胡峣峣，肖珊,*，王波，蔡燕雪，王際輝,*

1(大連工業(yè)大學 生物工程學院，遼寧 大連，116034)2(東莞理工學院 化學工程與能源技術(shù)學院，廣東 東莞，523808)

發(fā)酵食品是指利用有益微生物或酶的作用，使加工原料發(fā)生有益的物理或化學變化而制得的一類食品，在人類的飲食文化中占有重要地位。動物性食品包括畜禽肉、蛋類、水產(chǎn)品、奶制品等。發(fā)酵動物性食品是以動物性食品為主要原料，在自然或人工控制條件下，利用微生物的發(fā)酵或酶的水解作用使原料發(fā)生一系列生物化學變化及物理變化，從而形成風味、色澤和質(zhì)地獨特且具有較長保質(zhì)期的食品，主要包括奶酪、發(fā)酵乳、干腌火腿、發(fā)酵香腸、發(fā)酵酸肉、魚露、發(fā)酵魚肉等。動物性食品蛋白含量豐富，在發(fā)酵過程中微生物的蛋白水解系統(tǒng)可以直接分泌產(chǎn)生大量蛋白酶，將蛋白質(zhì)降解為小分子多肽。研究表明，這些小肽(活性肽)具有抗氧化、降血壓、降血脂、抗疲勞以及免疫調(diào)節(jié)等一系列生理功能[1]，其功能活性與氨基酸的組成、序列、分子質(zhì)量、電荷和空間構(gòu)象等有關(guān)。研究證實，經(jīng)口服攝入活性肽后，部分在消化道內(nèi)發(fā)揮一定的生理功能，部分可完整通過腸上皮細胞，吸收入血后通過免疫、神經(jīng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)等發(fā)揮生理功能[2]。本文探討了發(fā)酵動物性食品中生物活性肽的來源、分類、分離提純、結(jié)構(gòu)分析方法以及產(chǎn)生機理，以期為進一步挖掘發(fā)酵動物性食品來源生物活性肽提供參考。

1 發(fā)酵動物性食品來源生物活性肽的生理功能

生物活性肽(bioactive peptide, BAP)是指對生物機體的生命活動有益或具有生理作用的肽類分子。生物活性肽是氨基酸以不同的組成和排列方式構(gòu)成的，結(jié)構(gòu)介于氨基酸和蛋白質(zhì)之間，小到只有2個氨基酸，大到復雜的長鏈或環(huán)狀多肽，并可通過糖基化、磷酸化或酰基化而被修飾[3]。目前，在發(fā)酵動物性食品中發(fā)現(xiàn)的生物活性肽主要有抗高血壓、抗氧化、抗菌、抗炎、抗血栓、降低膽固醇等功能特性[4]。表1列舉了近年來發(fā)酵動物性食品的種類、優(yōu)勢菌群及其產(chǎn)生生物活性肽的種類、來源、氨基酸序列等。

1.1 血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin converting enzyme,ACE)會將血管緊張素型轉(zhuǎn)化為Ⅰ型、轉(zhuǎn)化為Ⅱ型，ACE抑制肽可抑制轉(zhuǎn)化酶的活力，從而起到預防或治療高血壓的作用。目前，在奶酪、發(fā)酵乳、火腿、發(fā)酵魚等發(fā)酵動物性食品中發(fā)現(xiàn)了具有抗高血壓活性的生物活性肽[5-7]。

1.2 抗氧化肽

抗氧化肽是指能夠清除自由基、抑制脂質(zhì)過氧化、螯合過渡金屬離子和降低細胞自氧化速率，并且能夠有效捕獲并中和自由基的一類活性物質(zhì)。在酸奶、火腿、奶酪、蝦醬等發(fā)酵動物性食品中已經(jīng)被分離出多種抗氧化肽，且具有生物活性高和毒性低等優(yōu)點[8]?？寡趸氖悄壳笆吃葱蕴烊划a(chǎn)物的研究熱點。據(jù)統(tǒng)計，目前在多肽數(shù)據(jù)庫(BIOPEP數(shù)據(jù)庫)已知的3 285個肽段中，抗氧化肽占比最高，約為16.1%[9]。發(fā)酵動物制品中含有豐富的抗氧化肽，其形成機理和加工條件對抗氧化肽形成的影響研究相對較少。

1.3 降血糖肽

目前臨床上常用于控制血糖和預防糖尿病的藥物中包含二肽基肽酶IV抑制劑(DPP-IV)類藥物[10-11]，降血糖肽就是作為DPP-IV抑制劑進而發(fā)揮降低血糖作用的[6]。目前對于天然食品源降糖肽研究較少，特別是發(fā)酵動物性食品中降糖肽鮮有報道，發(fā)酵動物性食品含有豐富的肽類物質(zhì)，有關(guān)降糖肽的提取分離、結(jié)構(gòu)表征及其降糖機制等方面的研究有待進一步深入。

1.4 抗菌肽

抗菌肽是指具有一定抗菌、抗病毒和抗真菌活性的小分子蛋白質(zhì)，分子結(jié)構(gòu)具有兩親性，一般帶正電荷[12]。發(fā)酵動物性食品中含有大量細菌或真菌的發(fā)酵產(chǎn)物，這些發(fā)酵產(chǎn)物中抗菌肽含量豐富，天然食品來源的抗菌肽毒性低，可應用于研發(fā)食品防腐劑和抗生素替代品，具有廣泛的應用前景[13-14]。但目前關(guān)于發(fā)酵動物性食品中抗菌肽的研究較少，抗菌肽的結(jié)構(gòu)組成和抗菌機理尚不明確。

1.5 抗炎肽

抗炎肽是機體通過綜合調(diào)控細胞炎癥因子的分泌、炎性介質(zhì)合成與釋放和炎癥信號通路，調(diào)節(jié)機體炎癥反應的一類小分子肽，一般由2個或多個氨基酸組成。小分子肽通常在完整的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中不能發(fā)揮其生物活性，而經(jīng)過酶解或在酸堿等極端條件下被釋放出來時才會表現(xiàn)出其特定的生理活性[15]。發(fā)酵動物性食品蛋白含量高，是抗炎肽的良好來源[16-17]。目前發(fā)酵動物性食品中抗炎肽的研究相對較少，這些肽如何產(chǎn)生與釋放，是否可進入細胞，以及其如何介導細胞炎性反應有待深入研究。

表1 發(fā)酵動物性食品來源生物活性肽的種類及氨基酸序列Table 1 Summary of the type and amino acid sequences of bioactive peptides from animal-derived fermented foods

2 生物活性肽的制備與提取

多肽的制備和提取方法較多，各有利弊，可以通過對多肽性質(zhì)的研究優(yōu)化提取方法，進而獲得高活性、高純度和大批量的生物活性肽。目前從發(fā)酵動物性食品中獲取生物活性肽的方法主要包括蛋白酶水解、浸取、雙水相萃取等。酶解法制備生物活性肽的優(yōu)點是生產(chǎn)工藝成本低、化學試劑和毒性物質(zhì)殘留少，目前廣泛應用于生物活性肽的制備工藝中。酶解蛋白常用的酶包括胃蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶以及木瓜蛋白酶等。祝超智[28]用胃蛋白酶、胰酶等消化酶對金華火腿抗氧化肽進行酶解提取，分析比較了酶解前后肽段的抗氧化活性差異，結(jié)果表明酶解后分子質(zhì)量更小的肽段具有更強的抗氧化活性。

雙水相萃取技術(shù)(aqueous two-phase extraction,ATPS)與液相萃取技術(shù)原理相似，都是利用目標物在兩水相的溶解度不同，導致分配系數(shù)存在差異而對目標物進行分離的技術(shù)[33]。在雙水相系統(tǒng)中，兩相的水分都在85%～95%左右，且成相的高聚物與無機鹽都是生物相容的，這一新型分離技術(shù)的特點是生物活性物質(zhì)或細胞在這種水相環(huán)境下，它們不僅不會喪失活性，而且還會提高穩(wěn)定性，在生物分離技術(shù)領(lǐng)域有較好的應用前景。目前采用雙水相萃取技術(shù)從發(fā)酵動物性食品中提取生物活性肽還未見報道，但有采用該方法從乳清分離蛋白中分離出生物活性肽的報道[34]。雙水相萃取技術(shù)應用的難點在于雙水相體系的構(gòu)建，利用新的雙水相體系對生物活性肽進行分離純化的開發(fā)過程較為繁雜，但該方法對于生物活性肽的大批量分離純化具有重要意義。

3 生物活性肽的分離純化及結(jié)構(gòu)分析

3.1 分離純化

生物活性肽的分離純化是其生物活性研究與結(jié)構(gòu)鑒定的基礎(chǔ)，通常會根據(jù)分子質(zhì)量、等電點、疏水性、酸堿性等理化性質(zhì)的不同，選擇合適的分離純化方法。同時，多維色譜組合，以及多種分離方法聯(lián)用，可以獲得更好的分離效果。發(fā)酵動物性食品中研究比較多的是發(fā)酵肉制品和發(fā)酵乳制品，從這些產(chǎn)品中分離純化生物活性肽通常采用超濾、凝膠層析色譜、離子交換色譜以及各方法與反相液相色譜的聯(lián)用等。

忽曉平[35]利用孔徑分別為3 k、10 kDa的超濾膜分離金華火腿粗肽，得到2種不同分子質(zhì)量的多肽組分，并且分子質(zhì)量<3kD的金華火腿小肽的抗氧化活性顯著高于粗肽?？铝x強[36]使用Sephadex系列凝膠將發(fā)酵法制備的牦牛乳酪蛋白抗氧化肽按照分子質(zhì)量大小進行分離，將超濾后的組分依次經(jīng)過凝膠SephadexG-50、SephadexG-25和SephadexG-10，其中經(jīng)SephadexG-25凝膠過濾層析后的組分F1，再經(jīng)過SephadexG-10凝膠層析后，其抗氧化能力顯著提升。邢路娟[27]采用陰離子交換柱(HiPrep 16/10 DEAE)為固定相，用0～100% NaCl與磷酸鹽緩沖液進行梯度洗脫，以2 mL/min的洗脫速度成功將宣威火腿中抗氧化肽組分分離出來。PIOVESANA等[37]采用反相高效液相色譜分離與柱后添加增壓劑相結(jié)合的方法分離小分子多肽，以多孔石墨碳作為固定相，極大增加了極性分子和離子在固定相中的保留時間，從而可以更有效地分離純化極性高的多肽[37]。在實際應用中，單一的分離方法往往不能達到良好的分離效果，將多種分離方法進行組合可以得到高純度高活性的多肽，例如離子交換色譜-反相液相色譜結(jié)合、凝膠過濾色譜-反相高效液相色譜結(jié)合。XING等[38]采用陰離子交換柱和反相高效液相色譜聯(lián)用對宣威火腿的多肽組分進行了分離，根據(jù)其電荷性和疏水性的不同，分離出了抗氧化活性較強的組分。除了2種分離方法聯(lián)用外，3種分離方法的聯(lián)用也被普遍應用，多種分離技術(shù)的優(yōu)勢互補，更有利于復雜樣品的分離純化。

3.2 生物活性肽一級結(jié)構(gòu)分析

生物活性肽的結(jié)構(gòu)鑒定方法研究對于揭示多肽結(jié)構(gòu)與功能間的關(guān)系具有重要意義。目前發(fā)酵動物性食品中生物活性肽的一級結(jié)構(gòu)分析方法主要有電泳法和質(zhì)譜法。

不同發(fā)酵動物性食品源的ACE抑制肽氨基酸序列和肽鏈長度各不相同，但都具有相似的生理功能，生物活性肽肽鏈C-端氨基酸的組成是與ACE活性部位結(jié)合的關(guān)鍵，因此C-端的三肽序列會影響ACE抑制活性。有研究表明[39]，該三肽序列為疏水性氨基酸(芳香族氨基酸/帶支鏈氨基酸)或為賴氨酸和精氨酸且ε-氨基帶正電荷均可提高ACE抑制活力?？傊钚暂^強的ACE抑制肽肽鏈N-端一般為疏水性氨基酸或堿性氨基酸，C-端一般為具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的芳香族氨基酸或脯氨酸。

在抗氧化肽中，氨基酸的組成及其在肽段中的位置是其抗氧化活性強度的主要影響因素，目前，已有研究表明抗氧化肽肽段中含有His、Leu、Met及芳香族氨基酸(Tyr、Trp、Phe)可提高其自由基清除能力。發(fā)酵乳制品來源的抗氧化肽中Tyr、His、Lys、Pro等氨基酸含量高，Cys含量低。金華火腿和宣威火腿的抗氧化肽中His含量最高，其次為Glu、Lys、Asp、Val和Leu，而Cys的含量均最低[27]。這些氨基酸都具有自由基清除能力，但這些氨基酸的組成含量以及在肽段中的位置對發(fā)酵動物性食品來源的抗氧化肽活性的影響有待進一步探討。

邢路娟[27]采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC-MS/MS)成功對宣威火腿中抗氧化肽進行分離純化和二級質(zhì)譜鑒定。目前除了采用質(zhì)譜法鑒定多肽序列以外，電泳法也是一個輔助手段。電泳法不僅可快速得出多肽基本的信息(分子質(zhì)量和等電點等)，為進一步鑒定多肽結(jié)構(gòu)奠定基礎(chǔ)，同時也可分離多肽。電泳技術(shù)包括毛細管電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳以及等電聚焦電泳等。目前，有關(guān)電泳法對發(fā)酵動物食品中生物活性肽進行結(jié)構(gòu)鑒定的研究較少，毛細管電泳技術(shù)的優(yōu)點是其對疏水性相近的肽段的分離效果較好，可為進一步研究發(fā)酵動物食品中生物活性肽的結(jié)構(gòu)和功能提供新的途徑。

3.3 生物活性肽的空間結(jié)構(gòu)與特殊官能團分析

目前生物活性肽的空間結(jié)構(gòu)和特殊官能團的分析方法主要有分子對接模擬、紅外光譜和圓二色譜等。分子對接模擬可以分析ACE抑制肽和DPP-IV抑制肽的作用位點和作用力。氫鍵、疏水作用、離子鍵和范德華力等是維持蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的重要因素，抑制肽對酶的抑制作用是通過氫鍵和疏水作用等作用力實現(xiàn)的。采用Gold進行分子對接模擬，可以預測ACE抑制肽或DPP-IV抑制肽能否與相關(guān)酶的主要活性部位氨基酸結(jié)合形成氫鍵，從而抑制ACE或DPP-IV與其他底物相結(jié)合，進而起到降低相關(guān)酶活性的作用。通過分子對接模擬分析可以得到肽段與酶結(jié)合的三維結(jié)構(gòu)圖和二維結(jié)構(gòu)圖，說明肽段可與酶的活性位點結(jié)合形成氫鍵，并且得出氫鍵和范德華力的共同存在可使酶與多肽的結(jié)合更穩(wěn)定[6]。因此，DPP-IV和ACE抑制肽的抑制活性與肽和酶結(jié)合的穩(wěn)定性相關(guān)。

紅外光譜(infrared spectrum,IR)可通過特征基團的伸縮振動來推測多肽中可能存在的基團，也可通過對比紅外光譜譜圖峰形變化來確定化學反應前后多肽發(fā)生變化的基團。該方法主要用來分析多肽中存在的基團以及二級結(jié)構(gòu)。核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)通常與紅外光譜聯(lián)用，鑒定多肽中存在的特殊官能團，一般可用來分析少于30個氨基酸組成的多肽。圓二色譜(circular dichroism,CD)可對多肽的二級結(jié)構(gòu)進行鑒定和分析預測，對于進一步全面了解多肽的空間結(jié)構(gòu)具有重要作用[40]。

不同發(fā)酵動物性食品來源的生物活性肽、肽鏈長度不同、氨基酸組成不同，所形成的空間結(jié)構(gòu)也會不同，但目前有關(guān)發(fā)酵動物食品中生物活性肽的二級結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)鑒定的研究較少，分子對接模擬、紅外光譜和圓二色譜等分析方法可結(jié)合細胞水平和動物水平實驗進一步研究生物活性肽結(jié)構(gòu)和功能間的關(guān)系。

4 生物活性肽生物信息學研究方法

生物活性肽構(gòu)效關(guān)系的研究已經(jīng)取得一些進展，生物活性肽的氨基酸序列可以通過多種方法鑒定出來，但生物活性肽的功能活性和分子機制的研究方法目前還是需要大批量、高強度的實驗操作。為了提高科研效率，一些生物信息學網(wǎng)址提供的軟件和功能團模型可基于影響肽功能活性的結(jié)構(gòu)特征和理化因素對肽段進行高效的虛擬篩選，并且可以利用分子對接和分子動力學模擬等新型生物信息學技術(shù)以進一步系統(tǒng)的研究生物活性肽發(fā)揮功能活性的作用機制。表2為分析生物活性肽肽段序列常用的生物信息學研究工具。

UniProt是目前使用最廣泛的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫，UniProt主要功能分為以下兩個部分：來源于實驗的有詳細注釋的序列(SwissProt)和自動注釋序列(TrEMBL)。有詳細注釋的序列源于Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫，可信度非常高。源于TrEMBL的自動注釋序列是由核苷酸數(shù)據(jù)庫中注釋為蛋白質(zhì)編碼區(qū)的自動翻譯而成的序列，可信度較低，但也有一定的參考價值。UniProt整合了多個數(shù)據(jù)庫資源，與100多個數(shù)據(jù)庫統(tǒng)一了編號，可相互參照，互相鏈接，在UniProt中可用關(guān)鍵詞和序列比對對多肽序列進行檢索。UniProt中的UniRef板塊在UniProtKB板塊的基礎(chǔ)上可獲得冗余度更低的蛋白質(zhì)序列。UniProt數(shù)據(jù)庫中的Proteomes板塊收錄了已知物種編碼的所有蛋白質(zhì)及蛋白質(zhì)組學信息。

一般情況下，從天然來源的食物中分離純化并鑒定功能活性肽的結(jié)構(gòu)，以及驗證肽的活性，整個實驗過程繁瑣，耗時長。而在線數(shù)據(jù)庫和計算機分析工具等生物信息技術(shù)具有高效、省時的優(yōu)點，因此可以廣泛應用于功能肽的預測和鑒定中。另外，在綜合分析肽理化性質(zhì)和空間結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，通過生物信息學工具可進一步探究肽氨基酸殘基對其功能活性的影響，進而在很大程度上減少實驗量，高效獲得具有高活性的生物活性肽。

表2 分析肽段序列常用的生物信息學研究工具[41-43]Table 2 Bioinformatics tools for analyzing peptide sequences

5 發(fā)酵動物性食品來源生物活性肽的形成機理

研究表明，許多傳統(tǒng)的發(fā)酵動物性食品的加工時間較長，蛋白質(zhì)在內(nèi)源酶及微生物共同作用下，降解為結(jié)構(gòu)更簡單的二肽、三肽、寡肽或其他小分子多肽。下面以干腌火腿為例具體闡述發(fā)酵動物性食品在加工過程中生物活性肽形成機理。

豬肉肌肉含有多種蛋白水解酶，尤其是內(nèi)肽酶和外肽酶，它們在干腌過程中對肌原纖維和肌漿蛋白的水解起著重要作用。蛋白質(zhì)水解是先由內(nèi)肽酶啟動的，例如鈣蛋白酶和組織蛋白酶，特別是在后續(xù)15個月的加工過程中仍然活躍的組織蛋白酶B、H和L，可使蛋白質(zhì)被水解成小分子的蛋白和多肽。這些多肽可以被外肽酶進一步水解，產(chǎn)生小肽和游離氨基酸[44]。蛋白質(zhì)水解的程度和產(chǎn)生的生物活性肽數(shù)量受多個因素影響，包括原材料、肌肉酶的類型和活性、加工條件和加工時間等。如隨著加工時間的延長，肉的水分活度會降低，肌肉肽酶活性會在一定程度上有所下降，但在整個加工過程中肌肉的內(nèi)源酶還是會保持一定的活性的[45]。

研究表明，西班牙傳統(tǒng)干腌火腿成熟期間，肌肉在肽酶的作用下產(chǎn)生大量游離氨基酸和多肽。肌肉蛋白首先被內(nèi)源性內(nèi)肽酶(肽鏈內(nèi)切酶)水解，然后被一系列外肽酶進行連續(xù)的水解。這些蛋白質(zhì)水解反應是非常劇烈的，可以產(chǎn)生大量的游離氨基酸和不同序列與長度的肽類物質(zhì)，其中一些具有一定的生理活性，如血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性、抗氧化活性、二肽基肽酶IV抑制活性、體內(nèi)抗高血壓活性、降血糖活性和抗炎活性等[46]。目前應用肽組學工具可模擬火腿腌制等復雜化學變化以及模擬后續(xù)蛋白質(zhì)水解過程，并且使鑒定感興趣的肽段序列成為可能。研究表明，很多生物活性肽作為肌肉蛋白的一部分時沒有活性，但在干腌加工或胃腸消化過程中會被肌肉肽酶水解釋放出來，從而變得有生物活性[47]。

研究表明，主要的肌肉肽酶包括三肽酶(tripeptidase,TPP)和二肽酶(dipeptidase,DPP)，它們可以水解小分子蛋白和多肽N端的三肽和二肽。其中DPP Ⅰ、DPP Ⅱ和TPP Ⅰ的活性特別高，因為它們在微酸性(pH 5.5～6.5)的條件下活性最強，該微酸性條件與加工過程中火腿的pH(6.0～6.5)相接近。在西班牙干腌火腿加工過程中，被外肽酶水解的二肽有TS、TL、FD、VK、AT和QT，三肽有SRG、TVQ、NAS、KIE和GKM[7]。DPP Ⅰ和DPP Ⅱ可以從N端水解成如AE、RG、NP、IL、AG、SG和SQ等的二肽，而TPP I可以從N端水解成如IIP、RGA、GNP、GAG和GPG等的三肽，在N端主要由丙氨?；图琢虬滨；被拿杆猓尫诺陌被嵊蠫ly、Ser、Ala、Leu和Ile，而C端由羧基肽酶A和B水解，釋放的氨基酸有Leu、Tyr、Lys、Ala、Gly、Glu和Asp[48]。金華火腿在最后的加工階段持續(xù)的高溫有助于蛋白質(zhì)的水解，進而產(chǎn)生大量的肽類物質(zhì)，尤其是二肽(占23.59%)和三肽(占48.28%)。二肽主要包括VE、PL、AH和AR等，三肽主要包括LPK、SGL、AAP、SGV和LHA等，其他參與蛋白質(zhì)水解的外肽酶包括氨基肽酶和羧肽酶，它們分別從N端和C端開始水解蛋白質(zhì)，進而產(chǎn)生大量的游離氨基酸和小分子肽[49]。

然而，迄今為止，干腌火腿成熟過程中自然產(chǎn)生的多肽的結(jié)構(gòu)特征仍不清楚，特別是它們的生物活性與涉及加工過程的代謝反應的相關(guān)性尚不明確。另外，需要進一步研究影響干腌火腿生產(chǎn)加工過程中生物活性肽釋放的潛在因素。

6 總結(jié)和展望

目前，有關(guān)發(fā)酵動物性食品生物活性肽的分離、純化和鑒定的研究手段已較為完善，但該領(lǐng)域還有許多問題有待深入研究：(1)有待挖掘和研究促進發(fā)酵過程中生物活性肽高產(chǎn)出的菌株；(2)不同種類生物活性肽在體內(nèi)的生物利用率和作用機理研究較少；(3)多個具有不同空間結(jié)構(gòu)和不同氨基酸序列的生物活性肽在同時發(fā)揮其各種生理功能時是否有協(xié)同作用有待進一步研究;(4)缺乏細胞實驗、動物實驗、人體臨床實驗等進一步驗證多種生物活性肽的生理功能。