褚云峰 于紅燕 楊琪 彭艷斌 陳仲 劉明 于斐,3*

1. 北京大學(xué)深圳醫(yī)院，廣東 深圳 518036 2. 濱州市濱城區(qū)市立醫(yī)院，山東 濱州 256600 3. 骨科生物材料國家地方聯(lián)合工程研究中心，廣東 深圳 518036

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)又稱退行性關(guān)節(jié)炎，是一種以關(guān)節(jié)軟骨退變及骨質(zhì)增生為特征的常見慢性關(guān)節(jié)疾病。原發(fā)性O(shè)A可能由于軟骨營養(yǎng)或代謝異常、應(yīng)力不平衡、關(guān)節(jié)生化改變等因素造成，繼發(fā)性O(shè)A可能由于關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)異常、關(guān)節(jié)不穩(wěn)定、損傷或機(jī)械性因素等造成。隨著我國人口老齡化程度的不斷加劇，OA患者的基數(shù)也越來越多，嚴(yán)重者可以造成殘疾，給患者及衛(wèi)生醫(yī)療帶來沉重負(fù)擔(dān)。近年研究顯示，中藥成分如白藜蘆醇[1]、淫羊藿[2]、小檗堿[3]等，基因如沉默信息調(diào)節(jié)因子1(SIRT1)[4]、無翅型MMTV整合位點家族成員5A(Wnt5a)[5]、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白2(SREBP2)[6]等均可對OA的進(jìn)程產(chǎn)生影響，也因此廣受關(guān)注。

白藜蘆醇屬天然抗氧化物質(zhì)，在虎杖、花生、葡萄等植物中含量豐富。其存在順式和反式兩種同分異構(gòu)體，自然界中主要以后者為主。國內(nèi)外研究證實，白藜蘆醇在骨科[7]、心血管[8]、腫瘤[9]等疾病中起重要作用，廣泛應(yīng)用于研究，并作為保健品被人群重視。此外，白藜蘆醇能夠通過核因子-κB(NF-κB)[10]、Toll樣受體4(TLR4)[11]、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)[12]等通路作用于關(guān)節(jié)軟骨并參與到OA的進(jìn)展中。本文擬對白藜蘆醇通過影響軟骨衰老、軟骨基質(zhì)代謝、軟骨損傷等作用參與OA的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程及NF-κB、TLR4、ERK等通路在其中的調(diào)控機(jī)制研究作一綜述，為相關(guān)研究者提供參考。

1 白藜蘆醇性質(zhì)、發(fā)現(xiàn)及作用

白藜蘆醇的化學(xué)式為C14H12O3，其化學(xué)名稱為(E)-3,4’,5-三羥基二苯乙烯，相對分子量228.25。最初于1924年發(fā)現(xiàn)，并于1940年由日本科學(xué)家從毛葉藜蘆的根莖中獲得，在植物遇到不利影響時合成分泌增多，被稱為植物抗毒素。白藜蘆醇難溶于水，易溶于有機(jī)溶劑，熔點在253 ℃～ 255 ℃。365 nm紫外光照射可顯示熒光，與三氯化鐵-鐵氰化鉀及氨水等堿性溶液可起顯色反應(yīng)，從而用于白藜蘆醇的鑒定。白藜蘆醇藥理作用多樣，能夠抗炎、抗氧化、抗菌及抗腫瘤等[13]。近年研究顯示，白藜蘆醇在骨科疾病如OA[14]、骨質(zhì)疏松癥[15]、神經(jīng)損傷修復(fù)[16]中起著重要作用。

2 白藜蘆醇在OA中對軟骨功能的影響

關(guān)節(jié)軟骨為透明軟骨或纖維軟骨，軟骨組織由外到內(nèi)依次為表層、移行層、輻射層和鈣化層。關(guān)節(jié)軟骨由軟骨細(xì)胞和軟骨基質(zhì)構(gòu)成，軟骨細(xì)胞是其中唯一的細(xì)胞，基質(zhì)主要為II型膠原和蛋白多糖。軟骨維持正常結(jié)構(gòu)對機(jī)體非常重要，當(dāng)關(guān)節(jié)軟骨出現(xiàn)退變，或者關(guān)節(jié)周圍出現(xiàn)骨贅，可導(dǎo)致OA。

2.1 白藜蘆醇對軟骨衰老的影響

白藜蘆醇是SIRT1基因的特異性激活劑，與衰老關(guān)系密切，白藜蘆醇可通過激活SIRT1基因影響關(guān)節(jié)軟骨的衰老進(jìn)程。Mehta等[17]建立了老年人體外非酶糖基化誘導(dǎo)OA軟骨移植模型，發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇在該模型中能有效抗衰老，可減緩年齡相關(guān)及糖尿病誘導(dǎo)的OA，并可用該模型評估年齡誘導(dǎo)的軟骨生物力學(xué)變化。Hecht等[18]應(yīng)用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激驅(qū)動的I-ERS原發(fā)小鼠OA模型證實，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可誘發(fā)關(guān)節(jié)軟骨退變，出現(xiàn)衰老、軟骨細(xì)胞死亡、自噬阻滯和步態(tài)功能障礙等現(xiàn)象，白藜蘆醇可通過降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白、TUNEL陽性軟骨細(xì)胞數(shù)量和衰老標(biāo)記物p16 INK4a等的表達(dá)減緩該現(xiàn)象。Qin等[19]則通過研究衰老和OA中常見的細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)機(jī)制-自噬現(xiàn)象證實，關(guān)節(jié)內(nèi)注射白藜蘆醇可以促進(jìn)內(nèi)側(cè)半月板失穩(wěn)誘導(dǎo)的OA模型中軟骨自噬，這與AMP依賴的蛋白激酶/雷帕霉素靶蛋白(AMPK/mTOR)信號通路密切相關(guān)。由此可知，白藜蘆醇可對非酶糖基化、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、自噬等現(xiàn)象產(chǎn)生影響進(jìn)而調(diào)控調(diào)控軟骨組織及軟骨細(xì)胞的衰老。

2.2 白藜蘆醇對軟骨基質(zhì)代謝的影響

軟骨遭到破壞時，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)、解聚蛋白樣金屬蛋白酶(ADAMTS)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)等酶類升高。Yi等[20]培養(yǎng)OA患者的軟骨細(xì)胞，經(jīng)白藜蘆醇處理后進(jìn)行高通量測序等檢測發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇能抑制白介素1β(IL-1β)誘導(dǎo)的經(jīng)NF-κB通路作用的炎癥，降低MMP1/3/13和iNOS的表達(dá)，并增加II型膠原和聚集蛋白聚糖(Aggrecan)的表達(dá)；Kang等[21]用兔軟骨細(xì)胞檢測也發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇除了能夠降低細(xì)胞中IL-1β刺激后MMP1/3/13外，同時降低了ADAMTS4/5表達(dá)，這一過程與白藜蘆醇直接作用于細(xì)胞中的NF-κB通路相關(guān)。我們團(tuán)隊也發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇作用于脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的小鼠膝原代軟骨細(xì)胞時，能夠降低SREBP2、MMP13的表達(dá)，起保護(hù)軟骨細(xì)胞的作用[22]。因此，白藜蘆醇可以抑制軟骨組織及軟骨細(xì)胞中造成其基質(zhì)降解的酶類的表達(dá)，并促進(jìn)軟骨特異性成分的分泌，而起到保護(hù)軟骨的作用。

2.3 白藜蘆醇對軟骨損傷的影響

OA等骨科疾病中，軟骨損傷已達(dá)到嚴(yán)重程度，加強(qiáng)對軟骨損傷的研究也有重要意義。筆者團(tuán)隊的研究表明，采用微流控芯片篩選出攜載114.28 μmol/L白藜蘆醇的聚乳酸(PLA)/明膠材料比攜載其他濃度的白藜蘆醇更能夠促進(jìn)大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨缺損的修復(fù)，而且攜載100 μmol/L白藜蘆醇的PLA/明膠材料可能是通過PI3K/AKT 通路的作用促進(jìn)其修復(fù)的[23-24]。Choi等[25]在體外使用白藜蘆醇處理間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)，增強(qiáng)了其增殖能力并抑制其衰老，并且提高了其軟骨生成物標(biāo)記的表達(dá)，該類細(xì)胞在體內(nèi)能夠促進(jìn)兔骨軟骨缺損模型中透明軟骨的再生。Bonifacio等[26]構(gòu)建了結(jié)冷膠-蜂蜜-硅藻復(fù)合物這種緩釋白藜蘆醇的藥物載體系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)該載體有利于白藜蘆醇的控釋，阻止細(xì)菌增殖和氧化應(yīng)激損傷，并支持MSCs定植及朝向軟骨細(xì)胞分化。胡雄彬等[27]制備了白藜蘆醇三甲醚外用微乳凝膠，在木瓜蛋白酶注射建立的軟骨損傷新西蘭大白兔膝關(guān)節(jié)OA模型上局部外用，發(fā)現(xiàn)其能降低兔血清中IL-1β、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)表達(dá)而改善關(guān)節(jié)缺損及潰瘍，促進(jìn)了膝OA軟骨損傷的恢復(fù)。Chen等[28]在急性足腫脹模型基礎(chǔ)上用膠原誘導(dǎo)建立大鼠關(guān)節(jié)炎模型，發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇、川芎嗪和姜黃素聯(lián)合用藥能夠減輕大鼠足腫脹及踝關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)、軟骨、纖維組織的損傷，并且對胃無傷害，從而優(yōu)于單一非甾體抗炎藥的療效。所以，白藜蘆醇結(jié)合在各種材料如聚乳酸、明膠、結(jié)冷膠、殼聚糖中形成新型復(fù)合材料后，或者與川芎嗪、姜黃素等藥物聯(lián)用，可以通過影響B(tài)MSCs的增殖分化、抑制炎癥等途徑參與軟骨損傷修復(fù)的進(jìn)程。

3 白藜蘆醇對OA的作用

OA是一種多因素引起的慢性退行性疾病，多條通路參與其中，比如NF-κB[10]、TLR4[11]、ERK[12]等，白藜蘆醇可以通過激活或抑制通路中相關(guān)因子的表達(dá)，進(jìn)而參與到OA中。

3.1 白藜蘆醇通過NF-κB信號通路對OA的影響

炎癥在OA中起著重要作用，而NF-κB通路是機(jī)體炎癥調(diào)節(jié)的重要通路之一。Zhang等[29]發(fā)現(xiàn)，OA模型中肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1(MALAT1)、NF-κB1、IL-6、MMP-13和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)表達(dá)量升高，miR-9的表達(dá)量降低，白藜蘆醇作用后能夠逆轉(zhuǎn)這些因子的表達(dá)，認(rèn)為白藜蘆醇可以通過MALAT1/miR-9/NF-κB信號通路減輕OA發(fā)生發(fā)展。Li等[30]證實，在顳下頜關(guān)節(jié)OA中，白藜蘆醇連續(xù)注射能下調(diào)環(huán)氧合酶2(COX-2)/NF-κB/MMP的表達(dá)，增加軟骨標(biāo)志物，逆轉(zhuǎn)下頜髁狀突軟骨細(xì)胞的慢性炎癥，說明白藜蘆醇可通過COX-2/NF-κB途徑抗軟骨細(xì)胞凋亡及抗氧化。Jin等[31]用小鼠軟骨細(xì)胞系A(chǔ)TDC5進(jìn)行了實驗，發(fā)現(xiàn)LPS能通過激活NF-κB和p38 MAPK通路抑制該細(xì)胞的活力并誘導(dǎo)凋亡，增加IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)，白藜蘆醇預(yù)處理則降低了LPS的促凋亡及促炎癥作用，miR-146b沉默則影響了白藜蘆醇的作用，從而證實上調(diào)miR-146b導(dǎo)致的NF-κB和p38 MAPK通路失活是白藜蘆醇起作用的途徑。Wei等[32]認(rèn)為，在大鼠OA模型中，白藜蘆醇能夠抑制TNF-α、IL-1β/6/18、Caspase-3/9、iNOS、NF-κB等的表達(dá)，并刺激血紅素加氧酶1(HO-1)和核因子E2相關(guān)因子2(Nrf-2)的表達(dá)，表明白藜蘆醇通過NF-κB和HO-1/Nrf-2通路改善OA大鼠模型中的炎癥損傷并延緩OA進(jìn)展。筆者團(tuán)隊也證實，經(jīng)100 μmol/L白藜蘆醇預(yù)處理的小鼠軟骨細(xì)胞再受到LPS刺激時，NF-κB的核轉(zhuǎn)位受抑制，并通過該通路降低TNF-α、IL-1β的表達(dá)，降低軟骨細(xì)胞炎癥并延緩其退變[33]。因此，白藜蘆醇能夠通過NF-κB信號通路影響到OA的炎癥進(jìn)程，它既能夠降低炎癥刺激時NF-κB信號通路的激活，又能夠通過該通路降低炎癥因子的表達(dá)，形成良性循環(huán)，影響OA病程。

3.2 白藜蘆醇通過TLR4信號通路對OA的影響

TLR4是參與非特異性免疫的重要因子，是單個的跨膜非催化性蛋白質(zhì)。Xu等[34]研究了白藜蘆醇減輕肥胖相關(guān)的OA發(fā)生的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇能降低高脂飲食小鼠OA的發(fā)生，其中TLR4和PI3K/AKT通路均被調(diào)控，初步證實白藜蘆醇可能通過激活PI3K/AKT通路進(jìn)而抑制TLR4發(fā)揮抗OA作用。Jiang等[35]也研究了肥胖與OA的關(guān)系，通過灌胃給予白藜蘆醇，改善了高脂喂養(yǎng)小鼠的OA癥狀，血清中IL-1β和瘦素水平降低，抑制了軟骨中TLR4和腫瘤壞死因子相關(guān)蛋白6(TRAF6)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可通過降低系統(tǒng)炎癥水平及抑制軟骨中的TLR4通路來減輕OA病理。Ma等[11]使用白藜蘆醇二聚體Amurensin H治療碘乙酸單鈉誘導(dǎo)的小鼠模型發(fā)現(xiàn)，治療2周能顯著緩解軟骨退變及炎癥，并在細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)該物質(zhì)以時間和劑量依賴的方式抑制TLR4/ 脾酪氨酸激酶(Syk)通路和下游p65磷酸化和易位，闡述了Amurensin H通過TLR4/Syk/NF-κB途徑保護(hù)軟骨的作用。也有研究者使用50 μmol/L的白藜蘆醇作用后進(jìn)而觀察TLR4 siRNA、PI3K抑制劑LY294002或轉(zhuǎn)錄因子叉頭框蛋白O1(FoxO1)siRNA處理過的IL-1β誘導(dǎo)的骨肉瘤SW1353細(xì)胞，認(rèn)為白藜蘆醇作用下的SW1353細(xì)胞中存在TLR4/Akt/FoxO1炎癥自限機(jī)制，進(jìn)而發(fā)揮抗OA作用[36]。Gu等[37]認(rèn)為白藜蘆醇可以作為一種營養(yǎng)補(bǔ)充劑來對抗OA，他們使用IL-1β刺激的人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可以降低該細(xì)胞活力，并導(dǎo)致TLR4以及與MMP13和IL-6合成相關(guān)的TLR4/髓樣分化因子88(MyD88)依賴和非依賴信號通路的下游靶點顯著上調(diào)。所以，肥胖導(dǎo)致關(guān)節(jié)負(fù)重增加等原因引起的OA可在白藜蘆醇的介導(dǎo)下通過調(diào)控TLR4信號通路得到緩解，OA本身存在的炎癥刺激及其影響下分泌的炎癥因子也可以通過該通路的作用得到緩解。

3.3 白藜蘆醇通過ERK信號通路對OA的影響

MAPK因子是能被細(xì)胞因子、神經(jīng)遞質(zhì)、激素等因子激活的蛋白激酶，可在所有真核細(xì)胞中表達(dá)，該通路中研究最廣的是ERK1/ERK2 (p42/p44)激酶。Shakibaei等[38]認(rèn)為，白藜蘆醇和姜黃素聯(lián)用，能抑制IL-1β和MAPK途徑特異性抑制劑U0126誘導(dǎo)的人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡以及導(dǎo)致β1整合素和ERK1/2的下調(diào)，進(jìn)而說明兩種天然化合物能激活MEK/ERK信號通路維持軟骨細(xì)胞分化和存活。Abed等[39]則對OA中的軟骨下骨進(jìn)行了研究，他們用全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)OA患者的脛骨平臺軟骨下骨板或尸檢時正常人的脛骨平臺制備原代成骨細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇能上調(diào)SIRT1表達(dá)及其活性，降低瘦素表達(dá)，增加ERK1/2磷酸化及OA成骨細(xì)胞礦化，并影響Wnt/β-catenin通路中Wnt3a的反應(yīng)，說明白藜蘆醇通過ERK1/2和Wnt/β-catenin通路對OA成骨細(xì)胞表型和活性起到有益作用。He等[12]研究SIRT1基因?qū)A軟骨細(xì)胞凋亡和細(xì)胞外基質(zhì)降解時，使用白藜蘆醇刺激細(xì)胞，降低了細(xì)胞中MMP1/13、ERK、c-Jun N-末端激酶及p38激酶表達(dá)，白藜蘆醇加用SIRT1 siRNA則逆轉(zhuǎn)這些表達(dá)，發(fā)現(xiàn)了SIRT1基因抑制OA軟骨細(xì)胞凋亡及細(xì)胞外基質(zhì)降解的機(jī)制。Liu等[40]使用白藜蘆醇處理晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)刺激的豬軟骨細(xì)胞和軟骨外植體，發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇抑制了AGEs刺激后細(xì)胞中炎癥因子iNOS、環(huán)氧合酶-2(COX-2)、前列腺素E2(PGE2)等的表達(dá)，并認(rèn)為與KK-IκBα-NF-κB和JNK/ERK-AP-1通路相關(guān)。由此可知，ERK信號通路在白藜蘆醇緩解OA進(jìn)程中也有一定作用，而這個過程與軟骨細(xì)胞的增殖、分化、表型維持，調(diào)控軟骨下骨的礦化，降低組織中炎癥因子的表達(dá)以及抑制軟骨基質(zhì)的分解等密切相關(guān)。

4 小結(jié)與展望

OA與衰老、肥胖、創(chuàng)傷、遺傳等多因素相關(guān)，治療不及時可導(dǎo)致患者肢體功能障礙，甚至殘疾。該病在50歲以上人群中好發(fā)，90 %的80歲以上老年人有OA的影像學(xué)表現(xiàn)。隨著我國人口老齡化程度的不斷加劇，OA患者會越來越多，其造成的醫(yī)療負(fù)擔(dān)也會不斷加劇，因此加強(qiáng)對OA的治療迫在眉睫。白藜蘆醇是一種容易獲得的非黃酮類多酚有機(jī)天然化合物，其抗炎、抗氧化等作用可以通過影響軟骨衰老、軟骨基質(zhì)代謝、軟骨損傷等作用參與OA的進(jìn)程，這一過程可能與NF-κB、TLR4、ERK等信號通路相關(guān)。但在以往的研究中，學(xué)者更多的是關(guān)注白藜蘆醇單藥對軟骨組織某功能的單一影響、從而解釋白藜蘆醇對軟骨破壞的影響進(jìn)而延伸到OA的進(jìn)程中，缺乏從軟骨到軟骨下骨整個層面的宏觀解釋以及軟骨衰老、基質(zhì)代謝和損傷等多功能層面的闡述，并且多數(shù)研究只通過單一的經(jīng)典信號通路闡述白藜蘆醇在OA發(fā)病機(jī)制中的作用，造成了片面性。筆者認(rèn)為，從整體角度及多功能層面出發(fā)，將白藜蘆醇負(fù)載于生物活性材料中，或者在添加白藜蘆醇的同時聯(lián)合其他藥物或基因?qū)用娴母淖?、并結(jié)合單細(xì)胞測序或高通量測序等新興技術(shù)研究白藜蘆醇對OA的影響及機(jī)制，或許是一個可行的新出發(fā)點。鑒于此，加強(qiáng)白藜蘆醇對OA治療的研究，可能有利于為臨床治療OA提供潛在藥物，最終造福于患者。