胰腺導(dǎo)管腺癌微環(huán)境中星狀細(xì)胞對腫瘤新生血管影響的研究進展

劉嬌，趙建國

（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué) 研究生院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 肝膽外科，內(nèi)蒙古 呼和浩特010050）

胰腺導(dǎo)管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）是一種手術(shù)切除率低、預(yù)后極差的消化道惡性腫瘤，發(fā)病率與病死率幾乎持平，對其發(fā)病的具體原因及機制尚不十分清楚[1-5]，約5%～10%的PDAC患者具有遺傳背景[6-7]。目前隨著科學(xué)技術(shù)的進步和研究的持續(xù)深入開展，人們認(rèn)識到過去僅僅以腫瘤細(xì)胞為中心的觀念遠不能全面認(rèn)識腫瘤，并且逐漸認(rèn)識到腫瘤微環(huán)境在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中的作用日益凸顯[8]。眾所周知[9-10]，在PDAC中，胰腺星狀細(xì)胞（pancreatic stellate cells，PSCs）分化為癌相關(guān)成纖維細(xì)胞（cancer associated fibroblasts，CAFs）的不同亞型以促進和抑制腫瘤的進展。最近，Murray等[11]在PSCs促進PDAC發(fā)展機制方面有了新的進展，即蛋白激酶N2（protein kinase N2，PKN2）敲除使PSCs的肌成纖維細(xì)胞表型向炎癥性CAF表型轉(zhuǎn)化，肌成纖維細(xì)胞功能的喪失，限制了PSCs的腫瘤抑制功能，以促進PDAC積極生長。PKN2依賴的、PSCs引導(dǎo)的侵襲轉(zhuǎn)移還有待觀察。PSCs還可以獨立于PKN2狀態(tài)支持PDAC細(xì)胞的生長。另外，還發(fā)現(xiàn)PKN2敲除小鼠的內(nèi)黏蛋白陽性血管密度略有降低，具體機制有待進一步研究。

胰腺腫瘤微環(huán)境是由間質(zhì)細(xì)胞及細(xì)胞外成分共同組成，間質(zhì)細(xì)胞主要包括：活化的PSCs、內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等[12]。細(xì)胞外成分主要包括：細(xì)胞外間質(zhì)（extracellular matric，ECM）、基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP-2）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP-9）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）及血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等。眾多研究[13-15]結(jié)果表明，胰腺腫瘤微環(huán)境中PSCs與PDAC的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，胰腺癌細(xì)胞（pancreatic cancer cells，PCCs）能夠促進PSCs的活化、分泌、侵襲和轉(zhuǎn)移，相反PSCs又能夠促進PCCs增值、侵襲、轉(zhuǎn)移。PSCs主要存在于胰腺腺泡細(xì)胞周圍和小葉間，可以表現(xiàn)為兩種狀態(tài)，正常胰腺組織中表現(xiàn)為靜止態(tài)，在氧化應(yīng)激、腫瘤環(huán)境和缺氧等的情況下，靜止態(tài)PSCs可轉(zhuǎn)化為激活態(tài)的PSCs[16]。在腫瘤微環(huán)境中，PCCs分泌產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，通過不同信號通路來促進靜息態(tài)PSCs產(chǎn)生α-SMA和I型前膠原C肽，使PSCs活化為激活態(tài)PSCs[17]，而激活態(tài)PSCs可以迅速增殖并主動遷徙，同時分泌多種信號分子，例如結(jié)締組織生長因子、TGF-β、乳糖凝集素1（galectin-1）等，這些信號分子可以反作用于PCCs，促進PCCs生長、增殖和遷移。蔡茗等[18]通過對癌癥相關(guān)胰腺星狀細(xì)胞（CaPSCs）和正常胰腺相關(guān)胰腺星狀細(xì)胞（NaPSCs）與胰腺癌PANC-1細(xì)胞分別進行共培養(yǎng)，結(jié)果顯示CaPSCs組促進PANC-1細(xì)胞增殖的能力明顯強于NaPSCs組，這更進一步證實了PSCs促進胰腺腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。PDAC生長和發(fā)展的最重要因素是它們通過新血管生成來獲取營養(yǎng)和氧氣，這種新血管生成也被認(rèn)為是導(dǎo)致胰腺腫瘤細(xì)胞早期血行擴散和轉(zhuǎn)移的原因。

在PSCs促進胰腺腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程中，在胰腺腫瘤血管異質(zhì)性方面，di Maggio等[19]發(fā)現(xiàn)，在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞-胰腺癌細(xì)胞（HUVEC-PCC）和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞-胰腺癌細(xì)胞-胰腺星狀細(xì)胞（HUVEC-PCC-PSC）器官型培養(yǎng)中，PCC的存在都抑制了內(nèi)皮細(xì)胞的存活，在HUVEC-PCC-PSC三維共培養(yǎng)中，PCC會對內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生不利影響，但不會導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的增加，在活化的PSCs單獨存在時[20]，HUVEC不僅可以檢測到，而且還可以發(fā)芽并在管腔內(nèi)結(jié)構(gòu)中組裝，另一方面，通過全反式維甲酸誘導(dǎo)PSCs靜止?fàn)顟B(tài)，從而抑制了這種促血管生成活性[19,21-22]。更有趣的是，顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)腫瘤旁間質(zhì)的血管密度明顯低于腫瘤鄰近組織，推測有可能在腫瘤旁的間質(zhì)中，微血管被致密的間質(zhì)壓縮，結(jié)果[23]證明活化的PSCs產(chǎn)生過量的ECM蛋白，主要是膠原蛋白和纖維連接蛋白，導(dǎo)致間質(zhì)致密，具有抗血管生成作用，然而，腫瘤鄰近組織的微血管密度和總血管面積都明顯高于來自健康供體組織中計算出的相應(yīng)值，這表明PDAC在顯微鏡水平上具有可變的血管分布。綜上所述，癌細(xì)胞信號和致密的ECM有助于使瘤旁血管減少，而活化的PSCs促進腫瘤鄰近組織的血管生成。因此，PSCs在胰腺腫瘤血管生成中發(fā)揮了重要作用。

1 活化的PSCs分泌肝細(xì)胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）促進PDAC血管生成

如上文所述，活化的PSCs在PDAC新生血管生成中起重要的作用，但其詳細(xì)的機制尚不明了。早先有研究顯示，HGF不僅被證明可以增加基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的VEGF[24]，而且還可以與VEGF協(xié)同作用，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞管的形成和增殖[25]。PSCs可分泌HGF[26]。為了進一步探索其機制，Patel等[27]將活化的PSC分泌物HGF與人微血管內(nèi)皮細(xì)胞（HMEC-1）一起培養(yǎng)，并通過定量測定HMEC-1管的形成和增殖來評估血管生成。推測可能是活化的PSCs分泌HGF可被尿激酶型纖溶酶原激活物（urokinase type plasminogen activator，uPA）激 活，與其內(nèi)皮細(xì)胞上受體c-MET結(jié)合[28]，c-MET激活下游信號級聯(lián)，從而誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞管的形成和增殖。根據(jù)假設(shè)，HGF、c-MET和uPA抑制劑AMG102、Pha-665752和阿米洛利均導(dǎo)致HMEC-1增殖顯著減少，說明HGF/cMET和uPA通路均在一定程度上介導(dǎo)了內(nèi)皮細(xì)胞增殖。當(dāng)阿米洛利與AMG102聯(lián)合使用時，HMEC-1管的形成被完全抑制。然而，單獨使用阿米洛利并沒有減少封閉的HMEC-1試管數(shù)量，這表明單獨抑制uPA對系統(tǒng)中仍然存在的HGF的形態(tài)發(fā)生沒有什么作用。結(jié)果提示HGF/c-MET和uPa通路在PSCs促PDAC血管生成方面具有重要作用。抑制劑AMG102、Pha-665752和阿米洛利有望應(yīng)用于臨床發(fā)揮其抗腫瘤作用。

2 星狀細(xì)胞過表達galectin-1對PDAC血管生成的影響

隨著胰腺腫瘤研究持續(xù)進展，許多研究人員發(fā)現(xiàn)許多腫瘤是由異常血管生成驅(qū)動的，同樣豐富的血供是維持腫瘤持續(xù)生長的一個重要條件。有研究[29]證實，活化的PSCs可增強Warburg效應(yīng)，引起慢性胰腺炎的惡性發(fā)展。同時也有研究[5]表明，活化的PSCs過表達galectin-1誘導(dǎo)血管生成進而促進腫瘤發(fā)生發(fā)展。PSCs過表達galectin-1可以觸發(fā)血管生成信號傳導(dǎo)程序，刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長以及為新生成的毛細(xì)血管提供物理支持，并介導(dǎo)抗血管生成治療反應(yīng)[30]。galectin-1是半乳糖凝集素的一個成員，最初被稱為可溶性的β-半乳糖苷結(jié)合蛋白家族，現(xiàn)被認(rèn)為是哺乳動物碳水化合物結(jié)合蛋白家族，由多種細(xì)胞類型表達[31]，被認(rèn)為是一種潛在的抗癌靶點。在galectin-1缺失小鼠中發(fā)現(xiàn)，腫瘤血管生成不足，故腫瘤生長小鼠對Anginex抗血管生成治療不再有反應(yīng)[32]。在致瘤性血管生成過程中需要幾個重要的步驟，其中包括蛋白酶如金屬蛋白酶（MMPs）破壞現(xiàn)有的基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)，從而刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞促進新毛細(xì)血管的形成。有研究[33]將galectin-1過表達的PSCs與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein vessel endothelial cells，HUVECs）共培養(yǎng)，結(jié)果顯示HUVECs遷徙能力、成管能力都高于正常組。將galectin-1過表達的PSCs與胰腺癌PANC-1細(xì)胞共培養(yǎng)，結(jié)果提示VEGF表達明顯高于正常組，VEGFR2磷酸化水平在galectin-1過表達中也增強，VEGFR2磷酸化是VEGF誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的一種重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。一項研究[34]表明，神經(jīng)皮素1（neuropilin-1）是血管內(nèi)皮生長因子受體（VEGFR）的跨膜共受體，并確定neuropilin-1是galectin-1的新靶點，實驗將galectin-1與neuropilin-1結(jié)合，VEGFR2的磷酸化得到極大提升，并且還會介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和黏附。VEGF與VEGFR2相結(jié)合后激活下游的信號級聯(lián)反應(yīng)：⑴ PI3K-Akt通路；⑵ p38-MAPK通路；⑶ Raf通路，進而促進新生血管生成并提高血管通透性。最近一項研究[35]表明，使用腫瘤歸巢（iRGD）靶向neuropilin-1，極大提升了腫瘤新生血管的通透性，從而增強了抗癌藥物進入腫瘤內(nèi)的濃度，更好地發(fā)揮抗癌藥物的療效。如果galectin-1通過影響neuropilin-1的功能來影響血管通透性，那么靶向galectin-1就可能會有效提高抗癌藥物的療效。筆者前期通過初步實驗也已經(jīng)證明，添加外源性galectin-1可以增加基底膜基質(zhì)培養(yǎng)物中內(nèi)皮細(xì)胞的毛細(xì)血管樣成管能力。VEGF是目前發(fā)現(xiàn)的最為重要的促血管生成因子之一，一項研究[36]發(fā)現(xiàn)，在肝硬化患者肝臟的切片中片的乏氧區(qū)域與VEGF的高表達區(qū)域基本一致，而免疫熒光顯示VEGF的主要來源正是肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cells，HSCs），研究人員推斷PSCs不僅僅可以通過galectin-1來刺激VEGF的分泌，還可以直接分泌VEGF，經(jīng)過一系列的研究證實了此推斷是正確的。Qian等[37]將二甲雙胍聯(lián)合吉西他濱作用于PDAC模型小鼠，發(fā)現(xiàn)二甲雙胍通過降低音猬因子（sonic hedgehog，SHH）的表達而顯示出抗PSCs的作用，然后引發(fā)一系列的下游效應(yīng)，減少腫瘤新生血管的形成。以上結(jié)果均說明，PSCs在PDAC血管生成過程中起著重要的作用，同時PSCs有望成為未來治療PDAC的新靶點，二甲雙胍可能成為臨床治療PDAC的有效藥物，這需要進一步地去探索及研究。

3 缺氧環(huán)境下HIF-1刺激PSCs的促血管生成能力

腫瘤內(nèi)毛細(xì)血管排列混亂和細(xì)胞快速生長常導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境內(nèi)的氧氣不足，從而形成了缺氧環(huán)境[38]。缺氧環(huán)境不僅存在于PCCs中，也存在于PCCs周圍的PSCs中。胥明[39]前期研究發(fā)現(xiàn)在大量活化的PSCs區(qū)域中，新生血管密度較高，實驗結(jié)果提示PSCs能夠誘發(fā)腫瘤周圍組織產(chǎn)生新生血管。缺氧處理的PSCs條件培養(yǎng)基在體內(nèi)外分泌HIF-1來誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和血管生成[40]。HIF-1是一種介導(dǎo)缺氧適應(yīng)性反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子，由α亞基（HIF-1α）和β亞基（HIF-1β）構(gòu)成異二聚體，HIF-1α受細(xì)胞內(nèi)氧分壓的調(diào)控，HIF-1在細(xì)胞核內(nèi)與相關(guān)基因啟動子區(qū)域的缺氧反應(yīng)元件（HRE）結(jié)合，能特異性上調(diào)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄、表達，調(diào)控細(xì)胞的缺氧適應(yīng)性反應(yīng)。在PDAC中，活化的PSCs可大量分泌VEGF，在VEGF啟動子區(qū)同樣存在HRE位點，其轉(zhuǎn)錄受HIF-1的直接調(diào)控。腫瘤快速生長的過程中缺乏相應(yīng)的血管血液供應(yīng)，所以經(jīng)常經(jīng)歷低氧微環(huán)境，缺氧不僅會誘導(dǎo)PSCs活化促進VEGF表達的增加，還將刺激HIF-1上調(diào)促進VEGF的表達增加，募集內(nèi)皮細(xì)胞，進而促進血管新生。Li等[41]報道HIF-1通過促進化學(xué)趨化因子2（chemical chemokines 2，CCL2）的分泌招募巨噬細(xì)胞，同時缺氧也可誘導(dǎo)VEGF吸引巨噬細(xì)胞，以加速PSCs的激活。另一方面由于病理性新生血管具有結(jié)構(gòu)不成熟和通透性差的特質(zhì)，并不能滿足腫瘤生長需求，無法糾正乏氧狀態(tài)，兩者構(gòu)成正反饋環(huán)，這樣的循環(huán)缺氧會導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境中更高水平的HIF-1α穩(wěn)定，從而促進腫瘤血管生成和放療耐藥性，推動胰腺腫瘤的進一步發(fā)展。雷建軍等[42]運用HIF-1α沉默技術(shù)抑制胰腺癌PANC-1細(xì)胞HIF-1α表達，能夠抑制缺氧誘導(dǎo)的胰腺PSCs活化。Xiao等[43]研究結(jié)果顯示，白藜蘆醇（resveratrol，RSV）可抑制缺氧條件下HIF-1a的積累。更有趣的是，研究[44]發(fā)現(xiàn)galectin-1的表達也因腫瘤內(nèi)HIF-1α的增加而上調(diào)，但其具體發(fā)生機制尚不清楚?？偟膩碚f，異常生長的實體腫瘤首先腫瘤快速生長引發(fā)腫瘤內(nèi)缺氧，隨后誘導(dǎo)PSCs活化促進VEGF分泌和HIF-1α的穩(wěn)定，通過激活內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，增強細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的保護，幫助血管內(nèi)皮細(xì)胞創(chuàng)造新的毛細(xì)血管，以便豐富腫瘤內(nèi)部血供。因此，打破這個惡性循環(huán)可能是治療PDAC的一個很有希望的策略，由于HIF-1α主要存在于細(xì)胞核中，是一種轉(zhuǎn)錄因子，阻斷它具有一定的困難，關(guān)于有效靶點仍沒有得到解答。

4 總 結(jié)

總之，盡管腫瘤細(xì)胞本身的轉(zhuǎn)移潛能是PDAC患者預(yù)后的一個重要預(yù)后因素，但現(xiàn)在越來越多的人認(rèn)識到PSCs在這一過程中的關(guān)鍵作用。腫瘤進展的最重要因素是它們能夠誘導(dǎo)局部內(nèi)皮細(xì)胞增殖，并經(jīng)歷形態(tài)學(xué)改變?yōu)榉忾]的管腔結(jié)構(gòu)，這是新血管生成的標(biāo)志性過程。在錯綜復(fù)雜的胰腺腫瘤微環(huán)境中，活化的PSCs通過分泌HGF、galectin-1，或者在缺氧環(huán)境下HIF-1增加，都會促進VEGF的分泌，進而促進腫瘤新生血管的生成。PSCs在PDAC血管發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要的“橋梁”作用。到目前為止，對PDAC中PSCs的了解也僅僅是冰山一角，其中的具體機制需要繼續(xù)深入研究，例如PSCs是如何抑制PDAC血管生成，抑制作用與促進作用是否有交叉點等。進一步理解PDAC進展、耐藥和轉(zhuǎn)移的分子生物學(xué)機制，可能發(fā)現(xiàn)PDAC發(fā)生的新機制或抗腫瘤藥物的新靶點。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。