馬軍，郝莉花

(河南省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院，河南 鄭州，450000)

茶葉因其具有獨(dú)特的口感風(fēng)味和保健作用，深受消費(fèi)者喜愛[1]。茶葉的食品安全問題，如重金屬超標(biāo)、農(nóng)藥殘留，特別是非法添加香精香料等問題日益引起人們的關(guān)注[2-3]。

常用香精香料大都具有怡人的氣味。如樟腦有清涼、芳香的氣味[4]；胡薄荷酮具有薄荷味芳香[5]；胡椒酚甲醚和反式茴香腦具有甜味，呈似茴香香氣；桉油精，又名1,8-桉葉(油)素，有類樟腦氣味[6]。研究表明，樟腦具有毒性，會(huì)對(duì)人體神經(jīng)系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)等產(chǎn)生危害[7]；胡薄荷酮為2B類致癌物[8]。因此，食品中添加香料、香精有嚴(yán)格的限制。中國(guó)、美國(guó)和歐盟等對(duì)在食品中允許使用的香精成分及限量做出了明確規(guī)定[9]。我國(guó)GB 2760—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定茶葉不得添加香料香精。上述5種香精均為茶葉中可能添加的禁用香精[10-12]。

近幾年，茶葉中禁用香精成為研究熱點(diǎn)。目前香精香料主要研究方法有高效液相色譜法(high performance liquid chromatography, HPLC)[13]、超高效液相色譜法(ultra performance liquid chromatography, UPLC)[14]和超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-tandem mass spectrometry, UPLC-MS/MS)[15]。梁志森等[11]運(yùn)用UPLC-MS/MS法檢測(cè)茶葉中7種香精，香精多為小分子，有些香精分子質(zhì)量接近流動(dòng)相，因此檢測(cè)效果不佳。香精香料成分多具有揮發(fā)性，氣相色譜法[16]、氣相色譜-質(zhì)譜法(gas chromatography mass spectrometry， GC-MS)[17-18]和氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(gas chromatography tandem mass spectrometry， GC-MS/MS)[19]相比液相色譜法更適合揮發(fā)性物質(zhì)的定性和定量檢測(cè)，因此GC-MS和GC-MS/MS在香精香料檢測(cè)應(yīng)用較多。陳玉珍等[12]基于氣相色譜-四級(jí)桿/飛行時(shí)間質(zhì)譜法建立了檢測(cè)茶葉中10中香料化合物的方法。王玉嬌等[10]采用QuEchERS技術(shù)結(jié)合GC-MS/MS，建立了快速檢測(cè)茶葉中6種禁用香精成分的方法。梁嘉慧[20]建立了基于全二維氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)茶葉中香精的高通量篩查方法。上述方法共同特點(diǎn)是需要對(duì)茶葉進(jìn)行前處理，降低基質(zhì)干擾。但茶葉基質(zhì)復(fù)雜，經(jīng)過固相萃取或QuEchERS技術(shù)對(duì)待測(cè)物會(huì)造成損失，凈化后的基質(zhì)仍存在較多雜質(zhì)，不僅增加儀器損耗，同時(shí)增加基線噪聲，降低靈敏度[21]。茶葉中香精香料含量較低，檢測(cè)靈敏度不足會(huì)導(dǎo)致較多假陰性，方法也無(wú)法較好應(yīng)用于本底調(diào)查。

靜態(tài)頂空氣進(jìn)樣前處理簡(jiǎn)單，能減少揮發(fā)性物質(zhì)的損失，也可降低噪聲[22]。采用靜態(tài)頂空氣法對(duì)茶葉中微量揮發(fā)性物質(zhì)分析，能有效減少?gòu)?fù)雜基質(zhì)的干擾，具有定性定量準(zhǔn)確度高、特異性強(qiáng)、靈敏度高、穩(wěn)定性好的優(yōu)點(diǎn)[23]。香精屬于易揮發(fā)化合物，靜態(tài)頂空氣法具有測(cè)定香精的優(yōu)勢(shì)。此外，由于茶葉基質(zhì)更為復(fù)雜，茶葉中揮發(fā)性化合物含量低且種類多，而飛行時(shí)間質(zhì)譜法的特異性強(qiáng)、分辨相似化合物能力強(qiáng)，相比于四極桿質(zhì)譜和串接四極桿質(zhì)譜能避免樣品假陽(yáng)性。飛行時(shí)間質(zhì)譜結(jié)合靜態(tài)頂空氣進(jìn)樣系統(tǒng)能夠增加進(jìn)樣量、減少基質(zhì)干擾，獲得更好的檢測(cè)效果，在茶葉禁用香精檢測(cè)方面有一定的應(yīng)用前景。

為開發(fā)一種簡(jiǎn)便、快捷、高靈敏度和高準(zhǔn)確性的5種禁用香精檢測(cè)方法，本研究以市售綠茶及綠茶再制茶為研究對(duì)象，基于靜態(tài)頂空氣-氣相色譜串接飛行時(shí)間質(zhì)譜同時(shí)測(cè)定多種禁用香精，以期為綠茶禁用香精的檢測(cè)和判別提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

綠茶、花茶樣品、綠茶香精，網(wǎng)購(gòu)；樟腦、胡薄荷酮、胡椒酚甲醚、桉油精、反式茴香腦(≥98%)，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer GmbH公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7697A-7890B-7200頂空氣進(jìn)樣-氣相色譜串接飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，美國(guó)Agilent公司；ME 204分析天平，梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 綠茶樣品處理

綠茶經(jīng)粉碎后立即過60目篩，篩下物密封保存。測(cè)定時(shí)準(zhǔn)確稱取篩下物2 g于20 mL頂空瓶中，迅速封蓋，待測(cè)定?！懊?”作為空白綠茶試樣。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：分別稱取10 mg樟腦、胡薄荷酮、胡椒酚甲醚、桉油精和反式茴香腦于10 mL容量瓶中，用丙酮混勻并定容，配制成1 000 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

標(biāo)準(zhǔn)品混合液：量取20 μL樟腦、胡薄荷酮、胡椒酚甲醚、桉油精和反式茴香腦標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于100 mL容量瓶中，用丙酮混勻并定容，配制成0.2 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)品混合液。

標(biāo)準(zhǔn)品混合中間液：量取1 mL標(biāo)準(zhǔn)品混合液于10 mL容量瓶中，用丙酮定容并混勻，配制成0.02 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)品混合中間液。

基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線配制：在頂空瓶中準(zhǔn)確稱量空白試樣2 g，分別準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)品混合中間液100、50、25 μL，標(biāo)準(zhǔn)品混合液100、50 μL，迅速封蓋，室溫靜置72 h，配制成10、5、2、1、0.5 μg/kg的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

1.3.3 儀器參數(shù)條件

頂空進(jìn)樣條件：頂空瓶溫度140 ℃；定量環(huán)溫度150 ℃；傳輸線溫度160 ℃；平衡時(shí)間80 min；進(jìn)樣體積1.0 mL；頂空瓶搖晃次數(shù)100 次/min。

氣相色譜條件：DB-624UI(30 m×0.25 mm×1.4 μm)毛細(xì)管色譜柱；載氣He，流速1.2 mL/min；進(jìn)樣采用脈沖分流進(jìn)樣，分流比20∶1；進(jìn)樣口溫度260 ℃；柱溫箱升溫程序：40 ℃保持1 min，以5 ℃/min升至120 ℃，20 ℃/min升至260 ℃；傳輸線溫度280 ℃。

質(zhì)譜條件：檢測(cè)方式為質(zhì)量全掃描模式，掃描質(zhì)量范圍m/z35～600；電離方式為電子轟擊離子源(EI源，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃)。

1.3.4 定性定量方法

測(cè)定的樣品與濃度相近的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的定性/定量離子比例偏差均≤20%，則定性通過，定性離子和定量離子m/z提取分辨率為20×10-6，各化合物的定性離子和定量離子詳見表1。

表1 待測(cè)化合物定量離子、定性離子及保留時(shí)間Table 1 Quantitative ion, qualitative ion and retention time of the compounds to be tested

上機(jī)測(cè)定基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，以化合物濃度(X，μg/kg)為橫坐標(biāo)，以定量離子豐度Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別測(cè)定待測(cè)液的定量離子豐度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算得到待測(cè)液中的各化合物濃度，外標(biāo)法定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器參數(shù)的選擇

在空白綠茶試樣中添加10 μL的樟腦、胡薄荷酮、胡椒酚甲醚、桉油精和反式茴香腦標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，相當(dāng)于添加質(zhì)量濃度為5 mg/kg，采用1.3.3儀器參數(shù)條件對(duì)樣品進(jìn)行采集。自動(dòng)積分總離子流圖并積分識(shí)別化合物，扣除化合物附近的基線背景并與NIST數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，對(duì)化合物確證。上述5種化合物總離子流圖見圖1。

圖1 五種化合物總離子流圖Fig.1 Total ion current map of five compounds

從圖1可以看出，使用DB-624UI色譜柱能夠?qū)ι鲜?種化合物做到基線完全分離，保留時(shí)間在8～12 min，化合物在色譜柱上分離和保留效果較好。在此基礎(chǔ)上選擇1個(gè)定量離子和2個(gè)定性離子，并準(zhǔn)確采集m/z。為了降低基線噪聲和降低假陽(yáng)性率，定性離子和定量離子m/z提取分辨率設(shè)定為20×10-6。

2.2 頂空加熱溫度

在頂空瓶中準(zhǔn)確稱量空白綠茶試樣2 g，分別加入10 μL的樟腦、胡薄荷酮、胡椒酚甲醚、桉油精和反式茴香腦標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，迅速封蓋，靜置72 h，配制成5 mg/kg陽(yáng)性樣品。設(shè)定頂空平衡時(shí)間30 min，頂空瓶溫度分別60、80、100、120、140 ℃進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。以頂空瓶溫度為橫坐標(biāo)，化合物定量離子相對(duì)豐度(以140 ℃對(duì)應(yīng)的豐度為100%)為縱坐標(biāo)繪制并擬合指數(shù)曲線，見圖2。

圖2 加熱溫度對(duì)待測(cè)物相對(duì)豐度的影響Fig.2 Effect of headspace heating temperature on relative abundance of tested compounds

隨溫度升高，化合物響應(yīng)變大。樟腦、胡薄荷酮、胡椒酚甲醚和反式茴香腦指數(shù)擬合相關(guān)系數(shù)(r2)>0.9?；衔锵鄬?duì)豐度隨頂空瓶溫度增加呈指數(shù)增大趨勢(shì)，這說明了提高溫度能夠顯著提高頂空氣中化合物濃度。但是，頂空瓶溫度增加到160 ℃時(shí)茶葉嚴(yán)重焦糊，產(chǎn)生煙霧會(huì)加速儀器損耗，部分頂空瓶泄露，污染設(shè)備。綜上所述，選擇頂空加熱溫度140 ℃。

2.3 頂空平衡時(shí)間

在頂空瓶中準(zhǔn)確稱量空白綠茶試樣2 g，分別加入10 μL的樟腦、胡薄荷酮、胡椒酚甲醚、桉油精和反式茴香腦標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，迅速封蓋，靜置72 h，配制成5 mg/kg陽(yáng)性樣品。設(shè)定頂空瓶溫度140 ℃，頂空平衡時(shí)間分別為5、20、40、60、80、100 min進(jìn)行單因素試驗(yàn)。以頂空平衡時(shí)間為橫坐標(biāo)，化合物定量離子相對(duì)豐度(以最高響應(yīng)對(duì)應(yīng)的豐度為100%)為縱坐標(biāo)繪制并擬合趨勢(shì)線，見圖3。

圖3 平衡時(shí)間對(duì)待測(cè)物相對(duì)豐度的影響Fig.3 Effects of headspace equilibrium time on relative abundance of tested compounds

隨平衡時(shí)間延長(zhǎng)，化合物響應(yīng)先變大后趨于平緩。響應(yīng)最大值在80 min附近。繼續(xù)增加平衡溫度不能顯著提高響應(yīng)值。相反，如胡椒酚甲醚可能因高溫加壓導(dǎo)致緩慢泄漏，響應(yīng)降低。因此本研究中選擇的頂空平衡時(shí)間為80 min。

2.4 檢出限和線性范圍

在頂空瓶中準(zhǔn)確稱量空白綠茶試樣2 g，按照1.3.2配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線最低點(diǎn)0.5 μg/kg上機(jī)測(cè)試。以3倍信噪比(S/N)響應(yīng)時(shí)所對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度作為檢出限。各化合物S/N分別為：樟腦5.1、胡薄荷酮5.6、胡椒酚甲醚15.8、桉油精7.7、反式茴香腦10，詳見圖4。由此獲得方法檢出限：樟腦0.3 μg/kg、胡薄荷酮0.3 μg/kg、胡椒酚甲醚0.1 μg/kg、桉油精0.2 μg/kg、反式茴香腦0.2 μg/kg。

按照1.3.2配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，上機(jī)測(cè)試，進(jìn)行線性回歸。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線可知，5種化合物在0.5～10 μg/kg的范圍內(nèi)的線性回歸方程分別為樟腦y=811.69x+1 289.3，R2=0.998；胡薄荷酮y=124.76x+33.027，R2=0.999；胡椒酚甲醚y=2 092.7x-559.19，R2=0.999；桉油精y=551.34x+121.71，R2=0.999；反式茴香腦y=364.63x+319.52，R2=0.999；表明具有較好的線性關(guān)系。

a-樟腦；b-胡椒酚甲醚；c-反式茴香腦；d-胡薄荷酮；e-桉油精圖4 化合物檢出限附近的信噪比Fig.4 Signal to noise ratio near the detection limit of tested compounds

2.5 精密度

在空白綠茶試樣中添加5個(gè)不同質(zhì)量濃度(0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μg/kg)的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行加標(biāo)試驗(yàn)，每個(gè)添加水平平行測(cè)定6次，精密度以相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)表示，詳見表2。5種化合物總體RSD為0.88%～3.36%，表明該方法精密度良好。

表2 待測(cè)化合物的精密度 單位：%

2.6 實(shí)際樣品測(cè)定

采購(gòu)了市售綠茶及再制茶23批次，其中綠茶13批次(碧螺春2批次、毛尖9批次、抹茶粉2批次)，茉莉花茶(綠茶再制茶)10批次。

使用本研究建立的方法測(cè)定樟腦、胡薄荷酮、胡椒酚甲醚、桉油精、反式茴香腦。桉油精檢出7批次，占比30%，檢出率較高說明綠茶及茉莉花茶中可能存在本底。胡椒酚甲醚和樟腦各檢出一批次。其中碧螺春1和茉莉花茶3桉油精含量分別為210和330 μg/kg，明顯高于其他樣品，此外胡椒酚甲醚和樟腦也在茉莉花茶3中檢出。說明市售綠茶及茉莉花茶中可能存在禁用香精的使用情況。

3 結(jié)論與討論

研究建立了靜態(tài)頂空-氣相色譜串接飛行時(shí)間質(zhì)譜法測(cè)定綠茶中5種禁用香精方法，該法使用揮發(fā)性化合物測(cè)定柱DB-624UI對(duì)化合物分離，優(yōu)化了頂空加熱溫度和平衡時(shí)間，獲得了良好的檢測(cè)效果。5種化合物在質(zhì)量濃度0.5～10 μg/kg時(shí)具有較好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r2為0.998～0.999。方法檢出限：樟腦0.3 μg/kg、胡薄荷酮0.3 μg/kg、胡椒酚甲醚0.1 μg/kg、桉油精0.2 μg/kg、反式茴香腦0.2 μg/kg。相比氣相色譜飛行時(shí)間質(zhì)譜法(檢出限為30～100 μg/kg)[12]。和液相色譜質(zhì)譜法(檢出限為20～30 μg/kg)[11]。5種禁用香精的檢出限在0.1～0.3 μg/kg，靈敏度提高了2個(gè)數(shù)量級(jí)。與液體進(jìn)樣相比，頂空進(jìn)樣體積大、基質(zhì)干擾物較少，因此檢測(cè)靈敏度高。此外，樣品不需要經(jīng)過提取和凈化，節(jié)省了前處理耗材、提取溶劑等消耗，操作簡(jiǎn)便，成本低，同時(shí)也降低了儀器的維修保養(yǎng)頻次。該方法RSD為0.88%～3.36%，表明其精密度良好。測(cè)量不確定度主要來(lái)自樣品稱樣質(zhì)量和儀器本身誤差，不確定度來(lái)源較少，方法容易再現(xiàn)。

研究檢測(cè)了市售綠茶及茉莉花茶23批次，測(cè)定樟腦、胡薄荷酮、胡椒酚甲醚、桉油精、反式茴香腦。桉油精檢出7批次，胡椒酚甲醚和樟腦各檢出1批次。其中碧螺春1和茉莉花茶3桉油精含量分別為210和330 μg/kg，明顯高于其他樣品，此外胡椒酚甲醚和樟腦也在茉莉花茶3中檢出。說明了市售綠茶及茉莉花茶中可能存在禁用香精的使用情況。桉油精檢出7批次，占比30%，綠茶及茉莉花茶中可能存在本底。因此，判斷風(fēng)味化合物是否為茶葉中禁用香精，本底調(diào)查尤為重要。

市售綠茶及茉莉花茶中桉油精檢出7批次，其中5批次小于20 μg/kg；胡椒酚甲醚和樟腦各檢出1批次，均小于20 μg/kg。這些化合物在本次檢測(cè)的茶樣中含量低，采用氣相色譜飛行時(shí)間質(zhì)譜法和液相色譜質(zhì)譜法均較難檢出。因此，基于靜態(tài)頂空-氣相色譜串接飛行時(shí)間質(zhì)譜法測(cè)定茶葉禁用香精，檢測(cè)的靈敏度高，更適合綠茶禁用香精的本底調(diào)查。