慢性胰腺炎易感基因及致病機(jī)制研究新進(jìn)展

姜春暉 王奇雯 鄒文斌

上海市胰腺疾病研究所，海軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，上海 200433

【提要】 CP是一種多因素、多基因參與的慢性進(jìn)行性炎癥性疾病。隨著人類基因組技術(shù)的不斷發(fā)展，新的CP易感基因相繼被發(fā)現(xiàn)，相應(yīng)的致病機(jī)制如胰蛋白酶(原)依賴通路、蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊、細(xì)胞凋亡或壞死、自噬障礙、鈣離子信號(hào)通路異常和腸道微生態(tài)失調(diào)等被認(rèn)為參與CP的發(fā)生和發(fā)展。本文系統(tǒng)闡述近年來新發(fā)現(xiàn)的CP易感基因及其致病機(jī)制，以加深對(duì)遺傳因素在CP致病作用中的認(rèn)識(shí)。

CP是一種與遺傳因素密切相關(guān)的慢性進(jìn)行性炎癥性疾病，臨床表現(xiàn)為腹痛、胰腺內(nèi)外分泌功能不全(糖尿病、脂肪瀉)等，病理特征主要是胰腺纖維化、鈣化、萎縮、胰管不規(guī)則擴(kuò)張、假性囊腫等。經(jīng)典的CP致病基因包括陽離子胰蛋白酶原(serine protease 1,PRSS1)、絲氨酸蛋白酶抑制劑Kazal 1型(serine peptidase inhibitor Kazal type 1,SPINK1)、胰凝乳蛋白酶C(chymotrypsin C,CTRC)和囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)因子(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator,CFTR)[1]。雖然酒精、吸煙等環(huán)境因素和上述已知的基因突變等遺傳因素被證實(shí)是CP的重要危險(xiǎn)因素，但僅能解釋不到50%的CP患者發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。本文就近年來新發(fā)現(xiàn)的CP易感基因及其致病機(jī)制做系統(tǒng)闡述，以加深對(duì)CP發(fā)生機(jī)制的認(rèn)識(shí)。。

一、CP易感基因

隨著高通量基因測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用發(fā)展，通過靶向測(cè)序、全基因組測(cè)序(whole-genome sequence, WGS)和全外顯子測(cè)序(whole-exome sequence, WES)等方法定位CP易感基因位點(diǎn)，可以明確遺傳因素與疾病的關(guān)聯(lián)。全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome-wide association studies, GWAS)利用單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)標(biāo)記信息和表型信息分析，定位與疾病相關(guān)的基因突變。WES對(duì)基因組所有外顯子捕獲富集后進(jìn)行高通量測(cè)序。近年來，運(yùn)用以上技術(shù)定位了幾種與CP相關(guān)的易感新基因位點(diǎn)。

1．緊密通道蛋白2(claudin-2,CLDN2)和染色質(zhì)重塑蛋白MORC家族CW型鋅指結(jié)構(gòu)蛋白4(microrchidia family CW-type zinc finger 4,MORC4)：2012年，美國一項(xiàng)GWAS研究首次發(fā)表了與CP關(guān)聯(lián)度最高的SNP位于Xq23.3，即CLND2基因座[2]。CLDN2基因編碼claudin-2蛋白，該蛋白作為一種高度可調(diào)控的緊密通道蛋白，在內(nèi)皮細(xì)胞間形成孔道，并具有陽離子通透性，通常以低水平在胰管和胰島細(xì)胞的緊密連接中表達(dá)。CLDN2基因座包含的其他基因有MORC4、RIPPLY1和TBC1D8B。研究進(jìn)一步顯示，與復(fù)發(fā)性急性胰腺炎相比，CLDN2-MORC4基因座 rs12688220的變異與CP相關(guān)性更強(qiáng)，且與酒精性慢性胰腺炎(alcoholic chronic pancreatitis, ACP)顯著相關(guān)。隨后，德國、日本、印度等研究相繼論證了MORC4rs12688220與ACP顯著關(guān)聯(lián)，RIPPLY1rs7057398與女性的非酒精性慢性胰腺炎(non-alcoholic chronic pancreatitis, NACP)相關(guān)，無地域種族差異[3-5]。2020年，Deng和Li[6]的薈萃分析結(jié)果顯示，rs12688220和rs10273639 的基因多態(tài)性可用于識(shí)別亞洲人群中易感CP的個(gè)體。筆者所在課題組通過低深度全基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn)，rs12688220和rs10273639均可增加CP患病風(fēng)險(xiǎn)，其中飲酒可通過劑量依賴關(guān)系顯著增加rs10273639的致病風(fēng)險(xiǎn)[7]。

2．胰脂肪酶(pancreatic lipase,PNLIP)：2014年，Behar等[8]對(duì)常染色體隱性遺傳的先天性PNLIP缺乏癥進(jìn)行譜系研究，首次報(bào)道了PNLIPp.T221M的純合子錯(cuò)義突變是引起胰腺外分泌功能障礙表型的原因。2019年，Lasher等[9]發(fā)現(xiàn)PNLIP錯(cuò)義突變?cè)?個(gè)獨(dú)立的歐洲NACP患者隊(duì)列中更為顯著，其中最常見的突變體為p.F300L(rs890551695)。功能實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)5個(gè)PNLIP突變體對(duì)蛋白水解敏感，表現(xiàn)為被胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的加速降解，且與早發(fā)型CP密切相關(guān)。但在非歐洲(日本、美國、印度)NACP患者中未檢測(cè)到對(duì)蛋白酶敏感的PNLIP突變。PNLIP增加了CP易感風(fēng)險(xiǎn)，但也由于其對(duì)蛋白水解敏感，減輕了疾病的嚴(yán)重程度，具體致病機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。

3．ABO糖基轉(zhuǎn)移酶A/B和巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶2(fucosyltransferase 2,FUT2)：一項(xiàng)基于人群的研究發(fā)現(xiàn)，血清脂肪酶活性閾值的升高(≥3.17 μmol/sl)與腎功能損害、高齡或各種調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的藥物相關(guān)[10]。而這些因素都提示可能與亞臨床胰腺損傷或胰腺顯性疾病相關(guān)[11]。2014年Weiss等[12]展開GWAS和復(fù)制研究，確定了ABO基因座(rs8176693)、FUT2基因座(rs632111)與無癥狀受試者的血清脂肪酶活性表型顯著相關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，次要等位基因ABOrs8176693_T是決定血型B的ABO單倍型；FUT2基因座與分泌狀態(tài)的關(guān)聯(lián)分析顯示，rs632111_G與FUT2蛋白的非分泌狀態(tài)相關(guān)。FUT2蛋白分泌與非分泌狀態(tài)決定了個(gè)體將ABO血型抗原分泌到體液中的能力[13]。繼而對(duì)1 042例胰腺炎患者行相關(guān)性分析得出，與血清脂肪酶活性增加相關(guān)的非分泌狀態(tài)FUT2(OR=1.53)和ABO血型中的B型血(OR=1.69)是CP患者的風(fēng)險(xiǎn)因素[12]。

4．胰凝乳蛋白酶原B1和B2(chymotrypsinogen B1 and B2,CTRB1-CTRB2)：CTRB1-CTRB2基因突變對(duì)CP致病影響存在種族差異性。2017年，歐洲一項(xiàng)納入1 959例ACP和1 650例NACP患者的GWAS研究顯示，CTRB1-CTRB2基因位點(diǎn)存在16.6 kb片段的倒置重組，導(dǎo)致mRNA轉(zhuǎn)錄水平上CTRB1/CTRB2亞型表達(dá)比升高和胰蛋白酶降解減少，以連鎖不平衡方式增加了ACP和NACP風(fēng)險(xiǎn)，CTRB1片段1號(hào)內(nèi)含子SNP rs8055167(OR=1.35)與ACP明顯相關(guān)[14]。然而，筆者所在的課題組通過納入一項(xiàng)1 036例ICP患者的研究，結(jié)果顯示倒置重組的CTRB1-CTRB2、rs8048956和 rs8055167突變?cè)谥袊巳褐幸虻任换蚬潭ìF(xiàn)象而與ICP發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無顯著相關(guān)[15]。最近，德國一項(xiàng)對(duì)337例CP的CTRB1-CTRB2基因型研究顯示，存在CTRB1p.W5L、CTRB2的5′非翻譯區(qū)c.-4C>T和p.A247T的錯(cuò)義突變，但未發(fā)現(xiàn)與CP發(fā)病顯著相關(guān)[16]。

5．瞬時(shí)受體電位陽離子通道亞家族V6 (transient receptor potential vanilloid subfamily member 6,TRPV6)：TRPV6基因編碼選擇性鈣離子通道蛋白。2016年意大利一項(xiàng)靶向測(cè)序研究首次報(bào)道了在ICP患者中存在TRPV6基因錯(cuò)義突變位點(diǎn)[17]。2020年一項(xiàng)多中心WES和靶向測(cè)序研究顯示，日本及歐洲(法國、德國)NACP患者存在多個(gè)TRPV6功能缺失型突變位點(diǎn)(p.R174X, p.A606T, p.L608R, p.L609F)，日本患者p.D324N和歐洲患者p.L299Q突變可導(dǎo)致無Mg2+胞內(nèi)灌注下TRPV6通道電壓依賴性阻斷，使膜通道功能障礙而誘發(fā)CP[18]。筆者所在課題組通過對(duì)669例CP患者進(jìn)行測(cè)序及功能研究發(fā)現(xiàn)，TRPV6功能缺失型突變與CP顯著相關(guān)，在25個(gè)突變位點(diǎn)中的4個(gè)功能缺失型突變位點(diǎn)(p.L172P、p.A473T、p.Y507*和p.E575K)可導(dǎo)致TRPV6蛋白質(zhì)翻譯顯著下降[19]。此外，最新的一項(xiàng)研究也表明，在兩個(gè)獨(dú)立的歐洲隊(duì)列中TRPV6功能缺失變異與CP風(fēng)險(xiǎn)升高相關(guān)[20]。

二、遺傳致病機(jī)制

CP易感基因突變和重組引起基因轉(zhuǎn)錄和翻譯產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和功能異常，通過遺傳致病機(jī)制包括胰蛋白酶(原)相關(guān)通路、蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊、細(xì)胞凋亡或壞死、自噬障礙、鈣離子信號(hào)通路異常和腸道微生態(tài)失調(diào)等，促進(jìn)疾病的發(fā)生和發(fā)展。

1．胰蛋白酶(原)相關(guān)通路 ：近年來對(duì)CP易感基因突變的研究主要集中在引起活性胰蛋白酶水平升高致組織損傷的胰蛋白酶(原)相關(guān)通路上，如PRSS1、CTRC、SPINK1等位點(diǎn)突變導(dǎo)致胰蛋白酶(原)異常激活、胰蛋白酶降解障礙或抑制酶活性降低。PRSS1p.N29I/T和p.R122H促進(jìn)胰蛋白酶原自我激活，p.N29I/T、p.V39A、p.R122C/H抑制CTRC介導(dǎo)的胰蛋白酶原降解，p.A16V和p.N29I促進(jìn)依賴CTRC的胰蛋白酶原激活肽N端加工所致的胰蛋白酶原自激活[21]。PRSS2基因編碼陰離子胰蛋白酶原，p.G191R產(chǎn)生新的剪切位點(diǎn)Arg191-Gly192致激活后快速降解，使胰蛋白酶活性喪失，在CP中起保護(hù)作用[22]。筆者所在課題組基于PubMed搜索的含法國、中國等人群中PRSS1和PRSS2基因的拷貝數(shù)或SNP位點(diǎn)，以及基因動(dòng)物模型分析，發(fā)現(xiàn)增加胰蛋白酶的表達(dá)量可顯著增加CP風(fēng)險(xiǎn)與疾病嚴(yán)重程度，這為未來研發(fā)干預(yù)藥物提供了理論基礎(chǔ)[23]。CTRCp.G217R/S、p.K247_R254del和p.R254W易被胰蛋白酶降解[24]。功能缺失型SPINK1突變使抑制胰蛋白酶自激活的保護(hù)機(jī)制喪失。筆者所在課題組通過體外構(gòu)建全長(zhǎng)SPINK1基因質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)SPINK1c.194+2T>C改變3號(hào)內(nèi)含子5′剪切位點(diǎn)，從而導(dǎo)致外顯子跳躍，使SPINK1mRNA表達(dá)顯著降低[25]；c.-108G>T、c-142T>C和c.-147A>G顯著降低啟動(dòng)子活性，增加疾病風(fēng)險(xiǎn)；與c.194+2T>C關(guān)聯(lián)的c.-215G>A位點(diǎn)突變可增加啟動(dòng)子活性，補(bǔ)償并降低轉(zhuǎn)錄區(qū)突變的有害影響[26]。CFTRp.M470V與關(guān)聯(lián)突變位點(diǎn)p.Q1352H或p.L1156F能顯著減少CFTR表達(dá)和降低Cl-/HCO3-轉(zhuǎn)運(yùn)活性，使導(dǎo)管內(nèi)堿性胰液分泌減少，易致蛋白沉積和pH降低，進(jìn)而促進(jìn)胰酶激活，其具體機(jī)制仍需深入研究[27]。

2．蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路：基因突變導(dǎo)致翻譯的蛋白質(zhì)未折疊或錯(cuò)誤折疊，并在細(xì)胞內(nèi)蓄積，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和蛋白質(zhì)毒效應(yīng)(酶分泌減少及活性下降)。CELp.C563fsX673使編碼的蛋白形成異常二硫鍵，在胞內(nèi)以不可溶形式聚集，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、NF-κB通路激活和細(xì)胞凋亡標(biāo)志物PARP降解產(chǎn)物增加[28]。CEL-HYB1及其雙位點(diǎn)錯(cuò)義突變(Thr488-Ile548)均可引起胞內(nèi)不溶性蛋白聚集和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[29]。筆者所在課題組通過構(gòu)建人源性CEL-HYB1基因雜合變異小鼠，發(fā)現(xiàn)該變異隨著小鼠年齡的增長(zhǎng)，可自發(fā)局部胰腺病變，增加雨蛙素誘導(dǎo)的胰腺炎嚴(yán)重程度，并伴隨蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，晚期出現(xiàn)自噬障礙[30]。 Hegyi和Sahin-Tóth[31]構(gòu)建的CPA1N256K突變小鼠模型可使蛋白錯(cuò)誤折疊和蓄積，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，且導(dǎo)致腺泡細(xì)胞空泡化增加、巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)、組織纖維化等CP特征性病理改變。

3．自噬障礙：自噬對(duì)維持胰腺腺泡細(xì)胞的生理功能及穩(wěn)態(tài)起重要作用。Fjeld等[32]研究顯示，CEL-HYB1可致分泌障礙、異常蛋白胞內(nèi)聚集，而微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅱ(microtubule associated protein 1 light chain 3-Ⅱ, LC3-Ⅱ)升高提示存在自噬功能障礙。研究顯示自噬相關(guān)蛋白5基因(autophagy related 5, ATG5)缺乏引起p62蓄積，激活Nrf2/Nqo1/p53信號(hào)通路致胰腺組織壞死、炎癥反應(yīng)和纖維化[33]。Mareninova等[34]發(fā)現(xiàn)敲除溶酶體相關(guān)膜蛋白-2( lysosomal associated membrane protein-2, LAMP-2)基因的小鼠出現(xiàn)自發(fā)CP病理改變，組織中自噬溶酶體蓄積、腺泡細(xì)胞空泡化與增加的LC3-Ⅱ和p62/SQSTM1相關(guān)的自噬流缺陷有關(guān)。Li等[35]發(fā)現(xiàn)剔除IκB激酶α亞基(IκB kinase α, IKKα)基因的Pdx1-Cre，IkkαF/F雜交小鼠出現(xiàn)自發(fā)CP病理改變，與IKKα缺乏引起自噬障礙、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、氧化應(yīng)激和p62蓄積有關(guān)。

4．鈣離子信號(hào)通路異常：胞內(nèi)鈣超載可導(dǎo)致酶原異常激活、線粒體損傷、自噬異常和細(xì)胞壞死，在胰腺炎發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。TRPV6功能缺失型突變可使TRPV6蛋白表達(dá)減少，細(xì)胞內(nèi)鈣離子運(yùn)輸顯著受損[18-19]。研究顯示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子感受器基質(zhì)相互作用分子1(stromal interaction molecule-1,STIM1)基因突變與CP顯著相關(guān)。功能獲得型STIM1p.E152K位點(diǎn)突變使STIM1-肌漿內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣泵構(gòu)象改變，鈣泵活性增加，促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子釋放，增加胞內(nèi)胰蛋白酶原的激活和減少酶原分泌[36]。Piezo1是胰腺腺泡細(xì)胞中的非選擇性機(jī)械敏感性陽離子通道，調(diào)控鈣離子內(nèi)流，胰管內(nèi)高壓刺激和Piezo1激活劑可誘導(dǎo)胰腺炎。胰管內(nèi)機(jī)械性刺激活化Piezo1通道蛋白，觸發(fā)TRPV4通道開放，引起持續(xù)性鈣內(nèi)流，敲除TRPV4基因可顯著緩解Piezo1激活劑及胰管內(nèi)高壓誘導(dǎo)的胰腺炎[37]。

5．腸道微生態(tài)失調(diào)：宿主基因型影響腸道微生物群，參與疾病表型的調(diào)節(jié)。Wang等[38]研究基因突變對(duì)CP患者腸道的影響，結(jié)果顯示CFTR突變的患者丁酸梭菌屬顯著減少，CASR、CTSB、SPINK1和(或)PRSS突變的患者瘤胃球菌屬顯著增加，功能分析顯示腸道菌群磷酸轉(zhuǎn)移酶豐富，而核糖體活性、淀粉和蔗糖代謝、氨基酰tRNA生物合成等缺乏。為研究腸道病毒在胰腺炎中的作用，Li等[39]對(duì)清除腸內(nèi)常駐病毒的胰腺炎小鼠分析顯示，腸道病毒的清除可抑制腸道和胰腺組織Toll樣受體9(toll-like receptor 9, TLR9)mRNA和蛋白表達(dá)，減少炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和組織損傷。

三、展望

上述研究分析了新發(fā)現(xiàn)的CP易感新基因突變及CP致病機(jī)制，然而仍存在以下局限性：首先，部分基因突變并未引起明顯的功能異常，是否存在因其他位點(diǎn)變異如啟動(dòng)子、抑制子、轉(zhuǎn)座子等相互作用，使突變效應(yīng)呈不完全顯性等需進(jìn)一步確定；其次，新發(fā)現(xiàn)的突變基因仍需進(jìn)一步功能研究以確定其與CP的關(guān)聯(lián)和具體致病機(jī)制；最后，不同的致病機(jī)制存在相互作用的可能，以及基因與環(huán)境因素如何發(fā)生交互作用有待進(jìn)一步闡明。因此，未來仍有必要從遺傳學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)等多角度對(duì)CP致病機(jī)制進(jìn)行深入研究，并對(duì)突變的臨床意義進(jìn)行分類分型，為更好地精準(zhǔn)診治CP提供基礎(chǔ)理論支持。

利益沖突所有作者聲明無利益沖突