胡芳科 張銀光

(天津市天津醫(yī)院創(chuàng)傷骨科，天津 300201)

長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類長度大于200 nt，但不具備編碼蛋白質功能的RNA〔1〕。人類基因總數(shù)已達到60 554個，其中75%被轉錄，然而只有2%才可編碼蛋白質，其余RNA均不具有編碼功能，而lncRNA占到非編碼RNA的80%〔2〕，目前GENCODE數(shù)據(jù)庫(V32)中登記的人類lncRNAs可多達17 910種。LncRNA起初被認為是基因組轉錄的一個“噪音”，不具有生物學功能〔3〕，但自2002年lncRNA的概念首次提出以來〔4〕，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)lncRNA在基因表達調控方面發(fā)揮重要的作用，參與調控眾多的生物學進程，如細胞增殖分化、物種進化、胚胎發(fā)育、物質代謝及腫瘤發(fā)生等〔5，6〕。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNAs在DNA甲基化和組蛋白修飾等方面也起重要調控作用，在骨形成和骨吸收方面也發(fā)揮重要作用〔7〕。

骨質疏松是骨代謝失衡所導致的全身代謝性疾病。骨代謝是一個動態(tài)平衡過程，骨吸收大于骨形成，破骨細胞的分化或其功能的改變所導致的骨改建失衡是骨質疏松的重要病理基礎〔8〕。破骨細胞由造血干細胞(HSCs)中的單核/巨噬細胞系所分化而來，其在形成、增殖、分化、成熟及凋亡過程中受多種信號通路的影響〔9〕，越來越多的研究顯示多種lncRNAs對其中多條信號通路起調控作用〔10〕。Dou等〔11〕通過誘導小鼠單核巨噬細胞白血病細胞(RAW264.7)向破骨細胞分化，采用芯片技術分析破骨細胞分化不同階段lncRNA的差異表達，結果發(fā)現(xiàn)破骨前體細胞階段有1 643條lncRNA表達上調，2 705條表達下調；破骨細胞成熟階段有1 896條lncRNA表達上調，2 706條表達下調；破骨細胞激活階段有2 716條表達上調，3 124條表達下調。Zhou等〔12〕通過絕經(jīng)后骨質疏松患者外周血單核細胞的研究發(fā)現(xiàn)，有309條lncRNAs上調與266條lncRNA下調。越來越多的lncRNAs被發(fā)現(xiàn)于破骨細胞的分化增殖中起重要調節(jié)作用。

LncRNA在骨質疏松中對于破骨細胞的作用機制是近兩年來的研究熱點之一。LncRNA可以依賴與靶基因的相對位置及序列特點，采用如通過將轉錄調控因子募集到鄰近的靶基因啟動子上的方式等，在轉錄水平上調控靶基因的表達〔13〕。核轉錄因子(NF)-κB受體激活劑(RANK)/破骨細胞分化因子(RANKL)/護骨素(OPG)信號通路是影響破骨細胞分化與成熟的經(jīng)典信號通路〔14〕，多項研究發(fā)現(xiàn)lncRNA對于該通路有重要的調節(jié)作用〔14～16〕。除此之外，最新研究發(fā)現(xiàn)對于Notch信號通路〔17，18〕、活化T-細胞核因子蛋白(NFATc)1通路〔10，19〕、磷脂酰肌醇三激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信號通路〔20〕、無翅型MMTV整合位點家族成員(WNT)4通路〔21〕及磷酸酯酶與張力蛋白同源物(PTEN)通路〔22〕等也有明確的調節(jié)作用。檢索文獻發(fā)現(xiàn)，目前仍缺乏關于lncRNA在骨質疏松中對于破骨細胞作用機制的詳盡總結。本文基于上面情況，就lncRNA在骨質疏松中對于破骨細胞的研究進展進行詳盡綜述，為骨質疏松的進一步研究奠定基礎，期待將來發(fā)現(xiàn)針對lncRNA的骨質疏松治療靶點。

1 RNAK/RNAKL信號通路

1.1LncRNA-AK077216促進破骨細胞分化與骨吸收 NFATc1是一種破骨細胞生成轉錄因子，可經(jīng)由RANK/RANKL通路激活絲裂酶原活化蛋白激酶(MAPK)和NF-κB途徑，進而促進破骨細胞的分化〔23〕。NIP45可抑制NFATc1的表達，負向調節(jié)破骨細胞的分化和骨吸收〔24〕。Liu等〔15〕通過芯片檢測和熒光定量聚合酶鏈式反應(qPCR)實驗，發(fā)現(xiàn)在破骨細胞生成過程中l(wèi)ncRNA-AK077216的表達顯著上調。進一步研究發(fā)現(xiàn)，lnc-AK077216可抑制活化T細胞核因子胞質相互作用蛋白(NIP)45的表達，進而上調NFATc1的表達，促進RANKL誘導的破骨細胞生成和骨吸收〔15〕。Lnc-AK077216作為一種調節(jié)破骨細胞形成和功能的lncRNA，同時還可抑制破骨前體細胞凋亡，發(fā)揮其促進破骨細胞分化并增強骨吸收的功能〔25〕。

1.2LncRNA-Bmncr抑制破骨細胞分化 先前研究發(fā)現(xiàn)lncRNA-Bmncr可促進成骨細胞分化并抑制成脂細胞分化，從而在骨質疏松中起重要作用〔26〕。Chen等〔14〕應用RAW264.7、大鼠骨髓間充質干細胞(BMMs)及小鼠骨質疏松模型的研究發(fā)現(xiàn)，在骨質疏松小鼠中l(wèi)ncRNA-Bmncr的表達降低，并可通過抑制RANK/RANKL通路，抑制Atp6v0d2、人抗酒石酸酸性磷酸酶(Acp5)、降鈣素受體基因(Ctr)及基質金屬蛋白酶(Mmp)9的表達，進而抑制破骨細胞分化及骨吸收，從而起到抑制骨質疏松的作用〔14〕。

1.3LncRNA-NONMMUT037835.2抑制破骨細胞分化 Chang等〔16〕通過共表達網(wǎng)絡篩選破骨細胞在各發(fā)育時期相關的lncRNAs-信使RNA(mRNAs)，分析結果提示lncRNA-NONMMUT037835.2在破骨細胞分化中起重要作用。在C57Bl/6J小鼠實驗中發(fā)現(xiàn)，lncRNA-NONMMUT037835.2的上調可抑制破骨細胞分化，而其下調則可促進破骨細胞的形成與融合。研究進一步發(fā)現(xiàn)，本作用可能是通過負向調節(jié)RANK的表達及抑制NF-κB/MAPK信號通路實現(xiàn)的〔16〕。

1.4LncRNA-SNHG15抑制破骨細胞增殖 Liu等〔27〕在脊柱結核患者中的研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA-SNHG15的表達水平明顯升高。應用RAW264.7細胞系培養(yǎng)實驗發(fā)現(xiàn)，抑制lncRNA-SNHG15的表達可通過RANK/RANKL信號通路抑制IL-6與TNF-α等炎性因子，抑制破骨細胞增殖，但其在骨質疏松中的作用仍有待進一步研究。

2 Notch信號通路

2.1LncRNA-LINC00311促進破骨細胞分化 Notch信號通路不僅可增加骨質疏松患者成骨細胞的增殖與分化〔28〕，還可影響破骨細胞的增殖與分化〔17〕。δ樣配體(DLL)3是目前僅在哺乳動物中鑒定出的位于Notch信號通路中的分歧配體和調節(jié)劑，其與成骨誘導有關，還可通過Notch2調節(jié)破骨細胞的生成〔29〕，lncRNA-LINC00311正是通過DLL3調節(jié)Notch信號通路，從而影響破骨細胞的分化。Wang等〔17〕在大鼠骨質疏松的研究中發(fā)現(xiàn)，lncRNA-LINC00311的上調可負向影響DLL3和Notch1，從而調節(jié)Notch信號通路，上調Notch2的水平，促進破骨細胞的增殖與分化，抑制破骨細胞的凋亡，最終導致骨質疏松的發(fā)生。

2.2LncRNA-DANCR促進破骨細胞生成 LncRNA-DANCR不僅可通過p38/MAPK通路及叉頭框轉錄因子(FOXO)1通路影響成骨細胞分化〔30〕，還可通過Jagged1影響Notch通路，進而影響破骨細胞的形成〔18〕。Jagged1是Notch通路上破骨細胞的重要調節(jié)因子，可促進破骨細胞的生成〔31〕，miR-34a-5p也可抑制破骨細胞的生成并可與lncRNA-DANCR特異性作用〔32〕。Zhang等〔18〕在牙根應力研究中發(fā)現(xiàn)，阻斷l(xiāng)ncRNA-DANCR可以下調Jagged1，抑制破骨細胞的生成與骨吸收。進一步研究發(fā)現(xiàn)，這一作用與DANCR /miR-34a-5p有關。

3 NFATc1信號通路

3.1LncRNA-MIRG促進破骨細胞生成 LncRNA-MIRG是一種在肢體、肝臟及胎盤中高表達的lncRNA，研究發(fā)現(xiàn)其可與miR-1897特異性作用，促進破骨細胞生成與骨吸收〔19〕。Ling等〔19〕通過RAW264.7細胞系培養(yǎng)研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA-MIRG在破骨細胞生成過程中高表達，且其高表達與破骨細胞生成及吸收有關。進一步研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA-MIRG可與miR-1897特異性作用，從而上調NFATc1功能，促進破骨細胞的生成與骨吸收。

3.2LncRNA-ENSMUST00000134832和lncRNA-AK082203促破骨細胞分化 竇策〔10〕通過RAW264.7與小鼠骨髓巨噬細胞系BMMs進行破骨細胞分化培養(yǎng)，應用芯片技術檢測破骨細胞分化過程中各個階段的表達情況，構建lncRNA表達分析網(wǎng)絡，篩選出lncRNA-ENSMUST00000134832和lncRNA-AK082203，進一步研究發(fā)現(xiàn)其與轉錄因子人活化T細胞核因子(NFAT)1密切關聯(lián)，可上調NFAT1的表達，進而促進NFATc1的表達，實現(xiàn)了自我放大中的促進作用，是破骨細胞分化過程中正向調控的lncRNA。

3.3LncRNA-Janus激酶(Jak)3促進破骨細胞分化 Lee等〔33〕在痛風患者的研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA-Jak3及其共表達模式顯著上調。通過巨噬細胞系RAW264.7細胞系研究發(fā)現(xiàn)，在單水合尿酸鈉(MSU)誘導的條件下，lncRNA-Jak3可上調NFATc1的表達，促進破骨細胞分化。進一步機制研究發(fā)現(xiàn)，這一過程是通過NFATc1激活組織蛋白酶(Cts)k而實現(xiàn)的〔33〕，但其在骨質疏松中的作用仍有待進一步研究。

4 其他信號通路

4.1LncRNA鋅指和BTB結構域蛋白(ZBTB)40-IT1與lncRNA-ZBTB40通過WNT4等調節(jié)破骨細胞分化 ZBTB40、ZBTB40-IT1與WNT4基因均位于人1p36染色體上，WNT4可通過非經(jīng)典WNT通路抑制NF-κB，從而促進間充質干細胞(MSCs)向成骨細胞分化以抑制骨質疏松〔34〕。LncRNA-ZBTB40-IT1是ZBTB40內含子的選擇性剪接體，與ZBTB40的作用正好相反。Mei等〔21〕通過人骨肉瘤細胞系U2OS與人成骨細胞系hFOB1.19培養(yǎng)，實驗結果發(fā)現(xiàn)lncRNA-ZBTB40-IT1可調控WNT4通路，影響WNT4、Runt家族相關轉錄因子(RUNX)2、骨細胞特異性轉錄因子(OSX)、堿性磷酸酶(ALP)、Ⅰ型膠原α1基因(COL1A1)、OPG與RANKL等因子的表達，從而抑制成骨細胞分化并促進破骨細胞分化，促進骨質疏松的發(fā)生〔21〕。ZBTB40可抑制ZBTB40-IT1的表達，與lncRNA-ZBTB40-IT1的作用正相反。本研究發(fā)現(xiàn)，在人骨肉瘤細胞U2OS細胞系中，甲狀旁腺素可拮抗lncRNA-ZBTB40-IT1的作用并對ZBTB40無明顯影響。本研究還發(fā)現(xiàn)，單核苷酸多態(tài)性(SNP)srs34920465與rs6426749可分別通過招募轉錄因子UN：FOS與環(huán)磷酸腺苷應答元件結合蛋白(CREB)1的方式調控ZBTB40與ZBTB40-IT1的表達〔21〕。關于lncRNAZBTB40-IT1與lncRNA-ZBTB40在破骨細胞中的作用機制仍有待進一步研究。

4.2LncRNA-牛磺酸上調基因(TUG)1通過PTEN促進破骨細胞的增殖 LncRNA-TUG1在腫瘤及強直性脊柱炎中起重要作用，PTEN通路在破骨細胞凋亡中起重要作用〔35〕，研究發(fā)現(xiàn)lncRNA-TUG1可通過PTEN通路促進破骨細胞的增殖并抑制其凋亡〔22〕。Han等〔22〕研究發(fā)現(xiàn)，在骨質疏松患者的外周血中l(wèi)ncRNA-TUG1的水平明顯升高且與骨質疏松的嚴重程度有關。通過C57Bl/6J小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA-TUG1的上調可以促進破骨細胞的增殖并抑制凋亡，而其下調正好起相關的作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA-TUG1的上調伴隨著PTEN的下調，作者認為lncRNA-TUG1的促骨質疏松作用是通過PTEN實現(xiàn)的，具體機制有待進一步研究〔22〕。

4.3LncRNA-核富集轉錄體(NEAT)1促破骨細胞分化 NEAT1是一種主要定位在細胞核內的lncRNA，可參與旁斑的形成。洪宇桁等〔36〕及樊萍等〔37〕通過小鼠骨質疏松模型及RAW264.7細胞培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，lncRNA-NEAT1在骨質疏松及破骨分化過程中的表達顯著上調，而干擾lncRNA-NEAT1的表達可抑制破骨細胞活性。作者認為lncRNA-NEAT1可促進破骨細胞分化并阻滯成骨細胞分化，從而促進骨質疏松的發(fā)生，但其誘導破骨細胞分化的具體作用機制尚未明確，仍有待進一步研究〔36，37〕。

4.4LncRNA-DANCR通過鋸齒蛋白(Jagged)1及炎癥因子白細胞介素(IL)-6和腫瘤壞死因子(TNF)-α影響破骨細胞生成 從免疫角度上看，骨質疏松可被認為是一種由免疫介導的慢性炎癥性疾病。各種原因導致細胞因子的產(chǎn)生和免疫炎癥反應的激活，破骨細胞活性增強、骨轉換失調，從而導致骨吸收作用增強，產(chǎn)生骨質疏松〔34〕。外周血單核細胞是破骨細胞的前體，可直接參與破骨細胞的生成，還可分泌破骨細胞生成因子IL-6和TNF-α，而IL-6和TNF-α又可作為免疫因子，直接參與骨質疏松的調控〔38〕。LncRNA-DANCR是一種與多種惡性腫瘤有關的lncRNA，Tong等〔39〕研究發(fā)現(xiàn)，在絕經(jīng)后骨質疏松患者中，外周血單核細胞中l(wèi)ncRNA-DANCR的表達顯著提高且與IL-6和TNF-α的表達存在相關性，lncRNA-DANCR可通過炎性因子IL-6和TNF-α促進破骨細胞的生成〔9〕。

4.5LncRNA-結直腸腫瘤差異表達基因(CRNDE)通過PI3K/Akt信號通路促進破骨細胞增殖 LncRNA-CRNDE最初發(fā)現(xiàn)于結直腸癌中，在多種惡性腫瘤中都有表達〔40〕。Li等〔20〕應用人破骨細胞的研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA-CRNDE在絕經(jīng)后骨質疏松患者的破骨細胞中高表達，且高表達的lncRNA-CRNDE可通過PI3K/Akt信號通路促進破骨細胞增殖并抑制其凋亡。研究還發(fā)現(xiàn)，雌激素雖可拮抗這一作用，但在雌激素缺乏時本途徑依然存在。作者認為對于雌激素缺乏的絕經(jīng)后骨質疏松患者，lncRNA-CRNDE可能提供新的治療方法。

4.6LncRNA-腫瘤易感候選基因(CASC)11與絕經(jīng)后骨質疏松有關 LncRNA-CASC11是一種在多種腫瘤中起作用的lncRNA。Yu等〔41〕研究發(fā)現(xiàn)，在絕經(jīng)后骨質疏松患者血清中l(wèi)ncRNA-CASC11與TNF-α明顯升高，升高的lncRNA-CASC11及TNF-α對于絕經(jīng)后骨質疏松具有診斷意義，且隨訪還發(fā)現(xiàn)其升高與絕經(jīng)后骨質疏松的治療進程及復發(fā)情況有關。統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，絕經(jīng)后骨質疏松患者經(jīng)過治療后，血清lncRNA-CASC11與TNF-α水平都有明顯降低。該研究進一步通過人破骨細胞培養(yǎng)實驗發(fā)現(xiàn)，升高的lncRNA-CASC11與破骨細胞有關，CASC11過表達可導致TNF-α水平的升高，但其具體機制還有待進一步研究〔41〕。

4.7LncRNA-人肺腺癌轉移相關轉錄本1基因(MALAT1)通過miR-124促進破骨細胞分化加速骨修復 在骨損傷的情況下，骨質修復的過程需要破骨細胞的重吸收和內皮祖細胞(EPCs)刺激下的血管再生及骨生成。Cui等〔42〕通過小鼠骨折模型的研究發(fā)現(xiàn)，在骨質的修復過程中，lncRNA-MALAT1的水平明顯增高。LncRNA-MALAT1可直接與miR-124結合從而負性調節(jié)miR-124功能，上調β1整合素(ITGB1)水平，從而增強EPCs誘導的BMMs的遷移及破骨細胞分化，而miR-124的過表達則可反作用于該機制。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，這一作用是通過lncRNA-MALAT1/miR-124/ITGB1實現(xiàn)的〔42〕。

4.8LncRNA-AK131850通過miR-93-5p促進新生血管生成 Quan等〔43〕應用RAW264.7細胞進行血管再生的研究發(fā)現(xiàn)，在破骨細胞的形成過程中，lncRNA-AK131850在新生破骨細胞與成熟破骨細胞中可特異性結合并抑制miR-93-5p，使血管內皮細胞生長因子(VEGF)α分泌增加，進而促進EPCs向新生血管分化，當lncRNA-AK131850抑制時起相反作用。該研究雖然發(fā)現(xiàn)在新生破骨細胞與成熟破骨細胞中l(wèi)ncRNA-AK131850可特異性結合并抑制miR-93-5p，但對于破骨細胞分化及凋亡的影響還有待進一步研究。

綜上，目前已發(fā)現(xiàn)多種lncRNAs通過多條信號通路調節(jié)破骨細胞的分化及增殖等，從而影響了骨質疏松的過程。鑒于雙膦酸鹽類等針對破骨細胞的骨質疏松治療藥物的臨床效果及可能抑制骨重建而增加骨脆性的副作用〔44〕，探索及發(fā)現(xiàn)新的治療靶點是將來的研究熱點，期待將來發(fā)現(xiàn)針對于lncRNA的骨質疏松新治療靶點。