干細(xì)胞來源的外泌體對(duì)骨形成作用的研究進(jìn)展

李云飛，施潔珺，周 益

（浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院/浙江大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院/浙江省口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心/浙江省口腔生物醫(yī)學(xué)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/浙江大學(xué)癌癥研究院,浙江 杭州，310006）

在臨床中，即使是最常見的骨折，缺乏有效充分的骨形成也可能導(dǎo)致不良預(yù)后。據(jù)研究報(bào)道，2%到10%的骨折可能由于骨生長(zhǎng)不足而發(fā)生骨不連[1]。醫(yī)療美容中往往會(huì)遇到骨缺損修復(fù)、骨軟骨愈合等問題，而臨床修復(fù)超過臨界大小的骨缺損仍然是個(gè)較大挑戰(zhàn)，面臨著遲愈合或不愈合的風(fēng)險(xiǎn)[2]。同時(shí)人口老齡化加劇了這種情況。衰老不僅會(huì)由于骨密度降低而導(dǎo)致較高的骨折風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)也會(huì)降低機(jī)體骨形成的能力[3]。因此，如何有效修復(fù)骨質(zhì)缺損、促進(jìn)骨形成仍然是臨床醫(yī)生面臨的主要挑戰(zhàn)。臨床上廣泛使用自體和異體骨移植來促進(jìn)骨形成。自體骨移植物采用自體松質(zhì)骨、皮質(zhì)骨或骨髓抽取物，被認(rèn)為是治療骨折、延遲愈合、防治骨不連的金標(biāo)準(zhǔn)手段[4]。但是，自體骨移植有著較多并發(fā)癥如供骨區(qū)域感染、出血，移植部位的感染、骨吸收等[5]。有研究表明約20%–30%的接受自體骨移植的患者移植骨吸收現(xiàn)象明顯，在移植部位出現(xiàn)再次缺損[6]。此外，自體骨移植往往不能為具有較大缺損的患者提供足夠的移植骨量[7]。而同種異體骨移植后，超過30%的患者出現(xiàn)并發(fā)癥，包括免疫反應(yīng)、異體骨骨折，骨不連和感染[8,9]，從而導(dǎo)致骨形成量不足，修復(fù)效果不佳。

目前生物材料和細(xì)胞療法是促進(jìn)骨形成的主要研究領(lǐng)域。但是，兩種治療方法都有各自的缺點(diǎn)。生物材料的潛在毒性和免疫原性可能導(dǎo)致嚴(yán)重的并發(fā)癥，而細(xì)胞療法可能導(dǎo)致腫瘤和栓塞的形成[10]。而如今，具有較低安全顧慮和較好促進(jìn)成骨能力的外泌體，為研究人員提供了一種刺激骨形成的新思路。

1 外泌體的概念

大多數(shù)真核細(xì)胞都會(huì)分泌與細(xì)胞間通訊相關(guān)的細(xì)胞外囊泡。這些高度異質(zhì)的膜封閉結(jié)構(gòu)可能對(duì)鄰近和遠(yuǎn)處的細(xì)胞都有影響。細(xì)胞外囊泡可分為三個(gè)類型，分別是凋亡小體，微泡和外泌體[11,12]。

細(xì)胞外囊泡根據(jù)其大小進(jìn)行分類，其中直徑約為30-150nm的細(xì)胞外囊泡群體被稱為“外泌體”[13,14]。它們能在大多數(shù)體液中被提?。ɡ纾貉?，乳汁，唾液，精液，尿液），并且?guī)缀跄軓乃胁溉閯?dòng)物細(xì)胞類型中純化獲得（例如：內(nèi)皮細(xì)胞，神經(jīng)元細(xì)胞，肌肉細(xì)胞，干細(xì)胞等）[11,15,16]。這些具有生物活性的外泌體含有脂質(zhì)，蛋白質(zhì)，以及具有功能活性的核糖核酸（如：mRNA，miRNA）。現(xiàn)有的研究表明，上述這些物質(zhì)是細(xì)胞在多種生物學(xué)事件（如：細(xì)胞間通訊，蛋白質(zhì)和核酸的運(yùn)輸，腫瘤發(fā)生，代謝）中起作用的重要介質(zhì)，它們?cè)诓煌膊〉脑\斷和治療中也具有廣泛的應(yīng)用前景[16,17]。盡管外泌體具體如何參與細(xì)胞間通訊尚未有深入研究。但有研究表明，外泌體參與細(xì)胞間通訊的機(jī)制涉及受體-配體相互作用[18,19]。

2 外泌體的分離和鑒定

為了從各種體液或培養(yǎng)細(xì)胞的上清液中分離出外泌體，已經(jīng)研發(fā)了幾種分離技術(shù)。這些分離技術(shù)利用了外泌體的某些特征，例如其大小，形狀，密度和表面蛋白，以使其純化分離。常被應(yīng)用的技術(shù)包括超速離心，超濾，聚合物沉淀，親和色譜法等[20-23]。

其中超速離心是用于外泌體提取的最廣泛使用的分離技術(shù)，被認(rèn)為是外泌體提取的“金標(biāo)準(zhǔn)”[24]。超速離心根據(jù)其大小和密度差異將外泌體與其他組分分離。包括：1、低速旋轉(zhuǎn)（300–500 RCF）以除去細(xì)胞和凋亡碎片;2、高速旋轉(zhuǎn)（1000–20000 RCF）以消除較大的囊泡;3、超速離心（100000–150000 RCF）分離外泌體。超速離心是一種基本不改變外泌體性質(zhì)的純物理提取方法，但是這種分離技術(shù)存在需要的儀器較為精密復(fù)雜、耗時(shí)較長(zhǎng)、提取量有限等缺點(diǎn)[25,26]。為了提高獲得外泌體純度并減少離心時(shí)間，可以在最后一步后進(jìn)行額外的純化，例如蔗糖梯度離心[27]。

聚合物沉淀是一種有效、可靠，能夠替代耗時(shí)較多的超速離心的方法[28]。通過調(diào)節(jié)外泌體的溶解度和分布，它們可以從體液中沉淀出來。目前，幾種外泌體提取試劑盒（例如ExoQuick試劑盒，總外泌體分離試劑盒等）已被研發(fā)，其使用不含水的聚合物（例如聚乙二醇）結(jié)合水分子，使溶液中不易溶解外泌體顆粒沉淀從而以較少的時(shí)間獲得可觀量的外泌體，能夠做到簡(jiǎn)單可靠地提取外泌體[28,29]。

在提取到外泌體之后，需要對(duì)其做鑒定，通?？梢曰谀遗輸?shù)量，表面生物標(biāo)志物，大小，電勢(shì)等，通過蛋白質(zhì)印跡，PCR等手段來鑒定提取的外泌體，同時(shí)透射電子顯微鏡（TEM）、掃描電子顯微鏡（SEM）和納米粒子跟蹤分析（NTA）也是外泌體鑒定手段之一[30]。但是當(dāng)使用TEM和SEM檢測(cè)外泌體時(shí)，對(duì)樣品的脫水可能會(huì)導(dǎo)致外泌體的形態(tài)變化，是其應(yīng)用的主要限制[31]。

3 干細(xì)胞來源的外泌體在骨形成方面的作用

在過去的幾年中，外泌體在骨組織修復(fù)和再生領(lǐng)域受到了廣泛的關(guān)注，許多研究表明，與骨相關(guān)的細(xì)胞，如破骨細(xì)胞，成骨細(xì)胞，骨細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，也釋放外泌體[32]。通過將生物活性分子轉(zhuǎn)移至靶細(xì)胞，有利于破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的分化。外泌體特別是干細(xì)胞來源的外泌體單獨(dú)或結(jié)合載體使用，可有效恢復(fù)或促進(jìn)生物體骨形成能力[33,34]。

Qin 等人的研究發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）來源的外泌體上調(diào)成骨細(xì)胞中成骨基因ALP，OCN，OPN和RUNX2的表達(dá)，促進(jìn)成骨，并且這可能通過MAPK途徑介導(dǎo)[35]。Zhang等人的研究證明間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）來源的外泌體通過多方面機(jī)制啟動(dòng)骨缺損的快速修復(fù)和再生，該機(jī)制協(xié)調(diào)幾種細(xì)胞過程的調(diào)節(jié)，如遷移，增殖，基質(zhì)合成，巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)和細(xì)胞因子的產(chǎn)生等；同時(shí)MSC外泌體確實(shí)可以在一小時(shí)內(nèi)誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞中AKT和ERK的快速磷酸[36]。在一些特殊原因?qū)е碌墓琴|(zhì)缺損情況下，干細(xì)胞來源的外泌體也有較好的促進(jìn)骨形成作用，Liu等人發(fā)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）來源的外泌體可通過攜帶Fas蛋白進(jìn)入紅斑狼瘡（SLE）模型小鼠的BMSCs中，降低miR-29b的細(xì)胞內(nèi)水平，從而導(dǎo)致Dnmt1介導(dǎo)的Notch1啟動(dòng)子低甲基化的恢復(fù)，進(jìn)而改善SLE模型小鼠BMMSC功能，促進(jìn)成骨[37]。而對(duì)于骨質(zhì)疏松引起的骨缺損，（人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞）hiPSC-MSC來源的外泌體有效地刺激rBMSCs-OVX的增殖和成骨分化，其效果隨著外泌體濃度的增加而增加[38]。Nakao的研究表明，用疾病相關(guān)刺激對(duì)BMSCs進(jìn)行適當(dāng)?shù)念A(yù)處理可以優(yōu)化外泌體的含量，從而有效地支持特定疾病的修復(fù)[39,40]，如使用TNF-α處理的BMSCs來源外泌體可以更有效抑制骨吸收，促進(jìn)骨形成[39]。

生物材料與外泌體的結(jié)合能夠更好地發(fā)揮外泌體的促進(jìn)骨形成作用，與純磷酸三鈣支架相比，含有人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的間充質(zhì)干細(xì)胞（hiPS-MSC）來源的外泌體的磷酸三鈣支架具有更強(qiáng)的成骨作用，其可能通過激活PI3K/ Akt信號(hào)通路來增強(qiáng)hBMSCs的增殖、遷移和成骨分化[41]。hiPSC-MSC-Exosβ-TCP支架的應(yīng)用與卵巢切除大鼠模型中，可增強(qiáng)血管生成和骨生成進(jìn)而促進(jìn)了顱骨缺損中的骨再生[38]。也有研究表明，BMP2刺激的巨噬細(xì)胞分泌的外泌體可以調(diào)節(jié)BMSCs的成骨分化，而以鈦納米管作為載體運(yùn)輸外泌體能夠?qū)MSCs分化進(jìn)行時(shí)間調(diào)節(jié)，并可以招募多種細(xì)胞因子，誘導(dǎo)有利成骨環(huán)境[42]。外泌體不僅對(duì)骨缺損有促進(jìn)成骨作用，對(duì)于軟骨修復(fù)也有一定的促進(jìn)作用，外泌體處理的缺陷在12周后顯示軟骨和軟骨下骨已完全恢復(fù)，且具有表面規(guī)則的透明軟骨，與鄰近軟骨完全結(jié)合。相反，在對(duì)側(cè)PBS處理的缺陷中僅發(fā)現(xiàn)纖維修復(fù)組織[43]。

有研究表明，在外泌體發(fā)揮作用的過程中，其中的RNA成分可能扮演了重要角色[44]。Xu等人發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體包含miR-302b，miR-203，miR-218，miR-148a，miR-135b，miR-199b，miR-219，miR-299-5p，可能存在促進(jìn)成骨的作用[45]。Furuta等的研究表明在骨折愈合期間骨髓干細(xì)胞來源的外泌體表達(dá)mRNA和miRNA來促進(jìn)骨愈合；同時(shí)外泌體還可能分泌若干基因（miRNA-196A，miRNA-27A和miRNA-206）來增強(qiáng)成骨細(xì)胞增殖和分化[46]。此外，除了骨源性的外泌體之外，內(nèi)皮干細(xì)胞來源的外泌體注射至骨缺損部位，相對(duì)于對(duì)照組可以更有效修復(fù)骨缺損、促進(jìn)骨形成，并且在2-4周的骨重建過程中骨組織質(zhì)量獲得顯著改善[47]。

4 總結(jié)

過去的十年中，從外泌體的構(gòu)成、來源、功能、機(jī)制等多方面展開的各種研究增加了研究人員對(duì)外泌體的認(rèn)知，對(duì)于外泌體在骨形成方面的研究也取得了較大進(jìn)展，干細(xì)胞來源的外泌體在一定條件下可以通過多種信號(hào)分子和通路途徑促進(jìn)骨形成，促進(jìn)骨、軟骨缺損的修復(fù)和重建。但是外泌體發(fā)揮功能的成分較為復(fù)雜，功能不一，具體涉及的通路機(jī)制需要進(jìn)一步研究分析?？偟膩碚f，外泌體在骨穩(wěn)態(tài)中的強(qiáng)大功能為解決骨骼退行性變化疾病、促進(jìn)骨形成提供了新穎的方法，同時(shí)也需要進(jìn)一步的研究闡明相關(guān)機(jī)制以應(yīng)用臨床。