胚胎滯育研究進展

陳昊天，張 魯

（中國農(nóng)業(yè)大學 動物科學技術學院，北京 100193）

胚胎的正常發(fā)育是動物體生長過程的關鍵，要經(jīng)歷受精、卵裂、孵化、形態(tài)轉變、附植及器官分化等多項重要的生理過程［1］。然而當環(huán)境中存在不利于胚胎發(fā)育的因素時，胚胎會出現(xiàn)發(fā)育終止、發(fā)育畸形乃至胚胎死亡的現(xiàn)象。為適應復雜多樣的環(huán)境，胚胎進化出了多種發(fā)育模式，胚胎滯育便是其中之一。

1 胚胎滯育的發(fā)現(xiàn)

胚胎滯育（embryonic diapause）又稱延遲著床，是指囊胚期的細胞增殖過程受到抑制而導致的動物胚胎發(fā)育暫時停滯的可逆生理現(xiàn)象［2］。早在1651年，人們觀察狍子交配與分娩之間的妊娠期，發(fā)現(xiàn)部分個體妊娠期遠長于預期，但該名詞在1980年才被首次定義［3］。在此后30余年的研究中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)胚胎滯育現(xiàn)象廣泛存在于嚙齒目、食肉目及有袋目中，在偶蹄目、翼手目中也陸續(xù)有報道［4］。

胚胎滯育現(xiàn)象是將受精與分娩兩個重要的繁殖過程進行分離，從而保證后代出生于最有利的環(huán)境條件，以提高新生幼崽存活率的一種重要動物繁殖進化策略［5］。通常情況下，胚胎在植入子宮前自行發(fā)育，到達胚泡階段時其固有代謝減弱，因此胚胎需要受到適當?shù)拇碳げ拍軌蜻M一步發(fā)育；當環(huán)境或母體條件不適宜時，胚胎于早期囊胚停止發(fā)育，進入滯育階段［6］。

胚胎滯育可分為發(fā)生、維持和再激活三個過程，滯育的發(fā)生往往與光周期、哺乳及母體的營養(yǎng)狀況密切相關，而滯育的維持則存在著較大的物種乃至個體差異［7］。例如：小鼠胚胎滯育的維持時間一般在1～7 d；而對于大鼠，當哺育幼崽數(shù)量少于4個時滯育的平均維持時間僅有2 d，隨著其哺育幼崽數(shù)量的增加滯育維持時間呈延長的趨勢［8］。

2 胚胎滯育的分類

2.1 兼性胚胎滯育

兼性胚胎滯育（facultative embryonic diapause）是一種與代謝性壓力相關的胚胎發(fā)育停止現(xiàn)象，只有當應激條件解除后胚胎才開始著床，主要發(fā)生于哺乳期與發(fā)情期重疊的物種，嚙齒動物是研究兼性滯育的常用模式動物［4，9］。通常情況下，小鼠在交配后的第3天受精卵分裂成桑椹胚，移動至輸卵管峽部，在第5天胚胎轉移至子宮后胚泡伸長變形，附著于子宮內(nèi)膜上［10］。該過程受妊娠母鼠體內(nèi)黃體酮水平的影響，母鼠分娩后立即進入新的發(fā)情周期，此時若存在哺乳現(xiàn)象或運輸?shù)葔毫?，會導致黃體酮水平下降，進而子宮內(nèi)的胚胎進入滯育階段，表現(xiàn)出發(fā)育遲緩、無法著床等現(xiàn)象，這時胚胎停留在子宮腔閉合的子宮窩內(nèi)，逐漸從溶解的透明帶中顯現(xiàn)出來，細胞增殖至130個左右時停止分裂并均勻分布于胚泡中［5，10-12］。研究發(fā)現(xiàn)，應激條件解除后伴隨著胚胎滯育過程的終止，小鼠子宮內(nèi)蛋白質的合成和分泌量均大幅提高、子宮蛻膜化過程啟動，這是誘導雌激素脈沖和胚胎成功著床的重要因素［9，13］。

2.2 專性胚胎滯育

專性胚胎滯育（obligate embryonic diapause）也稱專性滯育或強制性滯育，廣泛發(fā)生于臭鼬、獾和水貂等物種［14］。對于這些動物，胚胎在每個繁殖季節(jié)都會進入休眠狀態(tài)，只有當環(huán)境條件適合分娩時專性滯育結束、恢復妊娠，進而保證雌性個體在繁殖周期中的各種繁殖活動均在1年中最有利的時間進行［15］。專性滯育主要受到光照周期季節(jié)性變化的影響，當光照少于12 h時褪黑素分泌量增加，催乳素（prolactin，PRL）的分泌受到抑制，進而誘導胚胎進入滯育階段；而在春分后光周期的增加可能通過誘導松果體減少褪黑素的分泌，提高垂體分泌催乳素水平，最終使胚胎重新被激活［6，16-18］。此外，對處在滯育階段的水貂胚胎施加外源性催乳素，可以誘導胚胎終止滯育和植入著床［19-20］。作為廣泛研究專性滯育的模式動物水貂，其胚胎在滯育期間分布于子宮角中并被卵母細胞的透明帶所包裹，細胞數(shù)量在200～500個范圍之間均有報道［5，20］。此時受低水平催乳素的影響，黃體分泌黃體酮的功能受到抑制，胚胎滯育過程得到維持；而當水貂滯育終止后，在高水平催乳素信號刺激下黃體細胞恢復有絲分裂能力，黃體體積及黃體酮水平快速提升，進一步促進囊胚的再激活過程［4，7，9］。

3 胚胎滯育的調控機制

3.1 環(huán)境對胚胎滯育的調控作用

環(huán)境作為一種重要的復雜調節(jié)因素，在胚胎的植入過程發(fā)揮關鍵作用，其中光周期對于誘導滯育終止及胚胎植入著床過程發(fā)揮重要作用［9］。研究發(fā)現(xiàn)褪黑素和催乳素參與光周期誘導的專性滯育過程：光照通過視網(wǎng)膜被動物感知后，經(jīng)過視交叉上核晝夜節(jié)律產(chǎn)生系統(tǒng)的夾帶過程，抑制松果體分泌褪黑素，而褪黑素卻可以干擾垂體催乳素的分泌以維持胚胎的滯育過程［21-22］。以水貂為例，在短光照周期下，褪黑素水平升高而催乳素濃度下降，胚胎滯育維持；光照周期增長后，水貂松果體活動受到抑制，褪黑素水平下降，催乳素水平上升，滯育終止［2，18，21］。高水平的催乳素可以誘導催乳素受體，促進促黃體素受體基因的表達，其中促黃體素可能通過誘導黃體的激活、提高黃體酮水平來誘導滯育的終止、促進胚胎的植入［23-24］。而在母體哺乳的刺激下，盡管催乳素水平提高，但雌激素的分泌受到抑制，胚胎也會進入滯育階段（見圖1）。

圖1 光周期和哺乳對胚胎滯育過程的調控Fig.1 Embryonic diapause regulated by photoperiod and lactation

環(huán)境溫度對于胚胎發(fā)育過程也具有重要的調控作用，研究發(fā)現(xiàn)：當環(huán)境溫度比體溫低3～5℃時會誘發(fā)妊娠的雌性蜥蜴出現(xiàn)胚胎滯育現(xiàn)象［26］；而果蠅暴露于高溫環(huán)境時容易造成胚胎滯育的終止［27］。另一方面也有試驗證實，高溫會誘導嚙齒動物兼性滯育的發(fā)生，低溫會延長某些肉食性動物滯育的維持時間［2］。家禽早期胚胎處于高溫條件下可以加速對蛋黃及蛋白中營養(yǎng)物質的吸收，促進發(fā)育；但在人胚胎及卵母細胞上的研究表明，高溫可能影響卵母細胞紡錘體形態(tài)、抑制胚胎的發(fā)育和著床過程；而低溫條件則會降低牛胚胎的新陳代謝活性甚至在更極端的溫度下導致RNA損傷［28-31］。這些研究表明，胚胎滯育可能是動物為適應環(huán)境而進化出的關鍵生存策略，但溫度條件影響胚胎滯育的具體機制仍需探索。

3.2 激素調控胚胎滯育的作用

目前研究發(fā)現(xiàn)，催乳素和性腺類固醇激素對于胚胎滯育具有重要調控作用。催乳素是一種由垂體后葉釋放的多肽類激素，具有促進乳腺生長、發(fā)育，啟動、維持泌乳的功能［32］。在妊娠過程中，催乳素通過維持黃體和生長因子水平，為胚泡著床提供適宜的微環(huán)境，調控胚胎的著床與發(fā)育過程［33］。在專性滯育動物中，垂體后葉催乳素的釋放受到光周期的調控，催乳素可能通過參與調控體內(nèi)鳥氨酸向氨基化合物的轉化，干預胚胎發(fā)育的可逆停止及滋養(yǎng)層和內(nèi)細胞團增殖的停滯過程［34］。在兼性滯育的動物中，催乳素直接作用于黃體，使其處于靜止狀態(tài)，進而維持胚胎滯育［35］。對于產(chǎn)后發(fā)情交配的小鼠，哺乳行為會導致母體內(nèi)循環(huán)催乳素水平的增加，阻止妊娠3.5天時雌激素（estradiol，E2）水平升高，進而誘發(fā)胚胎滯育［36］。此外在妊娠小鼠雌激素水平提升前切除卵巢，可以誘導囊胚表現(xiàn)出滯育的特征，外源補充的雌激素具有激活囊胚、促進胚胎植入的功效［37］。因此，催乳素可能通過介導雌激素水平來干預妊娠期動物胚胎的活性和植入過程，進而調控滯育的發(fā)生。

類固醇激素參與動物的繁殖行為，其中雌激素、黃體酮（progesterone，P4）在胚胎的發(fā)育和植入等過程中發(fā)揮關鍵作用。雌激素具有調控子宮對胚胎容受性的功能，向切除卵巢的胚胎滯育模型小鼠注射外源雌激素可以誘導囊胚激活及植入的發(fā)生［38-39］。黃體酮在黑斑海豹和灰海豹胚胎滯育期間保持較高水平，并且隨著滯育的結束黃體酮水平也呈下降趨勢［40］。子宮對胚胎的接受性是影響胚胎滯育的關鍵因素，黃體酮和雌激素可以協(xié)同作用于小鼠子宮，改變胚胎著床的窗口期，進而調控胚胎滯育過程：黃體酮通過下調黏蛋白-1（MUC1）、降鈣素，上調心臟和神經(jīng)嵴衍生物表達轉錄本2（Hand2）去除子宮抗黏附屏障，為胚胎提供著床位點，同時抑制小鼠子宮腔上皮細胞增殖，并使上皮組織結構分離，有利于胚胎的侵入，提高子宮對胚胎的接受性［4，41］。胚胎黏連后，子宮基質細胞立即發(fā)生蛻膜化，并在著床部位分泌雌激素，在IGR1和IGFBP3信號轉導作用下胚胎著床的窗口期關閉，小鼠子宮轉變?yōu)榉墙邮軤顟B(tài)，保證植入胚胎的繼續(xù)發(fā)育［42］。但有研究者認為，卵巢類固醇激素在狍子胚胎滯育再激活過程中可能并不起決定性作用［43］。此外睪酮作為一種調節(jié)卵巢功能的必需激素，在胚胎滯育期間通常保持較高的水平，并在滯育再激活過程中發(fā)揮重要作用［44］。

另外，褪黑素是一種受光周期調控、由松果體分泌的胺類激素，對于胚胎發(fā)育同樣具有重要的調控作用。在水貂的研究中發(fā)現(xiàn)，褪黑素可以通過抑制垂體催乳素的分泌進而調控胚胎的發(fā)育［45］。

3.3 子宮環(huán)境對胚胎滯育的調控作用

胚胎植入過程是激活態(tài)胚胎與容受性子宮相互協(xié)調的結果，適宜的子宮環(huán)境對于胚胎的植入過程至關重要，子宮分泌物也是調控胚胎發(fā)育的另一關鍵因素［7，46］。研究表明，將處于滯育狀態(tài)的水貂胚胎移植至正常雪貂子宮內(nèi)，可以誘導休眠狀態(tài)的胚胎被重新激活；而將正常山羊胚胎移植至處于滯育狀態(tài)下的小鼠子宮后，胚胎隨即進入休眠狀態(tài)，表明在動物子宮內(nèi)存在誘導和維持胚胎滯育的關鍵因素［7，47-48］。雖然目前在母體子宮內(nèi)篩選出的白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）和多胺水平被證實對子宮環(huán)境、胚胎的發(fā)育和植入過程具有重要的調控作用，但子宮與胚胎滯育誘導和維持相關性等方面的具體機制仍未建立［49-50］，在未來揭示其中作用機制需要借助更多分子生物學手段。

3.4 micro RNAs對胚胎滯育的調控過程

microRNA（miRNA）是一類廣泛存在于動植物體內(nèi)、大小為21～25個核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA，能靶向作用于信使RNA（mRNA）抑制其翻譯過程，對生物體轉錄后的基因表達調控起關鍵作用。目前發(fā)現(xiàn)多種miRNA在動物胚胎滯育及重新激活的過程（見圖2）中發(fā)揮重要作用。

圖2 miRNAs調控胚胎滯育過程Fig.2 miRNAs regulate embryonic diapause network

研究發(fā)現(xiàn)，在胚胎滯育的模型小鼠中篩選的45個miRNA存在差異表達，其中多數(shù)（38／45）miRNA在滯育胚胎中的表達水平顯著提高，尤其是Let-7家族的5位成員［51］；與此同時mTOR和Myc信號轉導途徑在小鼠胚胎滯育過程中發(fā)揮關鍵的作用，其中mTOR的抑制對轉錄、翻譯和代謝的組合作用可能是決定胚胎滯育的重要因素，而Myc活性的降低是決定植入前的胚胎能否進入滯育狀態(tài)的關鍵［52-53］。有研究證實，Let-7家族可以通過抑制Myc、mTORC1和mTORC2信號通路，誘導胚胎滯育的發(fā)生［54］。此外Trim71作為Let-7的另一標靶，可以抑制細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑Cdkn1a的表達，調節(jié)胚胎干細胞由G1期向S期過渡，對于胚胎發(fā)育和干細胞增殖具有重要影響［55］。miR-429在小鼠胚胎植入過程中通過反向調節(jié)鈣黏蛋白家族的Pcdh8水平，抑制上皮-間充質轉變過程，進而抑制細胞的轉移和侵襲功能，減少胚胎植入的數(shù)量［56］。 在大鼠上的研究發(fā)現(xiàn)，miR-140通過靶向子宮內(nèi)胰島素樣生長因子1受體（IGF1R）抑制下游效應因子整合素β3和黏附斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）的表達，實現(xiàn)對胚胎植入過程的抑制，誘導胚胎滯育的發(fā)生［57］。miR-98可以通過靶向抗凋亡因子bcl-xl，誘導細胞色素c的釋放，促進細胞凋亡；miR-98水平下調具有防止子宮細胞過度死亡的效果，使子宮容易接受胚胎，有利于胚胎的正常著床［58］。在胚胎滯育模型中miR-320水平顯著上調，通過外源雌激素使胚胎恢復植入過程后miR-320水平降低，推斷miR-320可能在胚胎著床過程中發(fā)揮重要的功能［59-60］。在胚胎滯育的激活過程中miR-143的表達顯著上調，miR-143可能與白血病抑制因子受體（LIFR）3′UTR區(qū)域結合，抑制其翻譯過程，因此子宮內(nèi)的miR-143可能通過調控LIFR水平進而影響胚胎植入過程［61］。

4 胚胎滯育與細胞周期

胚胎是由受精卵經(jīng)過細胞分裂和分化過程而形成，胚胎滯育發(fā)生的主要原因是胚胎細胞的增殖受到抑制、細胞周期停滯、細胞進入休眠狀態(tài)。與此同時，細胞控制合成代謝和氧氣的消耗水平，維持蛋白質水平及基礎代謝，從而防止細胞凋亡的發(fā)生［6］。在試驗中發(fā)現(xiàn)，多數(shù)哺乳動物及昆蟲在細胞周期的S期之前是胚胎滯育高發(fā)時期，其中袋鼠囊胚的生長通常在細胞周期的G0階段受到抑制［9，62］。

在昆蟲細胞周期調控胚胎滯育過程的研究中發(fā)現(xiàn)，存在于細胞核內(nèi)的DNA聚合酶輔助蛋白——增殖細胞抗原是保證DNA復制的必需因素，其表達水平在胚胎滯育期間顯著降低，但在功能上增殖細胞抗原可能并不能作為滯育過程的決定因素［63-64］。此外也有研究發(fā)現(xiàn)，細胞周期蛋白依賴激酶（CDK1）和微小染色體維持5（MCM5）在滯育期間的表達具有顯著的差異性［64］。CDK1是一種驅動細胞周期并調節(jié)細胞分裂、分化過程的重要物質，由其所介導的線粒體活性和ATP合成是保證細胞周期由G2到M期過渡的必要條件［65-66］。CDK1在G1后期由于磷酸化水平的降低其活性提升，而滯育胚胎中CDK1磷酸化水平顯著提升。表明在胚胎滯育期間該蛋白活性下調，誘導細胞周期的停滯可能是引發(fā)胚胎滯育的關鍵因素［64］。MCM5作為細胞周期的另一種關鍵調節(jié)物質的亞基，在DNA復制的過程中通過被ORC募集而打開DNA雙鏈、啟動DNA復制過程，MCM5功能的缺失同樣會導致細胞周期出現(xiàn)停滯［67-68］。在果蠅滯育胚胎中MCM5水平顯著下調，由此推測MCM5可能作為調控細胞周期的另一重要因素影響胚胎滯育的過程［64］。

5 胚胎滯育的分子機制

目前研究發(fā)現(xiàn)，在胚胎發(fā)育、滯育及滯育激活的過程中，存在大量轉錄因子、亞細胞結構及環(huán)境脅迫因子介導的基因表達及代謝途徑改變，進而發(fā)揮重要的調控功能［6］。轉錄因子是指參與細胞轉錄起始過程的多種蛋白協(xié)助因子，目前已被證實參與人、豬和小鼠等多種動物早期胚胎發(fā)育的調控過程［69-71］。其中同源盒基因Msx作為Homebox基因家族成員，被廣泛用于胚胎發(fā)育過程［72］。在哺乳動物上的研究中發(fā)現(xiàn)，Msx1和Msx2是啟動和維持胚胎滯育不可或缺的因素，其表達量在滯育期間持續(xù)處于較高水平，隨著胚胎滯育的激活及植入過程的發(fā)生其表達量迅速下調，但在子宮Msx1和Msx2失活的小鼠、水貂和袋鼠中，胚胎滯育及再激活過程均無法實現(xiàn)［73］。Msx蛋白作為一種發(fā)育過程的轉錄抑制因子，主要通過靶向Wnt5a調控胚胎滯育過程；另一方面，Msx蛋白能夠限制子宮的炎癥反應，也是維持胚胎滯育的關鍵因素［74］。另外的研究表明，在子宮腺中另一轉錄因子FOXA2水平的下調是誘導子宮靜止、從而支持胚胎發(fā)生滯育的關鍵因素，在FOXA2缺失的子宮中可能通過保持Msx蛋白處于高水平以維持靜止狀態(tài)，但FOXA2和Msx的復雜關系至今仍未得到闡述［49］。

白血病抑制因子（LIF）也是囊胚植入的重要信號，在臭鼬中LIF水平的升高與胚胎滯育現(xiàn)象之間存在顯著的正相關［75］。LIF可能作為終止專性胚胎滯育的信號，在水貂胚胎植入前LIF的mRNA通常維持較高水平，而胚胎滯育階段或植入后則不表達［76］。此外，F(xiàn)OXA2可能作為上游的調控因子干預LIF對滯育胚胎的調控過程，但至今也缺少相關試驗證實［49］。Myc作為一種癌基因，當表達受到抑制后會通過調控轉錄、剪接及蛋白質合成過程使胚胎細胞的增殖潛力減弱，但多能性仍保持不變，在視網(wǎng)膜母細胞瘤家族蛋白（retinoblastoma protein，RB）存在時，胚胎可進入滯育階段［77-78］。

小鼠在饑餓條件下誘導的LKB1-AMPK途徑對mTOR的抑制被證明是胚胎進入滯育狀態(tài)的必需條件，而滯育狀態(tài)的終止則需要依賴mTOR的谷氨酰胺轉運體SLC38A1的啟動，因此mTOR途徑的關鍵因子被認為是胚胎進入和退出滯育狀態(tài)的門戶［79］。mTOR活性受到谷氨酰胺水平的影響，谷氨酰胺可以通過誘導mTORC1易位并轉移至溶酶體而降低mTOR水平，進而保證胚胎維持在滯育狀態(tài)［79-80］。

此外，脂質液滴（lipid droplets，LDS）在小鼠胚胎早期發(fā)育、植入以及維持滯育等過程也發(fā)揮關鍵作用，去除滯育胚胎中的脂滴后胚胎無法存活；隨著滯育狀態(tài)的進展，胚泡中碳水化合物代謝向脂肪分解代謝轉化，由脂肪分解或自噬產(chǎn)生的脂肪酸可能通過β氧化作為胚胎的主要能量來源，因此脂滴水平也通常呈現(xiàn)下降趨勢［81-83］。

6 展望

隨著現(xiàn)代分子生物學技術的發(fā)展，對胚胎滯育機制的認知愈發(fā)清晰。對于動物胚胎發(fā)育、附植、停滯及再激活等生理過程的研究也篩選出很多關聯(lián)基因，但胚胎滯育的內(nèi)在復雜分子機制并未得到清晰的詮釋。并且有關胚胎滯育的試驗研究也主要集中于小鼠、大鼠及水貂等實驗動物上，對于家禽家畜、經(jīng)濟動物及伴侶動物的相關研究較少。此外，目前胚胎滯育研究主要處于基礎知識的積累階段，在未來的應用方向也仍未明確。胚胎滯育作為一種動物對環(huán)境適應的繁殖現(xiàn)象，也可能為其他領域的研究提供一條新的思路：（1）由于胚胎滯育過程是一種可逆的現(xiàn)象，胚胎再激活后仍具有很高的活性，并且在小鼠、大鼠、水貂等動物中可實現(xiàn)人為的誘導控制，在未來該技術可能成為一種新型的胚胎保存方法，以降低冷凍保存所導致的機械、化學損傷。（2）胚胎的激活、植入等過程與癌癥的發(fā)生發(fā)展、侵襲存在較高的相似性，并且目前研究篩選到的調控胚胎滯育過程的基因也具有調控細胞周期的功能，因此誘導癌癥進入類似胚胎滯育的狀態(tài)可能是癌癥治療領域的一個思路。（3）目前對于胚胎滯育誘導的完整機制仍不清晰，相關激素濃度的變化能否通過級聯(lián)反應影響miRNA水平、調控靶基因的表達，進而干預子宮條件、細胞周期以及胚胎滯育等過程，仍需研究和探索。