42℃熱療抑制U251細胞增殖并誘導(dǎo)凋亡*

吳聰英 周 翠 張 捷

（1）北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院，北京 101121；2）北京大學第一醫(yī)院，北京 100034）

艾灸是傳統(tǒng)中醫(yī)的常用治療方法。其借灸火的熱力給人體以溫熱性刺激，通過經(jīng)絡(luò)腧穴的作用，以達到溫通經(jīng)絡(luò)、調(diào)和氣血、扶正祛邪及防病保健的方法?！鹅`樞經(jīng)·官針》篇指出：“針所不為，灸之所宜”。隨著醫(yī)學的進步與科研技術(shù)的發(fā)展，艾灸對癌癥的治療作用也逐漸被揭示，如改善血液循環(huán)、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、抗炎、調(diào)節(jié)免疫功能和機體代謝、減輕化療毒副反應(yīng)，以及減少癌癥并發(fā)癥等［1］。所以有學者認為，艾灸的治療根本在于“扶正以抑瘤”。艾灸通過作用于人體氣血經(jīng)絡(luò)，扶助人體正氣，改善全身整體功能，從而達到祛病抑癌的目的［2］。但也有實驗證明，艾灸對癌細胞有直接的抑制和殺傷作用［3］，只是具體機制尚未得到闡明。

艾灸是一種綜合性的療法，其中首要的作用是熱療。在腫瘤學中，熱療是目前國際上認可的一種抑制癌癥的物理治療方法（高于37℃，一般為40~43℃）。作為放療和化療的輔助手段，熱療已經(jīng)被用于多種癌癥的治療，例如頭頸癌、乳腺癌、宮頸癌、肉瘤和黑素瘤［3］。在癌癥治療中使用熱療是很有吸引力的，因為作為一種物理療法，熱療的副作用比化療和放療少得多，而且它可以與這些療法結(jié)合使用。然而，由于熱療臨床抑癌效果的機制尚未得到明確，應(yīng)用受到了限制［4］。

本研究通過運用長時間的顯微縮時攝影技術(shù)、細胞計數(shù)以及凋亡標志物成像等細胞生物學技術(shù)研究42℃熱療對星形膠質(zhì)細胞瘤U251細胞系的作用，從而明確熱療對癌細胞增殖和凋亡的影響，以期從一個角度揭示艾灸治療癌癥的具體機制。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)和熱療處理

U251星形膠質(zhì)細胞癌細胞系購自武漢普諾賽生命科技有限公司（CL-0237，STR鑒定正確）。本研究的U251細胞在適宜的細胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)液的成分為：體積占比89%DMEM培養(yǎng)基（Thermo Fisher Scientific），體積占比10%胎牛血清（Gibco）和體積占比1%青霉素鏈霉素抗生素混合溶液（Gibco）。正常的培養(yǎng)條件為在細胞培養(yǎng)箱（Thermo Fisher Scientific）中以5% CO2和37℃以及95%以上濕度進行培養(yǎng)。熱療的培養(yǎng)條件為在細胞培養(yǎng)箱（Thermo Fisher Scientific）中以5%CO2和42℃以及95%以上濕度進行培養(yǎng)。

1.2 顯微縮時攝影

長時間的顯微縮時攝影是應(yīng)用Olympus CKX41倒置熒光顯微鏡對細胞形態(tài)進行記錄，用INU二氧化碳培養(yǎng)小室（TOKAI HIT）對細胞培養(yǎng)的溫度、濕度和CO2濃度進行控制。本研究的觀測熱療對U251細胞的培養(yǎng)條件為：5%CO2和42℃以及95%以上濕度。

1.3 細胞計數(shù)和統(tǒng)計方法

將U251細胞傳代于24孔板，對照組和熱療組分別在37℃和42℃培養(yǎng)3 d（72 h）后，輕柔吸盡培養(yǎng)液，每孔加入1 ml細胞消化液（0.25%胰酶-EDTA，Gibco），37℃消化10 min。吹打混勻后，取10ul與等體積的0.4%臺盼藍染色液（瑞沃德）進行混勻染色，然后取10 μl加入DS-50細胞計數(shù)板（瑞沃德），在C100自動細胞計數(shù)儀（瑞沃德）下計數(shù)，記錄全細胞數(shù)、活細胞數(shù)和死細胞數(shù)。用非配對t檢驗進行統(tǒng)計學分析。

1.4 核固縮觀測

將U251細胞傳代于激光共聚焦培養(yǎng)皿（Nest），對照組和熱療組分別在37℃和42℃培養(yǎng)2 d（48 h）后，加入1 ml 4%多聚甲醛細胞固定液（雷根）固定細胞，室溫固定10 min。然后加入用PBS溶液配制的2 mg/L Hoechst33342（Invitrogen H3570）細胞核染色液，染色5 min。在Olympus激光共聚焦顯微鏡（FLUOVIEW FV10i）下觀測。

1.5 細胞凋亡檢測

將U251細胞傳代于激光共聚焦培養(yǎng)皿（Nest），對照組和熱療組分別在37℃和42℃培養(yǎng)2 d（48 h）后，應(yīng)用Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒（C1062S，碧云天）經(jīng)染色。每孔的玻片 小 室 內(nèi) 加 入210 μl染 色 液（195 μl Annexin V-FITC結(jié)合液+5 μl Annexin V-FITC染色液+10 μl碘化丙啶（PI）染色液），室溫避光孵育20 min。在Olympus激光共聚焦顯微鏡（FLUOVIEW FV10i）下觀測。

1.6 活細胞Caspase-3活性檢測

將U251細胞傳代于激光共聚焦培養(yǎng)皿（Nest），對照組和熱療組分別在37℃和42℃培養(yǎng)2 d（48 h）后，應(yīng) 用 活 細 胞Caspase-3活 性 與Annexin V細胞凋亡檢測試劑盒（C1077S，碧云天）。每孔的玻片小室內(nèi)加入200 μl染色液（194 μl Annexin V-mCherry結(jié) 合 液+5 μl Annexin V-mCherry染色液+1 μl GreenNuc?Caspase-3染色液），室溫避光孵育20 min。在Olympus激光共聚焦顯微鏡（FLUOVIEW FV10i）下觀測。

2 實驗結(jié)果

2.1 熱療對U251細胞影響的動態(tài)觀察

為了細致觀測熱療對U251細胞的影響，進行長達108 h的動態(tài)觀察（圖1，視頻S1）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在第1天（24 h）內(nèi)，仍有一部分細胞進行了分裂增殖，說明在熱療初期并不能完全抑制細胞的增殖，在這一段時間內(nèi)大部分變圓的細胞是因為細胞分裂。然而在1 d后，就很少見到細胞分裂，變圓的細胞開始慢慢增多。隨著時間推移，細胞變圓的現(xiàn)象更加明顯，而變圓的細胞往往最后會死亡，而這種現(xiàn)象在48 h（第2天），變得比較明顯，后續(xù)將此事件節(jié)點作為檢測細胞凋亡的時間點。而在72 h（第3天），底層貼壁細胞變少變大，上層變圓和死亡的細胞明顯增多，后續(xù)將此時間節(jié)點作為細胞計數(shù)的時間點。

2.2 42℃熱療引起星形膠質(zhì)細胞瘤U251細胞的凋亡

2.2.142℃熱療引起星形膠質(zhì)細胞瘤U251細胞的核固縮

通過動態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，在42℃熱療處理2 d（48 h）后，細胞變圓和細胞死亡的現(xiàn)象變得比較明顯，首先觀測熱療對U251細胞胞核的影響。與對照組相比，有一部分42℃熱療的星形膠質(zhì)細胞瘤U251細胞（往往是變圓的細胞）的細胞核縮小、形態(tài)畸變、凝聚，即核固縮，提示其可能發(fā)生了凋亡（圖2）。

2.2.242℃熱療引起星形膠質(zhì)細胞瘤U251細胞的凋亡

因為觀察到熱療可以引起U251細胞核的核聚縮，用凋亡的標記物Annexin V來驗證熱療是否引起了細胞凋亡。42℃熱療處理U251細胞2 d（48 h）后，與對照組相比發(fā)現(xiàn)，凋亡的標志物Annexin V和細胞死亡的標志物PI陽性的細胞明顯增多。與此同時還發(fā)現(xiàn)，有一部分Annexin V陽性的細胞也同時是PI陽性，而且PI陽性的細胞則往往是Annexin V陽性的，提示這些PI陽性的細胞為凋亡后期失去細胞膜完整性的細胞（圖3）。此實驗證明了42℃熱療可以導(dǎo)致U251細胞的死亡，且細胞死亡以凋亡為主。

Fig.1 Hyperthermia affected the morphology of astroglioma U251 cells during 108 h

Fig.2 Hyperthermia affected the nuclear pyknosis of astroglioma U251 cells

2.2.3熱療通過Caspase途徑介導(dǎo)星形膠質(zhì)細胞瘤U251細胞凋亡

在確定熱療可以引起U251細胞凋亡后，進一步明確凋亡的類型。在42℃熱療處理U251細胞2 d（48 h）后，較對照組相比發(fā)現(xiàn)，收縮變圓的細胞往往顯示Caspase-3和Annexin V雙陽性（圖4），提示熱療引起的細胞凋亡是Caspase-3相關(guān)的細胞凋亡。

2.3 42℃熱療抑制星形膠質(zhì)細胞瘤U251細胞的增殖

通過動態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，在42℃熱療1 d后，U251細胞基本上處于不再增殖且不斷凋亡的狀態(tài)。在熱療3 d后進行細胞計數(shù)，評價熱療對U251細胞增殖的影響。發(fā)現(xiàn)無論是對于全細胞數(shù)還是活細胞數(shù)，42℃熱療組均明顯低于正常溫度（37℃）的對照組，且活細胞占比也明顯下降（圖5），這說明42℃熱療抑制了星形膠質(zhì)細胞瘤U251細胞的增殖。

Fig.3 Hyperthermia induced the apoptosis of astroglioma U251 cells

Fig.4 Hyperthermia might mediate apoptosis of glioma U251 cells via Caspase-3 pathway

Fig.5 Hyperthermia inhibited the proliferation of glioma U251 cells

3 討 論

現(xiàn)在癌癥的發(fā)病率越來越高，已成為人類最常見的死亡原因之一。2020年全世界有大約1 930萬癌癥病例，估計到2040年這一數(shù)字可能增加到2 840萬［5］。國家癌癥中心最新發(fā)布的《2022年全國癌癥報告》顯示，中國2016年惡性腫瘤新發(fā)病例約406.4萬人，死亡約241.4萬人。平均每天超過1萬人被確診為癌癥。與歷史數(shù)據(jù)相比，癌癥負擔呈持續(xù)上升態(tài)勢。目前，中國惡性腫瘤發(fā)病、死亡數(shù)持續(xù)上升，每年惡性腫瘤所致的醫(yī)療花費超過2 200億［6］?，F(xiàn)有癌癥的治療方法效果有限，手術(shù)治療及放療、化療仍是當今腫瘤治療的主流方法。但放療、化療產(chǎn)生的胃腸道反應(yīng)、免疫力低下等副作用嚴重影響腫瘤的治療及效果。近年來，艾灸療法作為中國傳統(tǒng)中醫(yī)的重要組成部分，艾灸對腫瘤患者的細胞免疫、體液免疫及放、化療后不良反應(yīng)的改善都有顯著療效，在緩解腫瘤患者的癌痛、胃腸道反應(yīng)、機體免疫力低下和癌因性疲乏等方面都有顯著療效［7］。

艾灸的第一個特點是熱。在18世紀，人們注意到發(fā)燒患者的腫瘤會縮小。從那時起，熱療作為一種潛在的癌癥治療方法被廣泛研究［8］。在20世紀70年代，體外和體內(nèi)研究表明，腫瘤細胞不能像健康細胞一樣耐受升高的溫度［9］。國內(nèi)外的多項研究表明，熱療的抑癌機制可能是多方面的，包括但不限于幫助克服耐藥性［10］、增加放療敏感性［11］、調(diào)節(jié)血流［12］和誘導(dǎo)細胞凋亡［13］。盡管許多研究表明，熱療在癌癥治療中具有積極作用，但這種方法仍存在爭議，其主要問題是缺乏熱療的精確腫瘤學定義并難以標準化［14］。而本研究在42℃下用顯微縮時攝影技術(shù)長時長觀測熱療對U251細胞的作用，為建立標準化的熱療抑癌范式提供了實驗證據(jù)。

熱療可以部分解釋艾灸的抑癌機制，然而這可能不是艾灸抑制癌癥的唯一原因。有學者認為，艾灸效應(yīng)的原理并不僅僅是溫熱效應(yīng)，而是由輻射、藥化、創(chuàng)傷及綜合等效應(yīng)的綜合作用結(jié)果［1］。也有學者認為，艾灸的作用機理是由艾條燃燒時所產(chǎn)生的物理和化學因子作用于腧穴，將刺激信號傳入中樞，經(jīng)過整合作用后傳出信號，調(diào)控機體神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)等，從而調(diào)整機體的內(nèi)環(huán)境，以達到防病治病的功效［15］。國內(nèi)的學者研究發(fā)現(xiàn)，艾灸能一定程度抑制胃荷瘤大鼠的瘤體增長，上調(diào)胃部瘤體內(nèi)HSP70 mRNA的表達，促進HSP70的生成及細胞外釋放，且艾灸相對于紅外線的作用更明顯［3］，艾灸的第二個特點是艾草燃燒產(chǎn)生很多揮發(fā)油性的物質(zhì)。這些物質(zhì)的分子質(zhì)量和親脂性可以讓它們比較容易地進入人體細胞中發(fā)揮作用。桉葉油素（1,8-cineole，Eucalyptol）是艾煙的主要成分［16］。本課題組的另外一項研究證實了1,8-cineole可以調(diào)節(jié)U251細胞內(nèi)的多條癌癥相關(guān)通路從而起到抑制細胞增殖的作用。以上研究均說明艾灸的抑癌作用是一個綜合作用，而并不僅僅是熱療作用。

癌癥目前來說是威脅人類健康的第一大疾病，且缺乏有效且安全的治療手段?，F(xiàn)階段西醫(yī)治療癌癥的放化療方法并不能有效控制癌癥的發(fā)展和提高病人的生存質(zhì)量。中醫(yī)有著悠久的歷史，在中國歷經(jīng)了幾千年的驗證和積累，形成了一整套有效的醫(yī)藥運用方法。艾灸是一種經(jīng)典的中醫(yī)治療手段，集合了物理療法和化學療法，對多種癌癥有抑制作用。本研究從熱療的角度揭示艾灸抑制癌癥細胞增殖的細胞機制，為臨床艾灸治療癌癥提供理論基礎(chǔ)，具有一定的理論意義和應(yīng)用價值。

4 結(jié) 論

通過以上結(jié)果看到熱療明顯抑制細胞的增殖，細胞死亡明顯增加。熱療處理后的U251細胞較對照組存在明顯的核固縮，標志物Annexin V和PI明顯升高，PI陽性細胞均呈Annexin V陽性，說明熱療導(dǎo)致的細胞死亡以細胞凋亡為主；大部分收縮變圓的細胞Caspase-3和Annexin V呈共同陽性，說明熱療可能通過Caspase途徑介導(dǎo)細胞凋亡。從而得出本研究結(jié)論：熱療可以抑制星形膠質(zhì)細胞癌細胞系U251細胞的增殖并誘導(dǎo)Caspase途徑相關(guān)的凋亡。

附件見本文網(wǎng)絡(luò)版（http://www.pibb.ac.cn或http://www.cnki.net）：

PIBB_20220458_Video S1.mp4