的自組織指干細胞在3D培養(yǎng)環(huán)境中從最初一個缺乏有序的結(jié)構(gòu)，在系統(tǒng)性自主調(diào)控機制的指導下，進行空間重新排列的過程。自組織過程可分為兩個階段，一個是包括反應(yīng)擴散機制、調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的雙穩(wěn)定性機制和不對稱細胞分裂機制構(gòu)成的自我模式(self-patterning)，主要由局部細胞間通訊介導；另一個是包括組織內(nèi)不同類型細胞的聚類和更高層次的結(jié)構(gòu)重組導致的類器官形態(tài)重排。自組織中，細胞的粘附作用、細胞運動、細胞形態(tài)和細胞間信號串擾(crosstalk)均發(fā)揮了重要的作用[24]。這一過程的影響因素可以概括為：①培養(yǎng)環(huán)境的理化特性；②系統(tǒng)內(nèi)源和外源信號。

2.1 培養(yǎng)環(huán)境的理化特性

類器官的3D培養(yǎng)所需要的容器必須能支持細胞粘附和生長，一種從Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤中提純獲得的基質(zhì)膠(Matrigel)被作為細胞外基質(zhì)廣泛應(yīng)用于3D培養(yǎng)中[9]。對于BMSCs的分化培養(yǎng)，有研究表明，相比于單純涂有細胞外基質(zhì)的藻酸鹽微珠培養(yǎng)系統(tǒng)，添加有硫酸軟骨素 (CS) 和 Col 2的培養(yǎng)體系可以更好的促進BMSCs的軟骨分化[22]。

水凝膠作為一種新的生物材料，也被認為是Matrigel的替代品，其可以控制培養(yǎng)環(huán)境的理化特性及力學特性，并在BMSCs的成骨分化和類骨組織形成中發(fā)揮作用[25-27]。但水凝膠對于BMSCs的內(nèi)器官形成作用依然有爭議。傳統(tǒng)基質(zhì)中含有IGF、TGF/組織纖溶酶原激活物等復雜的生長因子，而水凝膠中則缺乏這些天然含有的生長因子[14]。Jaramillo等[28]將BMSCs加入合成水凝膠基質(zhì) (PEGDA)并植入成年雄性Lewis大鼠的回腸系膜，以期形成類牙齒器官，但由于缺乏基質(zhì)相互作用，BMSCs無法和PEGDA相容。

此外，還有多種生物3D支架也被廣泛開發(fā)用于BMSCs的體外3D培養(yǎng)[29-30]。Lastra等[31]開發(fā)了一種全新的由富馬酸-醋酸乙烯酯共聚物和殼聚糖制備的微球環(huán)境，不僅可以促進BMSCs增殖，還可以促進其重新排列成簇生長，表明出良好的類骨組織生長。Abbasi等[32]構(gòu)建了一種機械調(diào)節(jié)劑聚合物微粒MP，這種微粒使得人間充質(zhì)干細胞(human mesenchymal stem cell，hMSCs)球體不斷增殖和成骨分化，成為一類成骨分化類器官建模的新工具。

2.2 系統(tǒng)內(nèi)源和外源信號

類器官的自組織需要多種細胞因子及信號的刺激。首先是由干細胞自分泌和旁分泌產(chǎn)生的內(nèi)源信號，如外泌體、生長因子等。當干細胞聚集生長時，這些干細胞分泌出多種因子，激活并刺激更多干細胞的分化過程。一些類器官的產(chǎn)生幾乎完全依賴于內(nèi)源信號，例如，小鼠PSCs培養(yǎng)而來的小鼠視杯類器官需要在低生長因子水平的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)，而PSCs自己產(chǎn)生的內(nèi)源信號對視杯類器官的產(chǎn)生起到?jīng)Q定作用[33]。對于BMSCs的研究中我們發(fā)現(xiàn)，3D培養(yǎng)時，BMSCs分泌的外泌體可以激活周圍BMSCs的HMGB1/AKT通路，從而對BMSCs的增殖、遷移影響較2D培養(yǎng)更強[34]。

其次，類器官自組織所需的外源信號包括外界給予的多種細胞因子和生長因子。在3D培養(yǎng)所提供的血清中，已含有一定量的生長因子，此外，BMSCs成骨分化所需要的抗壞血酸、β-磷酸甘油及一定劑量地塞米松等也會被添加入培養(yǎng)基中。Petrigliano等[35]在涂有成纖維細胞生長因子 (bFGF)的3D支架上培養(yǎng)BMSCs。實驗表明，額外提供bFGF可以很好的促進BMSCs的生長分化。此外，一些研究通過在基質(zhì)膠中加入Col I等促成骨分化因子，以進一步促進成骨分化的發(fā)生[36]。

在最初的增殖與分化中，外源信號發(fā)揮著重要作用，通過外源信號的刺激，內(nèi)源性信號被激活，并發(fā)揮調(diào)控作用。因此，內(nèi)源信號與外源信號在類器官的構(gòu)建中均發(fā)揮了不可或缺的作用，這也為BMSCs成骨分化類器官提供了更多的研究方向，如改變外源信號的水平或者使用藥物干擾內(nèi)源信號的表達對類器官模型的影響及其相關(guān)分子機制[37]。

3 BMSCs成骨分化相關(guān)類器官的應(yīng)用

目前，針對BMSCs的類器官構(gòu)建依然較少。BMSCs的3D培養(yǎng)主要應(yīng)用于組織工程和植入材料的開發(fā)，如優(yōu)化的絲素蛋白明膠支架、透明質(zhì)酸水凝膠支架等在BMSCs的軟骨分化中可以起到促進作用，為軟骨原位修復提供更多可能[26,38]。目前一些研究已經(jīng)證實這些無機或有機材料制備的3D支架可以通過自身的特性，如接近機體骨骼的礦物質(zhì)百分比、組成、結(jié)構(gòu)以及力學性能，提供適合BMSCs生長的理化特性，以促進BMSCs的增殖、分化，這也為類器官的構(gòu)建提供了很好的基礎(chǔ)[39]。

臨床上，已有研究通過3D培養(yǎng)技術(shù)構(gòu)建牙齒及顱面骨的類器官，使得移植物在受損的顱面組織上移植后，能促進牙槽骨再生和頜骨重建，這種類器官的移植最適合由創(chuàng)傷、疾病或出生缺陷引起的口腔骨、皮膚和牙齦嚴重缺損，并在臨床治療中得到了較好的預后[40]。

而在其他如藥物篩選和骨質(zhì)疏松癥疾病的基礎(chǔ)研究等領(lǐng)域，3D培養(yǎng)更體現(xiàn)出優(yōu)于2D細胞培養(yǎng)的特點。有研究通過3D培養(yǎng)構(gòu)建牙周韌帶間充質(zhì)干細胞 (PDLSCs)團塊，討論脂多糖(LPS)對間充質(zhì)干細胞增殖和成骨潛能的影響研究。結(jié)果表明，相較于2D平面培養(yǎng)的3D PDLSCs，3D培養(yǎng)的PDLSCs團塊更能抵抗LPS的作用，降低炎癥反應(yīng)的發(fā)生[41]。此外，與2D塑料板上培養(yǎng)的MSCs相比，3D浮動培養(yǎng)的MSCs團塊中環(huán)氧合酶2 (COX2)介導的PGE2產(chǎn)生顯著增加，并且顯著抑制了細胞的凋亡[42]。目前，針對MSCs的3D培養(yǎng)構(gòu)建肝臟類器官模型并進行藥物篩選及移植的研究已被廣泛開展，但對于BMSCs成骨分化類器官的研究，依然十分有限。

4 總結(jié)與展望

3D細胞培養(yǎng)技術(shù)作為一種新的細胞培養(yǎng)手段，由于可以提供細胞生長所需的細胞外基質(zhì)環(huán)境及懸浮細胞培養(yǎng)條件，使得其能更接近于人體的微環(huán)境。而干細胞的多向分化能力、旁分泌和歸巢效應(yīng)，則為3D培養(yǎng)及類器官模型的建立成為可能。因此，類器官模型的建立在生物醫(yī)學領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。盡管BMSCs成骨分化的類器官模型已被構(gòu)建并不斷優(yōu)化，且被應(yīng)用于臨床，但其依然存在許多限制。首先是與傳統(tǒng)BMSCs培養(yǎng)相比，3D細胞培養(yǎng)過程較復雜，所需耗材昂貴，且技術(shù)不成熟等因素導致類器官構(gòu)建成功率較低。此外，人體BMSCs的獲得和擴大培養(yǎng)較困難，其涉及到的倫理問題也使得這一技術(shù)無法在大規(guī)模的藥物篩查及基礎(chǔ)實驗中被利用。解決以上問題，還需要更深入的研究。

綜上所述，BMSCs成骨分化的3D細胞培養(yǎng)及類器官的構(gòu)建可以應(yīng)用于骨質(zhì)疏松癥等多種疾病的藥物篩查、基礎(chǔ)研究及臨床治療相關(guān)的組織工程中。其特有的優(yōu)勢可以幫助研究人員更深層次的探討B(tài)MSCs成骨分化相關(guān)機制與藥物治療，使骨代謝疾病的個體化治療成為可能。