◎ 楊家鋒，鄭 丹，汪 杰，梁芹芹，蔣 海

（寧波市海洋與漁業(yè)研究院，浙江 寧波 315010)

慶大霉素在畜牧業(yè)及漁業(yè)養(yǎng)殖中應(yīng)用廣泛，但同時(shí)也帶來(lái)了藥物殘留問(wèn)題。慶大霉素及其殘留對(duì)人、畜均有明顯的毒副作用，長(zhǎng)期攝入能誘發(fā)急性腎功能衰竭、中毒性耳聾、失語(yǔ)、癱瘓和休克等[2]。

慶大霉素的理化測(cè)定方法相當(dāng)復(fù)雜，且靈敏度和通用性較差。因此應(yīng)從多方面綜合考慮慶大霉素的殘留測(cè)定方法，本方法的主要改進(jìn)措施有以下幾方面。①檢測(cè)過(guò)程盡量避免使用玻璃器具，可采用聚丙烯塑料管，進(jìn)樣瓶亦采用塑料材質(zhì)襯管等。②提取液為磷酸鹽緩沖加三氯乙酸，添加三氯乙酸既可有效去除蛋白質(zhì)又能提高藥物的回收率。③采用MCX混合陽(yáng)離子交換柱凈化濃縮提取液。④使用C18分離柱，流動(dòng)相中加入五氟丙酸離子對(duì)試劑，有利于改善峰型和提高分離效果。⑤使用三重四極桿質(zhì)譜配備電噴霧離子源，采用ESI+和MRM模式，提高檢測(cè)選擇性和靈敏度，克服了僅以保留時(shí)間作為定性依據(jù)的缺陷。

1 材料與方法

1.1 試劑

甲醇，乙腈：色譜純，美國(guó)西格瑪公司；七氟丁酸，五氟丙酸，三氟乙酸：色譜純，美國(guó)ACROS公司；磷酸氫二鈉：分析純，國(guó)產(chǎn)；0.01 mol·L-1磷酸鹽緩沖溶液：稱取1.36 g磷酸二氫鉀，量取30 mL三氯乙酸，用水溶解并定容至1 000 mL；磷酸二氫鉀：分析純，國(guó)產(chǎn)；氫氧化鈉：分析純，國(guó)產(chǎn)；1.0 mol·L-1氫氧化鈉溶液：稱取20.0 g氫氧化鈉，用水溶解并定容至500 mL；0.02 mol·L-1磷酸鹽溶液：稱取3.58 g十二水合磷酸氫二鈉，用水溶解并定容至500 mL，調(diào)整pH=7.0；氨水甲醇溶液：氨水+甲醇=10+90，v/v；1.0‰五氟丙酸溶液：稱取1.0 mL五氟丙酸，用水溶解并定容至1 000 mL；慶大霉素：純度≥98%， CAS No. 1405-41-0，Dr. Ehrenstorfer，美國(guó)；標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：1.0 mg·mL-1，稱取10.0 mg慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品，用水溶解并定容至10 mL，-18 ℃冷凍保存于塑料管中；標(biāo)準(zhǔn)使用液：準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用水稀釋配成 1 000 ng·mL-1溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配；超純水：符合分析實(shí)驗(yàn)室一級(jí)用水規(guī)格。

1.2 儀器設(shè)備

高效液湘色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，waters2695-QUTTRO MICRO，美國(guó)；分析天平，Sartorius BP310S，德國(guó)；均質(zhì)器，F(xiàn)LUKO，上海；氮吹儀，HGC-24A；旋渦混合器，MS2 Minishaker，廣州；離心機(jī)，DL-8M，上海離心機(jī)研究所；真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，BüCHI R215瑞士；MCX陽(yáng)離子固相交換柱，Waters，美國(guó)；固相萃取裝置：HENGAO T＆D，HL-02D，巴西；移液槍：上海雷勃；超純水儀：美國(guó)Millipour公司。

1.3 樣品處理

1.3.1 制樣

取水產(chǎn)品可食部分，切成不大于0.5 cm×0.5 cm× 0.5 cm的小塊，充分勻漿，儲(chǔ)存于塑料瓶中，密封冷凍（-18 ℃）保藏，備用。

墻夼水庫(kù)總庫(kù)容 3.28億 m3，興利庫(kù)容0.85億 m3，死庫(kù)容 0.11億 m3，正常蓄水位98.50m。水庫(kù)工程防洪標(biāo)準(zhǔn)按百年一遇設(shè)計(jì)，萬(wàn)年一遇校核。東、西庫(kù)設(shè)計(jì)洪水位分別為103.02m、103.16m，校核洪水位分別為106.50 m、106.57m。東西兩庫(kù)共設(shè)東庫(kù)溢洪閘1座，遭遇大洪水時(shí)，西庫(kù)水位高于東庫(kù)，洪水通過(guò)連通溝進(jìn)入東庫(kù)，由東庫(kù)溢洪道泄出。

1.3.2 提取

稱取樣品（5.0±0.01）g置于50 mL離心管中，加入15 mL磷酸鹽緩沖溶液，振蕩10 min，設(shè)置 4 000 r·min-1轉(zhuǎn)速，離心15 min，上清液過(guò)濾后收集。殘?jiān)儆?5 mL磷酸鹽緩沖溶液重復(fù)提取1次， 4 000 r·min-1離心15 min后合并上清液濾液，用氫氧化鈉溶液調(diào)pH值為7.0～7.2，4 000 r·min-1離心 5 min后上清液過(guò)固相萃取柱。

1.3.3 凈化

MCX柱預(yù)處理：將MCX柱安裝到固相萃取裝置上，過(guò)提取液前先依次用5 mL甲醇，3 mL水，5 mL磷酸鹽緩沖溶液活化。提取液緩慢過(guò)已活化的MCX柱，再依次用2 mL磷酸鹽緩沖溶液和5 mL水洗雜質(zhì)，待柱子干后以3 mL氨水甲醇溶液洗脫，收集洗脫液，氮?dú)獯蹈?。精確量取1.0 mL流動(dòng)相溶解殘留物，過(guò) 0.22 μm濾膜，待測(cè)。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液

吸取適量標(biāo)準(zhǔn)使用溶液（1.000 μg·mL-1）用水配制成序列濃度為10.0～1 000.0 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

設(shè)定優(yōu)化后儀器條件，將標(biāo)準(zhǔn)工作液上機(jī)測(cè)定，以慶大霉素各組分測(cè)得結(jié)果的峰面積或峰高為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)工作液的濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6 儀器條件

1.6.1 色譜條件

色譜柱：C18，100 mm × 2.1 mm，5 μm（i.d.），或其他性能相當(dāng)?shù)纳V柱；柱溫：室溫；進(jìn)樣量： 30 μL；流動(dòng)相：0.1%五氟丙酸酸溶液+乙腈=70+30。

1.6.2 質(zhì)譜條件

離子化模式：大氣壓電噴霧離子源，ESI+；毛細(xì)管電壓：2.9 kV；錐孔電壓：25 V；脫溶劑氣流速：450 L·h-1；錐孔氣流速：50 L·h-1；離子傳輸毛細(xì)管溫度：350 ℃；離子源溫度：110 ℃；碰撞氣壓力：氬氣， 2.5 mTorr；掃描模式：多離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM），選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)母離子、碎片離子和碰撞能量見(jiàn)表1。

表1 選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)母離子、碎片離子和碰撞能量表

1.7 結(jié)果計(jì)算

樣品中慶大霉素殘留量按式（1）計(jì)算，計(jì)算結(jié)果需扣除空白值。

式中：Xi為樣品中慶大霉素C組分的含量，μg·kg-1；Ci為樣品制備液中慶大霉素各組分的濃度，ng·mL-1；V為最終定容體積，mL；m為樣品質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 慶大霉素C組分的質(zhì)譜特征

用水配制1 000 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液用蠕動(dòng)泵進(jìn)樣方式直接導(dǎo)入ESI源，首先采用一級(jí)全掃描質(zhì)譜方式，獲得待測(cè)物的準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+，然后對(duì)準(zhǔn)分子離子峰及其碎片離子，采用Daughter scan質(zhì)譜模式進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，以獲取相應(yīng)的多級(jí)質(zhì)譜信息。

本實(shí)驗(yàn)中的慶大霉素（圖1）由3個(gè)環(huán)組成，A環(huán)和C環(huán)為取代的氨基葡萄糖，B環(huán)為取代的脫氧鏈霉胺（中心單元）[3]。慶大霉素的結(jié)構(gòu)中含有多個(gè)堿性中心，其裂解機(jī)制是由正電荷引發(fā)的i過(guò)程，失去的都是中性分子碎片，見(jiàn)圖2，表2。

圖1 慶大霉素分子結(jié)構(gòu)圖

圖2 慶大霉素碎片離子裂解圖

表2 慶大霉素碎片離子裂解表

在一級(jí)全掃描質(zhì)譜條件下，分別獲得4種結(jié)構(gòu)相似的準(zhǔn)分子離子峰m/z450，m/z464和m/z478（慶大霉素4種組分）（圖3）。為進(jìn)一步了解該類抗生素的質(zhì)譜斷裂規(guī)律，分別對(duì)各準(zhǔn)分子離子峰進(jìn)行多級(jí)質(zhì)譜分析，獲得相應(yīng)的碎片離子（圖4、圖5、圖6）。

圖3 慶大霉素母離子質(zhì)譜圖

圖4 慶大霉素C1a子離子質(zhì)譜圖

圖5 慶大霉素C2+C2a子離子質(zhì)譜圖

圖6 慶大霉素C1子離子質(zhì)譜圖

在二級(jí)質(zhì)譜分析中，慶大霉素C組分由4種（C1，C1a和C2+C2a）組成，對(duì)應(yīng)3個(gè)準(zhǔn)分子離子峰，分別選擇m/z478，m/z450和m/z464進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，均形成同樣的碎片離子m/z322，進(jìn)一步證明本實(shí)驗(yàn)中的慶大霉素在二級(jí)質(zhì)譜分析中首先脫去C環(huán)。加大碰撞能進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，m/z322可生成m/z160（脫去B環(huán)）、m/z163（脫去A環(huán)）和m/z205等碎片離子。m/z160可進(jìn)一步脫水分別生成m/z142碎片離子。m/z205推測(cè)是A環(huán)斷開(kāi)，然后脫水形成的碎片離子。

2.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

1 μg·mL-1的慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液以蠕動(dòng)泵方式進(jìn) 樣，流速為20 μL·min-1，在ESI+模式下進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜圖掃描，以4種組分的[MH]+（C1，C1a和C2+C2a組成對(duì)應(yīng)3個(gè)準(zhǔn)分子離子峰分別為m/z478，m/z450和m/z464）峰靈敏度為依據(jù)，優(yōu)化質(zhì)譜調(diào)諧文件包括毛細(xì)管電壓、離子源溫度、錐孔電壓、脫溶劑氣等參數(shù)，見(jiàn)1.6.2。分別以m/z450，m/z478和m/z464作為母離子，對(duì)其子離子進(jìn)行掃描，選取豐度最強(qiáng)的子離子m/z450＞322，m/z478＞322和m/z464＞322為 定量離子，次強(qiáng)的子離子m/z450＞160，m/z478＞157和m/z464＞160作為定性離子；以子離子強(qiáng)度為依據(jù)優(yōu)化碰撞能量等的質(zhì)譜條件見(jiàn)表1。

2.3 色譜條件的選擇

本實(shí)驗(yàn)以三氟乙酸、五氟丙酸、七氟丁酸為離子對(duì)試劑進(jìn)行試驗(yàn)，濃度設(shè)0.5‰、1.0‰、1.5‰3個(gè)水平，以乙腈與離子對(duì)試劑溶液多組比例為流動(dòng)相進(jìn)行比較實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，用1.0‰五氟丙酸與乙腈比例為70∶30時(shí)，色譜峰的峰型、分離度和靈敏度都到達(dá)最優(yōu)狀態(tài)，保留時(shí)間為2.91 min，標(biāo)準(zhǔn)溶液5 ng·mL-1時(shí)，定量子離子峰的信噪比大于15。隨著流動(dòng)相中乙腈的濃度減少，目標(biāo)物質(zhì)保留時(shí)間延長(zhǎng)。當(dāng)乙腈含量為20%，保留時(shí)間為4.57 min，但靈敏度降低。以七氟丁酸為離子對(duì)試劑對(duì)慶大霉素的分離和提高色譜柱的保留有不錯(cuò)的表現(xiàn)，在乙腈含量為20%，保留時(shí)間為7.21 min，但靈敏度比使用五氟丙酸時(shí)低。以三氟乙酸為離子對(duì)試劑，慶大霉素的色譜峰峰寬較大且有明顯峰拖尾。因此，選取1.0‰五氟丙酸+乙腈=70+30為流動(dòng)相。

流動(dòng)相中五氟丙酸濃度分別為0.5‰、1.0‰時(shí)，對(duì)保留時(shí)間及分離度的影響不大。流動(dòng)相pH值在2.5～3.5內(nèi)，容量因子改變不大，但pH值小于2.5或pH值大于4.0時(shí)，流動(dòng)相容量因子急劇降低。在pH值為2.5～3.5時(shí)，五氟丙酸帶負(fù)電荷，而慶大霉素各組分分子帶正電荷，兩者形成離子對(duì)化合物，在反相色譜柱上被保留。1.0‰五氟丙酸的pH值在2.5～3.0，因此一般無(wú)需調(diào)節(jié)pH值。但當(dāng)流動(dòng)相pH值偏小時(shí)，慶大霉素各組分會(huì)出現(xiàn)雙峰現(xiàn)象。

在流動(dòng)相為1.0‰五氟丙酸+乙腈=70+30時(shí)，比較了waters的Atlantis、Sunfire、Xterra、Symmetry以及資生堂的MGⅢ、CAPCELL-Pak混合柱等色譜柱對(duì)慶大霉素的出峰效果。結(jié)果表明，Atlantis C18的出峰效果最佳。

2.4 樣品處理?xiàng)l件優(yōu)化

2.4.1 提取溶劑的確定

本方法以乙腈、二氯甲烷和乙酸乙酯有機(jī)溶劑以及磷酸鹽（KH2PO4）、高氯酸、三氯乙酸、三氟乙酸、氫氧化鈉作為提取溶劑進(jìn)行回收率試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果表明用乙腈、二氯甲烷和乙酸乙酯有機(jī)溶劑提取試樣中慶大霉素藥物時(shí)，回收率很低，而且用乙酸乙酯提取時(shí)甚至沒(méi)有回收到目標(biāo)物，該結(jié)果與慶大霉素的溶解性有關(guān)。氫氧化鈉溶液雖然能較好地提取試樣中慶大霉素，但在提取組織試樣時(shí)易形成乳膠狀態(tài)，不利于后續(xù)步驟的進(jìn)行。2%～5%三氯乙酸或高氯酸既可有效脫蛋白質(zhì)，也可以溶解慶大霉素提高回收率。三氟乙酸脫蛋白效果稍劣于三氯乙酸。因此，通過(guò)多組實(shí)驗(yàn)比較后決定用磷酸鹽和三氯乙酸的混合溶液提取組織中慶大霉素，回收率高達(dá)89%～103%。DAVID等[4]采用30%的三氯乙酸提取血漿和尿中的慶大霉素，回收率為92%～107%，與本文結(jié)果較一致。

2.4.2 試樣的凈化

由于試樣中慶大霉素的提取劑為磷酸鹽和三氯乙酸的混合溶液，試樣提取液不易用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的方式濃縮，固相萃取選擇吸附便是一種理想的濃縮凈化方法。本試驗(yàn)以HLB、C18、MCX、SAX、WAX、PRS柱為凈化固相萃取柱，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明C18、MCX、SCX對(duì)慶大霉素都有較好的保留，其中又以MCX結(jié)果最優(yōu)，過(guò)柱回收率達(dá)97%以上，因此確定以MCX為本方法凈化固相萃取柱。過(guò)柱洗脫液為甲醇氨水溶液，在洗脫過(guò)程中第1 mL可將柱中95.5%的慶大霉素洗下，第2 mL又能洗下3.5%，因此確定洗脫液為3 mL。洗脫液氮吹至近干，準(zhǔn)確量取1.0 mL流動(dòng)相定容。ELIANGIRINGA等[5]使用CBA弱離子交換柱除去蛋白質(zhì)后測(cè)定血清中的慶大霉素，回收率為78%～93%。

3 方法評(píng)價(jià)

3.1 回收率和精密度

以陰性大黃魚(yú)、南美白對(duì)蝦、梭子蟹為檢測(cè)試樣，每份5.00 g（稱準(zhǔn)至0.01 g），分別添加慶大霉素，添加水平為分別為5 μg·kg-1、20 μg·kg-1、100 μg·kg-1。檢測(cè)結(jié)果表明，方法平均回收率在71.9%～101.0%，批內(nèi)、批間變異系數(shù)均小于15%。本方法中認(rèn)定的回收率為70%～110%。

3.2 線性關(guān)系和線性范圍

配制慶大霉素藥物標(biāo)準(zhǔn)的工作曲線濃度系列為 5 μg·L-1、10 μg·L-1、20 μg·L-1、50 μg·L-1、100 μg·L-1、200 μg·L-1、500 μg·L-1和800 μg·L-1，用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析，慶大霉素4種成分在5～800 μg·L-1具有很好的線性。慶大霉素4種成分標(biāo)準(zhǔn)溶液工作曲線見(jiàn)圖7、圖8、圖9，線性方程及定量限見(jiàn)表3。

表3 慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液工作曲線及方法檢出限表

圖7 慶大霉素C2+C2a標(biāo)準(zhǔn)溶液工作曲線圖

圖8 慶大霉素C1標(biāo)準(zhǔn)溶液工作曲線圖

圖9 慶大霉素C1a標(biāo)準(zhǔn)溶液工作曲線圖

3.3 檢出限

對(duì)陰性大黃魚(yú)、南美白對(duì)蝦和梭子蟹分別以 5 μg·kg-1加標(biāo)量進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果表明回收率都在71.9%以上，信噪比大于15。因此將5 μg·kg-1作為最小檢出濃度。

4 結(jié)論

本文構(gòu)建了一種液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法檢測(cè)水產(chǎn)品中慶大霉素C組分殘留量的方法，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，慶大霉素4種C組分在0.005～0.800 μg·mL-1，線性相關(guān)系數(shù)良好，相關(guān)系數(shù)r＞0.999 8；以5 μg·kg-1、20 μg·kg-1、100 μg·kg-13濃度水平進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，回收率在71.9%～101.0%，RSD＜15%；當(dāng)加標(biāo)量為5 μg·kg-1時(shí)4種C組分均具有明顯的響應(yīng)峰，信噪比≥15。該方法適用于水產(chǎn)品中慶大霉素C組分殘留量的測(cè)定。