李志超李念虎薛海鵬陳仁場高 尚

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院,濟(jì)南 250014;2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,濟(jì)南 250014)

脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)通常會導(dǎo)致大范圍的感覺運(yùn)動神經(jīng)和自主神經(jīng)損傷。據(jù)美國SCI統(tǒng)計中心統(tǒng)計,僅美國每年新增病例約17000例,治療的年平均費(fèi)用高達(dá)676000美元,是世界范圍內(nèi)一個嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題[1]。SCI的病理過程包括最初的機(jī)械性損傷和隨后的繼發(fā)性損傷,繼發(fā)性損傷期會持續(xù)加重SCI程度,因此該階段也是SCI治療的關(guān)鍵時期?？紤]到神經(jīng)元細(xì)胞死亡作為此時期關(guān)鍵的病變機(jī)制,是造成神經(jīng)功能障礙的主要原因,而自噬性細(xì)胞死亡為神經(jīng)細(xì)胞死亡的主要方式之一,所以深入研究涉及細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)機(jī)制對開發(fā)新的有效治療方法至關(guān)重要[2]。信號通路即細(xì)胞信號的傳導(dǎo)途徑,在SCI病程中,多種因素可通過相關(guān)信號通路來影響自噬,而合理調(diào)節(jié)自噬被認(rèn)為會對受損神經(jīng)組織起到重要保護(hù)作用[3]?；诖?本文對自噬與SCI的聯(lián)系以及自噬相關(guān)信號通路調(diào)控自噬流干預(yù)SCI的作用機(jī)制進(jìn)行綜述,以期為SCI的治療尋找新的突破口。

1 細(xì)胞自噬在脊髓損傷中的作用

自噬是一個重要的細(xì)胞內(nèi)降解過程,自噬體將受損的細(xì)胞器、錯誤折疊的蛋白質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)的病原體包裹,與溶酶體融合形成自噬溶酶體,將包裹的內(nèi)容物降解回收并重新用于細(xì)胞能量和功能,這一動態(tài)循環(huán)過程被稱為自噬流,在維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。自噬標(biāo)志物微管相關(guān)蛋白Ⅰ輕鏈3(LC3)、beclin-1蛋白及p62蛋白反映了自噬流的水平。在自噬過程中,LC3從其胞質(zhì)形式 (LC3Ⅰ)轉(zhuǎn)化為LC3Ⅱ形式,參與自噬體膜的形成;beclin-1則被Unc-51樣自噬激活激酶-1(ULK1)磷酸化,作為磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)復(fù)合物的整體支架,促進(jìn)自噬蛋白定位到自噬泡;自噬適配器sequestosome-1(p62)作為自噬降解底物的受體,一同在自噬溶酶體內(nèi)降解。LC3Ⅱ、beclin-1水平升高及p62水平降低,表示自噬流被激活,相反則表示自噬流受阻[4]。在SCI發(fā)生后,由于受損的細(xì)胞器和蛋白在神經(jīng)元中不斷積累,因此許多學(xué)者認(rèn)為激活自噬將有利于SCI繼發(fā)性損傷期的恢復(fù)[5]。然而,自噬不僅參與細(xì)胞合成和降解之間的平衡,在部分研究中,激活的自噬不僅沒有起到細(xì)胞保護(hù)作用,反而可能因過度激活自噬導(dǎo)致過度自我消化從而造成細(xì)胞程序性死亡,即自噬性細(xì)胞死亡[6]。因此探究SCI后神經(jīng)細(xì)胞自噬機(jī)制,有效利用自噬規(guī)律,從而合理調(diào)節(jié)自噬流,將成為SCI研究的重點(diǎn)方向。目前,基于各種自噬相關(guān)信號通路的研究正在試圖闡述激活或抑制自噬對SCI恢復(fù)造成的影響,但結(jié)果往往存在爭議,可能與SCI的位置和程度、激活自噬的程度、急性還是慢性的操控、持續(xù)時間、是否只是單獨(dú)激活自噬等因素相關(guān)[7]。但不可否認(rèn)的是,通過某些自噬相關(guān)的信號通路調(diào)節(jié)自噬流,確可起到對損傷神經(jīng)的保護(hù)作用,改善損傷后的脊髓功能。

2 各信號通路在脊髓損傷自噬中的聯(lián)系

2.1 PI3K/Akt/mTOR信號通路

PI3K/Akt/mTOR信號通路被認(rèn)為是SCI中參與自噬的核心信號通路[8]。PI3K分為3種亞型,即Ⅰ～Ⅲ型。PI3K-Ⅰ型由調(diào)節(jié)亞基p85和催化亞基p110構(gòu)成二聚體,受各種生長因子和相關(guān)受體蛋白的配體所激活。PI3K催化磷脂酰肌醇二磷酸生成磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸(PIP3),PIP3與含有PH結(jié)構(gòu)域的蛋白Akt和PDK1結(jié)合,調(diào)節(jié)PDK1以激活A(yù)kt。活化的Akt則會進(jìn)一步激活下游的靶蛋白mTOR。mTOR由兩個不同核心蛋白質(zhì)復(fù)合物組成,即mTOR復(fù)合物1(mTORC1)和mTORC2,mTORC1能被磷酸化的Akt激活。mTORC1的激活將抑制細(xì)胞自噬,發(fā)揮負(fù)向調(diào)節(jié)自噬過程的作用。

目前,很多研究通過PI3K/Akt/mTOR信號通路雙向調(diào)節(jié)自噬,以達(dá)到減少SCI后體內(nèi)細(xì)胞凋亡并誘導(dǎo)運(yùn)動恢復(fù)的目的[9]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),在SCI后第7天應(yīng)用合適劑量褪黑素(MT)后,SCI大鼠神經(jīng)元中LC3Ⅱ、beclin-1表達(dá)明顯升高,p62表達(dá)明顯下降,p-PI3K、p-mTOR和p-Akt表達(dá)明顯降低,而神經(jīng)功能改善明顯,證明MT通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路,增強(qiáng)神經(jīng)元自噬并抑制細(xì)胞凋亡,進(jìn)而改善運(yùn)動功能障礙[10]。Wang等[11]研究發(fā)現(xiàn),在機(jī)械損傷的脊髓神經(jīng)元中自噬的發(fā)生要早于細(xì)胞凋亡,并且經(jīng)PI3K特異性抑制劑LY294002處理后,Akt和mTOR磷酸化水平降低,LC3Ⅱ表達(dá)升高,證明SCI后自噬水平與PI3K/Akt/mTOR信號通路活性呈負(fù)相關(guān),支持通過抑制該通路適度增加自噬從而發(fā)揮治療作用。也有研究通過激活該通路抑制過度自噬來促進(jìn)SCI的恢復(fù)。Zhang等[12]發(fā)現(xiàn)堿性成纖維細(xì)胞生長因子(BFGF)通過抑制過度自噬來保護(hù)運(yùn)動神經(jīng)元的存活并改善SCI的恢復(fù),其作用機(jī)制與BFGF通過激活PI3K/Akt/mTOR信號通路抑制過度自噬和增強(qiáng)泛素化蛋白清除有關(guān)。PI3K/Akt/mTOR信號通路介導(dǎo)了疾病發(fā)展,因此通過該通路合理調(diào)節(jié)自噬能明顯抑制神經(jīng)元凋亡,促進(jìn)細(xì)胞存活,從而有效保護(hù)神經(jīng)元,最終能應(yīng)用于疾病的治療。

2.2 MAPK/ERK1/2/mTOR信號通路

絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)是細(xì)胞內(nèi)的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,該通路包含了4條分支路線,即細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)、p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶5(ERK5)。其中,MAPK/ERK1/2/mTOR信號通路在SCI中與自噬的關(guān)系討論相對較多,其余分支路線研究較為匱乏。ERK由ERK1和ERK2組成,可被神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)營養(yǎng)因子等誘導(dǎo)致磷酸化而被激活,活化后的ERK1/2激活下游靶蛋白,參與調(diào)控細(xì)胞的自噬、凋亡、增殖、分化等重要的細(xì)胞過程。

MAPK信號通路在SCI的發(fā)展進(jìn)程中扮演著重要角色。據(jù)報道,在SCI發(fā)生后觀察到MAPK/ERK信號通路激活明顯增強(qiáng),而MAPK的特異性抑制劑PD98059減輕了SCI相關(guān)的炎癥和組織損傷的發(fā)展程度[13]。雖然近年來有關(guān)MAPK信號通路如何調(diào)控自噬一直受到人們的關(guān)注,但由于其參與調(diào)控SCI中自噬的機(jī)制極其復(fù)雜,所以目前的研究似乎還存在相互矛盾的情況。例如,Tang等[14]用雙過氧釩(bpV[pic])處理大鼠SCI模型中發(fā)現(xiàn)ERK1/2磷酸化水平升高,細(xì)胞自噬增強(qiáng),而在使用ERK1/2抑制劑SCH772984后,bpV(pic)引起的自噬增加被逆轉(zhuǎn),證明了bpV(pic)通過激活ERK1/2信號促進(jìn)自噬,抑制細(xì)胞凋亡,從而減少神經(jīng)元丟失。而Zhu等[15]在有關(guān)雷公藤甲素(TP)干預(yù)SCI的研究中發(fā)現(xiàn)ERK1/2的磷酸化水平降低,細(xì)胞自噬增強(qiáng),神經(jīng)元細(xì)胞死亡減少,表明TP通過抑制ERK1/2信號通路增強(qiáng)自噬發(fā)揮其在SCI中的保護(hù)作用。產(chǎn)生矛盾的研究不僅僅存在上述文獻(xiàn)中。SOX2是SOX基因家族的“創(chuàng)始成員”之一,可抑制MAPK通路的激活。Li等[16]發(fā)現(xiàn)在SCI大鼠中給予miR-103模擬物上調(diào)了SOX2的表達(dá),降低了p-ERK和p-MAPK的表達(dá),有趣的是,該研究同時表明miR-103過度表達(dá)降低了細(xì)胞自噬水平,起到了對SCI的保護(hù)作用?？梢钥闯?通過該通路抑制還是增強(qiáng)自噬對SCI起到保護(hù)作用存在疑惑,且近年來的研究也發(fā)現(xiàn)無論是激活還是抑制該通路均可誘導(dǎo)自噬的發(fā)生,但其具體機(jī)制不詳。因此,MAPK信號通路在SCI中誘導(dǎo)細(xì)胞自噬作用的精細(xì)分子機(jī)制,值得更深入的研究。

2.3 AMPK信號通路

腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)由α、β、γ 3種亞基構(gòu)成三聚體,其活性主要受細(xì)胞內(nèi)AMP/ATP的比值影響,當(dāng)機(jī)體處于能量匱乏狀態(tài)時,AMP/ATP比值升高激活肝激酶B1,磷酸化α亞基導(dǎo)致AMPK表達(dá)的上調(diào),AMPK的上調(diào)可通過兩種方式:磷酸化結(jié)節(jié)硬化復(fù)合物(TSC2)或直接通過Raptor,以抑制下游信號因子mTORC1的活性,從而參與自噬的調(diào)控[17]。并且,AMPK上游信號因子ULK1、p53和下游信號因子p27kip1也均能參與自噬的誘導(dǎo),這提示我們深入研究AMPK相關(guān)信號通路,有助于我們理解SCI中自噬的具體機(jī)制。

圍繞AMPK/mTOR通路,大量研究證明了其對SCI存在影響。研究顯示,在SCI后AMPK磷酸化顯著增強(qiáng),mTOR磷酸化明顯降低,表明AMPK/mTOR信號通路被激活[18]。SCI大鼠模型經(jīng)二甲雙胍治療后功能改善,LC3、beclin-1表達(dá)增加,同時檢測到AMPK的激活及其下游mTOR信號的抑制,提示AMPK信號通路參與了二甲雙胍調(diào)節(jié)自噬流的過程[19]。類似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也出現(xiàn)在鋅[20]、白藜蘆醇[21]等藥物的研究中。轉(zhuǎn)錄因子EB(TFEB)在以往的研究中被認(rèn)為是參與自噬調(diào)控的中樞因子,并參與調(diào)控溶酶體的合成[22]。TFEB會被各種細(xì)胞應(yīng)激所激活,觸發(fā)AMPK的磷酸化,伴隨AMPK/mTOR的激活,mTORC1的失活不再磷酸化TFEB[23],使TFEB的核轉(zhuǎn)位得以實(shí)現(xiàn)。神經(jīng)突起導(dǎo)向因子-1(netrin-1)因在胚胎及神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中發(fā)揮軸突導(dǎo)向功能而備受關(guān)注[24]。最新研究發(fā)現(xiàn)[25],netrin-1可通過AMPK/mTOR/TFEB通路調(diào)節(jié)大鼠SCI后TFEB的磷酸化狀態(tài),從而促進(jìn)溶酶體的生物發(fā)生,有利于自噬小體的降解,激活自噬流,達(dá)到抑制神經(jīng)元凋亡、促進(jìn)功能恢復(fù)的目的。樺木酸被證明同樣通過AMPK/mTOR/TFEB信號通路,增強(qiáng)了SCI中的自噬,增加的自噬又誘導(dǎo)線粒體自噬,減少ROS積累,抑制焦亡,有利于SCI的治療[26],這提示我們通過AMPK/mTOR/TFEB信號通路調(diào)控TFEB的核定位來調(diào)控溶酶體的發(fā)生發(fā)展可能是一種潛在的治療SCI的策略。

2.4 NF-κB信號通路

核因子κB(NF-κB)家族有5個成員,包括p50、p52、p65、Rel-B和c-Rel。NF-κB蛋白由p65和p50亞單位構(gòu)成二聚體,并與抑制蛋白IκB結(jié)合構(gòu)成三聚體復(fù)合物而處于失活狀態(tài)。IκB蛋白家族則包括IκBα、β、γ、ε、p100、p105等諸多成員。該通路的激活常見于典型途徑和替代性途徑:典型途徑由促炎細(xì)胞因子等觸發(fā),而替代性途徑由IKKa誘導(dǎo)p100磷酸化,導(dǎo)致Rel-B/p52異二聚體激活,這些途徑的特點(diǎn)是對IKK亞單位的不同需求,IKK復(fù)合物由兩個激酶亞基(IKKα和IKKβ)和一個調(diào)節(jié)亞基(IKKγ)組成。當(dāng)刺激因素激活NF-κB后,磷酸化IKKβ亞基,IκB被置換出來并受到蛋白酶體降解,從而活化NF-κB并使其易位進(jìn)入細(xì)胞核,進(jìn)而參與調(diào)整細(xì)胞的炎癥、自噬、凋亡等功能。

在有關(guān)SCI的研究中,基于NF-κB通路探討自噬的研究尚少,主要是通過與其他通路串?dāng)_誘導(dǎo)炎癥等反應(yīng)來探討與自噬的相互作用機(jī)制。炎癥反應(yīng)貫穿于SCI的整個發(fā)生發(fā)展過程,通過抑制NFκB通路可減輕炎癥反應(yīng)并改善功能恢復(fù)[27]。值得注意的是,NF-κB與自噬之間也存在著廣泛的聯(lián)系和復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制[28]。這種調(diào)控機(jī)制通常不是單純的促進(jìn)或者抑制,而是表現(xiàn)為雙向調(diào)節(jié):NF-κB能夠誘導(dǎo)自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)來促進(jìn)自噬的發(fā)生;而自噬又能夠下調(diào)IKK復(fù)合體,抑制NF-κB通路[29]。SCI最初(數(shù)小時內(nèi))的炎癥反應(yīng)會加重中樞神經(jīng)系統(tǒng)后期的損傷,而快速誘導(dǎo)自噬可能有助于維持局部微環(huán)境穩(wěn)態(tài)和減輕神經(jīng)元損傷。Guo等[30]建立小鼠脊髓半切模型后注射粒細(xì)胞集落刺激因子(GCSF),發(fā)現(xiàn)SCI后自噬被激活,且G-CSF處理組自噬的激活更為迅速,并對NF-κB信號通路產(chǎn)生抑制,認(rèn)為G-CSF在SCI后的及時使用可通過抑制NF-κB信號通路促進(jìn)自噬,保護(hù)SCI后的神經(jīng)元結(jié)構(gòu)。另有研究指出[31],ω-3游離脂肪酸通過增強(qiáng)自噬降解炎性復(fù)合物從而減輕炎癥,也可抑制NF-κB活化來阻止炎癥啟動,提示NF-κB、自噬與炎癥之間存在著潛在的相互聯(lián)系。然而,在其他很多疾病環(huán)境下,NF-κB信號通路對自噬起激活作用[32],也可以起失活作用[33],其介導(dǎo)自噬對機(jī)體本身可以是保護(hù)機(jī)制[34],也可加重疾病的發(fā)展[35]。提示NF-κB通路的作用機(jī)制仍然存疑,這種差異可能來自于不同的刺激環(huán)境、細(xì)胞類型和細(xì)胞狀態(tài)。但毫無疑問的是,在SCI中,自噬與炎癥存在廣泛的交互調(diào)控機(jī)制,而NF-κB信號通路可認(rèn)為是構(gòu)成“脊髓損傷-自噬-炎癥”鏈條的關(guān)鍵通路,值得進(jìn)一步深入研究。

2.5 其他自噬相關(guān)通路

2.5.1 p53信號通路

p53作為自噬調(diào)節(jié)過程中的關(guān)鍵分子,根據(jù)其細(xì)胞定位的不同在自噬調(diào)節(jié)中發(fā)揮雙重作用。細(xì)胞核內(nèi)的p53促進(jìn)細(xì)胞自噬,而胞漿中的p53發(fā)揮著抑制細(xì)胞自噬的作用[36]。細(xì)胞核中的p53通常通過三方面促進(jìn)自噬,一是p53通過激活損傷相關(guān)自噬調(diào)節(jié)因子(DRAM)、死亡相關(guān)蛋白激酶(DAPK-1)等自噬基因,二是解除mTOR對自噬的抑制作用,三是誘導(dǎo)凋亡調(diào)節(jié)因子(TIGAR)表達(dá)并抑制ROS的產(chǎn)生來激活自噬[37]。而細(xì)胞質(zhì)中的p53則通過抑制AMPK活性或激活mTOR來抑制自噬的發(fā)生[38]。大量研究也表明P53信號通路在SCI后發(fā)揮著重要的調(diào)控作用,可參與調(diào)節(jié)軸突生長和可塑性、膠質(zhì)和纖維化瘢痕形成,以及影響運(yùn)動功能恢復(fù)的小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞增殖[39]。進(jìn)一步將p53信號通路與SCI中自噬的調(diào)節(jié)聯(lián)系起來,充分發(fā)揮不同階段p53信號通路對細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)作用進(jìn)而治療SCI是十分有必要的。

2.5.2 Keap1/Nrf2/ARE信號通路

核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2),受Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1(Keap1)的調(diào)控,通過與抗氧化反應(yīng)元件(ARE)結(jié)合,在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮著抗氧化和抗炎的重要作用。研究表明SCI后激活的Nrf2/ARE信號通路可以減少炎性反應(yīng)并促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)[40]。在正常情況下,Keap1將Nrf2收集在細(xì)胞質(zhì)內(nèi),嚴(yán)重SCI后自噬流的阻斷導(dǎo)致自噬相關(guān)底物p62的蓄積,過多的p62通過將Nrf2和Keap1置換出來與Keap1結(jié)合[41],被置換出的Nrf2進(jìn)入細(xì)胞核中激活多種抗氧化基因和NF-κB等的轉(zhuǎn)錄,抑制氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達(dá)[42],減少損傷后的炎性反應(yīng),改善SCI后運(yùn)動神經(jīng)元的恢復(fù)[43]。抑炎、抗氧化應(yīng)激、促自噬等作用表明該通路是治療SCI的有效潛在靶點(diǎn)。

2.5.3 BDNF/TrkB信號通路

腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)與酪氨酸激酶受體B(TrKB)結(jié)合,通過激活下游多個信號通路參與神經(jīng)可塑性、細(xì)胞存活、軸突生長等多種重要的細(xì)胞生命活動[44]。并且,BDNF在調(diào)節(jié)SCI自噬中具有關(guān)鍵作用,可通過促進(jìn)自噬來維持神經(jīng)元存活[45],并且可通過影響PI3K/Akt等自噬相關(guān)信號通路來調(diào)整自噬,對SCI提供保護(hù)性功能[46]。合理調(diào)控BDNF/TrkB信號通路從而發(fā)揮自噬的保護(hù)性功能,對SCI的治療將有積極作用。

此外,還有部分通路如HIF-1信號通路[47]、Wnt信號通路[48]、Notch信號通路[49]、JAK/STAT信號通路[50]等,最新的研究表明通過影響這些信號通路調(diào)節(jié)自噬,均對SCI的治療產(chǎn)生了有益作用。當(dāng)然,這些通路的研究目前仍處于起步階段,但治療潛力毋庸置疑,值得深入研究。

3 結(jié)論與展望

自噬水平的調(diào)整在治療SCI中的重要性是毋庸置疑的,自噬流的變化在某種程度上也反映了SCI的病理變化。并且,SCI中自噬在不同損傷程度、刺激因素、時間模式等影響下是具有保護(hù)性還是損害性仍有待明確,但似乎越來越多的證據(jù)表明,自噬在SCI中的作用主要是有益的。在信號通路調(diào)節(jié)自噬的研究過程中,不可避免的出現(xiàn)了許多問題:(1)由于不同信號通路存在交聯(lián),不同的刺激因素對同一條信號通路也會產(chǎn)生不同的結(jié)果,如何選擇性的調(diào)整某條信號通路對自噬造成影響十分困難;(2)適度的自噬是維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的必要條件,因此如何通過信號通路啟動自噬、調(diào)整信號通路使得自噬水平處于適度的區(qū)間,需要深入研究;(3)許多藥物可以激活信號通路來對自噬產(chǎn)生影響,但不同藥物、相同藥物不同劑量、藥物的不同使用時間造成的結(jié)果存在差異,這與SCI中自噬的動態(tài)變化有關(guān),所以明確研究藥物與模型的動態(tài)匹配關(guān)系十分重要?？傊?目前有關(guān)SCI的治療尚無徹底解決之道,但無論自噬還是相關(guān)信號通路在SCI中的作用機(jī)制研究已經(jīng)成為一種熱潮。深入理解“SCI-信號通路-自噬”的鏈條關(guān)系,通過特異性調(diào)節(jié)相關(guān)信號通路,從而維持自噬流的通暢和合適水平,進(jìn)而對SCI發(fā)揮保護(hù)性功能,將為我們治療SCI提供新的有效靶點(diǎn)。